Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

والهدف من هذا البروتوكول إظهار وسيلة فعالة ديسيلولاريزي وديكالسيفي كوكليا الماوس للاستخدام السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة.

Abstract

في الثدييات، وخلايا الشعر ميتشانوسينسوري التي تيسر الاستماع الافتقار إلى القدرة على التجدد، التي حدت من العلاجات لفقدان السمع. استراتيجيات الطب التجديدي الحالية تركز على زرع الخلايا الجذعية أو التلاعب بالجينات المحيطة بدعم الخلايا في الإذن الداخلية لتشجيع استبدال التالف من الخلايا الجذعية لتصحيح السمع. ومع ذلك، المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد تلعب دوراً حيويا في حفز والحفاظ على وظيفة خلايا الشعر، ولم يجر التحقيق فيها جيدا. استخدام cochlear إدارة المحتوى في المؤسسة سقالة لزراعة الخلايا الجذعية البالغة قد يوفر رؤى فريدة من نوعها في كيفية تكوين والهندسة المعمارية للبيئة خارج الخلية الإيدز الخلايا في الحفاظ على وظيفة السمع. هنا نقدم طريقة لعزل وديسيلولاريزينج كوتشلياي من الفئران لاستخدامها بمثابة السقالات قبول perfused الخلايا الجذعية البالغة. في البروتوكول الحالي، كوتشلياي يتم عزل من الفئران euthanized، ديسيلولاريزيد، وديكالسيفيد. بعد ذلك، تم بعناية perfused جيلي الخلايا البشرية وارتون (هوجكس) التي كانت معزولة من الحبل السري في كل قوقعة الإذن. واستخدمت في كوتشلياي كالمفاعلات الحيوية، وتم استزراع الخلايا لمدة 30 يوما قبل أن يخضع لتحليل تجهيز. كوكليا ديسيلولاريزيد الاحتفاظ بهياكل خارج الخلية يمكن تحديدها، ولكن لم يكشف عن وجود خلايا أو ملاحظته شظايا من الحمض النووي. اجتاحت معظم الداخلية والخارجية للقوقعة الخلايا perfused إلى القوقعة ونمت دون وقوع أي حادث خلال مدة 30 يوما. وهكذا، يمكن استخدام الأسلوب الحالي لدراسة كيف cochlear التنمية الخلية يؤثر على المحتوى والسلوك.

Introduction

القوقعة بنية معقدة دوامة موجودة في العظم الصدغي. وهو يتألف متاهة عظمى خارجي و متاهة membranous متحدة المركز، والداخلية1. متاهة ميمبرانوس يتكون من ثلاثة ممنوع السوائل: فيستيبولي سكالا، سكالا وسائط الإعلام، و حبل سكالا1. دور وسائط الإعلام سكالا ظهارة الحسية، التي تتألف من العديد من أنواع الخلايا، ولكن خلايا الشعر الحسية (المفوض السامي)، الذي ترانسدوسي الطاقة الميكانيكية في الموجات الصوتية للنبضات العصبية2، تتسم بأهمية خاصة. التعرض للصدمات الصوتية3،،من45،6من الدواء والمرض7،8والشيخوخة9 كل ما يمكن أن يؤدي وظيفة السمع البصر عن طريق الإعدام المفوض السامي. فقدان خلايا الشعر في الثدييات دائمة، على عكس HCs إنفلونزا الطيور، التي يمكن تجديدها بعد إصابة10.

مجموعة متنوعة من الجهود البحثية المعاصرة سعت إلى استعادة HCs المفقودة، على الرغم من اختلاف النهج التجريبية المحددة. التلاعب بالجينات في ظهارة الحسية وزرع الخلايا الجذعية التي ميزت خارج الجسم هي النهج السائد في الميدان، على الرغم من أن قد تم طرق الاستقراء التي تسعى إلى التفريق بين الخلايا الجذعية في cochlear أورجانويدس حاول11،،من1213. كل من هذين النهجين أما يعتمد مباشرة على الخلايا الجذعية، أو العظة التنموية المستخدمة من قبل الخلايا الجذعية؛ بيد أن المشتركة ثانية، ويحتمل أن تكون حاسمة، هو عنصر إدارة المحتوى المؤسسي للقوقعة نفسها14،15.

إدارة المحتوى في المؤسسة لا يوفر الدعم المادي للخلايا والأنسجة، والتي تشمل سطح لالتصاق الخلايا وانتشار، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، ولكن أيضا تلعب أدواراً حاسمة في تطوير HCs ودوامه العقدة15،16 ،17. وبطبيعة الحال يوفر إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحدث إشارات الاستقرائية التي قد توجه تحديد النمط الظاهري الخلية و/أو خلية التصاق وانتشارها، وبقاء18. ونتيجة لذلك، استخدام القوقعة ديسيلولاريزيد في تركيبة مع هوجكس المستزرعة توفر فرصة فريدة لاستكشاف دور تجديد إدارة المحتوى في المؤسسة، والمفوض السامي. هوجكس هي نوع خلية متاحة بسهولة، وغير مثيرة للجدل المعزولة من حبل السرة البشرية التي تتصرف مثل الخلايا الجذعية الوسيطة19. وقد أظهرت هوجكس القدرة على التفريق بين أسفل الخلية الحسية الأنساب20،21. وهكذا، تفاصيل البروتوكول الحالي العزلة، وديسيلولاريزيشن، ونضح من كوكليا من جثث الماوس C57BL مع هوجكس للهندسة أنسجة الإذن الداخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات، بما في ذلك القتل الرحيم الحيوان، وفقا للموافق عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) البروتوكول (أكوب #2014-2234) في المركز الطبي جامعة كانساس (كومك).

ملاحظة: هوجكس كانت معزولة من الحبال السرة البشرية التي كانت تبرعت بها المرضى التي قدمت المستنيرة واستخدمت العينات وفقا للبروتوكولات التي أقرتها اللجنة مواضيع البشرية جامعة كانساس (15402 # كو-مجلس الهجرة واللاجئين).

1-العظم الصدغي الحصاد والعزلة القوقعة

  1. قطع رأس ماوس euthanized على نحو ملائم، وعمرها 15 عاماً في الأسبوع بالقطع بين الجمجمة وأول فقرة عنق الرحم مع زوج حادة من مقص الجراحة، ثم رش أسفل الرأس مع الإيثانول 70% لتطهير (الشكل 1A).
  2. تقسم الجمجمة في طائرة منتصف السهمي استخدام نفس زوج حادة مقص جراحي (الشكل 1B-ج، خطوط متقطعة).
  3. إزالة أنسجة المخ من الجمجمة باستخدام زوج من الملقط (الشكل 1، رأس السهم).
  4. تحديد العظم الصدغي من خلال وجود السمع وجذور الأعصاب دهليزي (الشكل 1E-F، رؤوس الأسهم) في داخل الجمجمة وقناة الإذن من الخارج (الشكل 1F، السهم). قص بعناية من خلال الجمجمة لعزل العظم الصدغي من الجزء المتبقي الجمجمة (الشكل 1).
    ملاحظة: في بعض الحالات، قد يكون ممكناً دقة نقب عظام الجمجمة بعيداً عن العظم الصدغي المحيطة بها دون الحاجة إلى قطع.
  5. إدراج الملقط غرامة في فتح قناة الإذن حوالي 5 ملم (الشكل 1 ح)، حيث لا خطر النصائح ثقب القوقعة. كسر برفق فتح العظام الفقاعة (الشكل 1 ح، أعلى المنطقة المظللة بالأحمر) حيث أنها كسور (الرقم 1I، أحمر منقط الخط).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، مجهر تشريح يمكن أن تساعد في هذه العملية لضمان وضع دقيق والتلاعب بالصكوك.
  6. استخدام الملقط غرامة، حدق بعيداً ما تبقى الفقاعة من العظم الصدغي، فضح متاهة عظمى من القوقعة (1J الشكل، الأقواس الحمراء).
  7. ضع طبق بتري كبير بما فيه الكفاية لاحتواء العظم الصدغي (مثلاً، 30 ملم أو أكبر) تحت تشريح نطاق مجال الرؤية وملئه بما يكفي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتغطية العظم الصدغي (مثلاً، مل 0.5 إلى 1).
  8. غمر العظم الصدغي مع الفقاعة إزالة في برنامج تلفزيوني مع نوافذ بيضاوية وجولة القوقعة مواجهة.
    ملاحظة: إزالة النظام الدهليزية من القوقعة ليس من الضروري، كما النظام الدهليزية يخدم أيضا كمؤشر للتلاعب وتوجيه ملامح القوقعة (الرقم 1I و الشكل 2).
  9. استخدام زوج جيد جداً من الملقط، إزالة الشريان ستابيديال، الذي يمر stapes.
  10. إدراج تلميح واحد من الملقط غرامة فائقة من خلال قوس stapes حيث مرت الشريان، ودقة رفع stapes إلى أعلى. وينبغي رفع stapes ديسارتيكولاتيد الخروج من الإطار البيضاوي.
  11. استخدام تلميح واحد من الملقط غرامة فائقة، الثقب البيضاوي وجولة windows.
  12. استخدام برنامج تلفزيوني س 1 ملء محقنة قياس 28.5 مع أنابيب (القطر الداخلي 0.28 ملم، القطر الخارجي مم 0.61) المرفقة، ضع الأنبوب فوق الإطار البيضاوي (الشكل 2A -ب).
    ملاحظة: فتح الأنبوب يمكن التلاعب بها باستخدام الملقط غرامة فائقة مما يساعد على ضمان وضع دقيق.
    1. استخدام المحاقن الطازجة وأنابيب لكل قوقعة الإذن.
  13. نتخلل 2 مل 10% مضاد حيوي فطري (المضادة مكافحة) و 10% البنسلين-ستربتوميسين (القلم-بكتيريا) في برنامج تلفزيوني عن طريق القوقعة ما يزيد على 5 دقائق لإزالة في perilymph. بيرفوسينج سريع جداً مع الكثير من الضغوط ستؤدي إلى الأضرار الهياكل الدقيقة داخل القوقعة.
    ملاحظة: يدوياً القيادة المحاقن باليد نتخلل السوائل عن طريق القوقعة فعالة، على الرغم من أن مضخة التروية يمكن أن تستخدم كبديل لذلك.
    1. إذا بيرفوسينج يدوياً، استخدام زوج من الغرامة، ذاتية الإغلاق الملقط على استقرار القوقعة (الشكل 2A) أثناء التروية باستيعاب الجزء الدهليزية من العظم الصدغي.
      ملاحظة: على الرغم من أن ليس مطلوباً، وهذا يترك كلتا يديه مجاناً للتعامل مع الصكوك؛ جهة يمكن أن تدفع المحاقن (الشكل 2A) بينما أخرى يمكن وضع الأنابيب على النحو المناسب (الشكل 2).
    2. من هذه الخطوة إلى الأمام، والحرص على تجنب تعريض القوقعة دون داع إلى الهواء. إدخال فقاعات الهواء في المسافات السوائل بحظر تداول السوائل، وسيضر تجفيف المزيد الهياكل الدقيقة داخل القوقعة.
  14. إزالة وتجاهل أي المتبقية العضلات العظام والأنسجة الأجزاء باستخدام الملقط غرامة.
  15. إذا لزم الأمر، تخزين كوكليا معزولة في 4 درجات مئوية في مكافحة المضادة نسبة 10% والحل القلم-بكتيريا 10% في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى سبعة أيام مع التغييرات العادية في حل المضادات الحيوية كل 48 ساعة.

2-cochlear التجهيز

  1. ديسيلولاريزيشن
    1. لكل القوقعة، كبريتات ملء قنينة زجاج 20 مل التﻷلؤ مع دوديسيل صوديوم 1% (SDS) الحل في إزالة المتأين (DI) المياه، الذي يستخدم في ديسيلولاريزي القوقعة.
    2. قص غيض قبالة ماصة بلاستيك 7 مل نقل استخدام شفرة حلاقة حتى لا يكون كبيرا بما يكفي لقوقعة الإذن المرور من خلال فتح.
    3. استخدام ماصة نقل، برفق وضع القوقعة إلى ماصة حيث يمر فقط على حافة وقف إنتاج المواد الانشطارية قبل بضعة ملليمترات.
    4. طرد القوقعة إلى القنينة التﻷلؤ مملوءة بحل الحزب الديمقراطي الصربي 1%.
    5. تعميم 2 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 1% في الماء (دي) دي المتأين عن طريق القوقعة في القنينة التﻷلؤ استخدام ماصة نقل.
    6. ضع القنينة التﻷلؤ في دوار، وتسمح القنينة التﻷلؤ لتدوير 10 لفة في الدقيقة ح 72 في درجة حرارة الغرفة.
      1. تغيير حل الحزب الديمقراطي الصربي 1% كل 24 ساعة على مدى فترة ح 72. العناية عند تغيير الحزب الديمقراطي الصربي لفضح القوقعة للهواء ابدأ.
    7. أغسل القوقعة ثلاث مرات عن 30 دقيقة مع المياه دي.
أداء يغسل في نفس القنينة التﻷلؤ المستخدمة لرسوم مخزونات النشر الاستراتيجي؛ وفي هذه المرحلة، هو ديسيلولاريزيد القوقعة.
  • ديكالسيفيكيشن
    1. إزالة المياه دي المتبقية من القنينة التﻷلؤ، وترك ما يكفي لإبقاء القوقعة المغمورة.
    2. لبدء ديكالسيفيكيشن، إضافة 5 مل حمض الإيثيلين 10% (يدتا) (0.02 M) في المياه دي التﻷلؤ القنينة التي تحتوي على القوقعة.
    3. تعميم 2 مل يدتا 10% في المياه دي عن طريق القوقعة في القنينة التﻷلؤ باستخدام ماصة نقل.
    4. مكان القنينة التﻷلؤ في محور دوار، والسماح للقنينة التﻷلؤ لتدوير 10 لفة في الدقيقة ح 72 في درجة حرارة الغرفة. تغيير الحل يدتا 10% كل 24 ساعة على مدى فترة ح 72. العناية عند تغيير الحلول حيث أن القوقعة لا يتعرض للهواء.
    5. شطف القوقعة 3 مرات ل 2 ح مع برنامج تلفزيوني 1 x؛ وفي هذه المرحلة، هو ديكالسيفيد القوقعة.
  • تخزين
    1. تخزين كوتشلياي ليصل إلى 72 ساعة في 10% مكافحة المضادة، 10% بكتيريا قلم حلاً في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قد تكون أطول من فترات التخزين ممكن مع التغييرات العادية في حل المضادات الحيوية؛ ومع ذلك، لا تم التحقق من تخزين ممتدة من كوكليا المجهزة في هذا البروتوكول.

    • 3-المشتريات وتوسيع هوجكس

    1. عزل هوجكس وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا22. بإيجاز، الجزء السري الحبال إلى أقسام 3 سم.
    2. بعناية تجعل الطول شق ضحلة مع مشرط على كل قطعة من الحبل السري لإلغاء وفضح جيلي وارتون الحبل السري. استخدام الملقط لإزالة الأوعية الدموية.
    3. تغسل شرائح الحبل السري مرتين مع برنامج تلفزيوني كافية (مثلاً، 40 مل في 60 مم طبق بيتري) إلى غمر الأنسجة. فرم ناعما شرائح الأنسجة مع مشرط. هضم الأنسجة في 100 مم طبق بيتري مع 50 مل متوسطة الهضم (كولاجيناز نوع 2 0.2 ٪، 1 ٪ البنسلين والستربتوميسين، في انخفاض الجلوكوز المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو)).
    4. وضع الأنسجة في هضم المتوسطة في شاكر مداري 50 لفة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 5% CO2، حاضنة 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي تضعف الهضم المتوسطة بنسبة 01:16 في المائة 2 مضاد حيوي فطري في برنامج تلفزيوني، وبيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في ز 500 x في درجة حرارة الغرفة (~ 27 درجة مئوية) للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية.
    5. ريسوسبيند الكريات في متوسط نمو الخلايا الجذعية الوسيطة (مسكجم) وإعادة تجميع الخلايا. تعامل الخلايا لوحة في كثافة 7 × 103 خلايا/سم2 في زراعة الأنسجة قوارير T-75. الثقافة هوجكس في مسكجم، وتوسيع لمرور 5 للتجارب.
      ملاحظة: هوجكس قد تكون شبه مثقف في قوارير تي أكبر (مثلاً، T-150، T-300) عند باساجينج لزيادة غلة هوجكس للتجارب.

    4-ضخ هوجكس في "كوتشلياي ديسيلولاريزيد"

    1. إعداد كوتشلياي ديسيلولاريزيد
      1. باستخدام تقنية معقمة، أغسل كوتشلياي المخزنة في برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات لكل 30 دقيقة.
      2. نقل كوتشلياي إلى آبار منفصلة من صفيحة 24-جيدا، وإضافة 1 مل من 37 درجة مئوية قبل استعد مسكجم.
      3. احتضان كوتشلياي في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة للحد ني ح 1 قبل ضخ للخلايا.
    2. فصل هوجكس وريسوسبيند
      1. أغسل هوجكس مع 37 درجة مئوية قبل استعد 1 x PBS مرتين.
      2. إضافة ما يكفي 37 درجة مئوية قبل استعد التربسين مع يدتا 0.5% لتغطية سطح السفينة الخلية.
      3. احتضان هوجكس لمدة تصل إلى 5 دقائق في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة.
        1. تحقق من أن فصل 90% خلايا من سطح الثقافة الخلية عن طريق عرض الخلايا تحت مجهر مقلوب.
          ملاحظة: فصل الخلايا التي تتحرك عندما يتم استغلالها السفينة الثقافة بلطف،. وقد فصل الخلايا التي تظل ثابتة، لا.
        2. اضغط برفق جانبي قارورة كذلك إزاحة الخلايا المرفقة.
      4. باستخدام تقنية معقمة، هوجكس نقل من سفينة الثقافة إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على وحدة تخزين ما يعادل من مسكجم لحجم التربسين المستخدمة لفصل الخلايا.
      5. بيليه هوجكس طريق سينتريفوجينج في 500 غرام x في درجة حرارة الغرفة (~ 27 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
      6. نضح المادة طافية، وريسوسبيند هوجكس في مسكجم بتركيز 500,000 خلايا/مل.
    3. نتخلل كوتشلياي
      1. نقل كوتشلياي إلى لوحة 24-بئر جديدة باستخدام ماصة نقل.
      2. إضافة قطره مسكجم لكل قوقعة الإذن لمنع أي القوقعة من الجفاف.
      3. دقة توجيه القوقعة استخدام الملقط غرامة فائقة بحيث تواجه النوافذ البيضاوي وجولة.
        ملاحظة: اتخاذ الحذر الشديد عند التعامل مع كل القوقعة مباشرة كما هو تلف القوقعة بسهولة.
      4. استخدام المحاقن معقمة 28.5-قياس الأنسولين مع أنابيب متصلة، رسم يصل 0.2 مل حراكه هوجكس (100,000 الخلايا).
      5. استخدام الملقط المعقم غرامة، ضع أنابيب الإطار البيضاوي.
      6. دقة وبطء نتخلل القوقعة مع 0.2 مل من حراكه هوجكس استخدام حقنه الأنسولين 28.5-قياس متصلة بأنابيب البولي إيثيلين (القطر الخارجي: 0.61 ملم، و "قطرها الداخلي": 0.28 ملم) على مدى ما يقرب من 5 دقائق.
      7. بعد نضح، إضافة 0.8 مل 37 درجة مئوية قبل استعد مسكجم تتضمن أيضا القوقعة لتحقيق الحجم الإجمالي في البئر إلى 1 مل.
      8. كرر الخطوات 4.3.3-4.3.7 لكل القوقعة، استخدام المحاقن طازجة والأنابيب في كل مرة.
      9. مكان perfused كوتشلياي في 5% CO2, 37 درجة مئوية خلية ثقافة حاضنة، وتغيير وسائل الإعلام ثلاث مرات في الأسبوع.

    5-القوقعة الحصاد والحفاظ عليها

    ملاحظة: كوتشلياي قد يكون مثقف وتحصد في أي وقت تصل إلى 30 يوما بعد انتهاء التروية.

    1. للحفاظ على كوتشلياي، إصلاح في بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز.
    2. بعد التثبيت، يغسل كوكليا مع برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
    3. تدريجيا يذوي القوقعة مع الإيثانول وواضحة مع المذيبات هيدروكربونية الاليفاتيه قبل تضمينها في البارافين.
    4. قسم العينات بسمك 10 ميكرون باستخدام مبضع وجبل على الزجاج شرائح المجهر.
      ملاحظة: نماذج جاهزة الآن لغذائها أو تجهيز المناعي باستخدام البروتوكولات القياسية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    باستخدام الأساليب المعروضة هنا، قيمت ديسيلولاريزيشن ناجحة من كوكليا قبل دراسة وجود أو غياب الحمض النووي عن طريق 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تلطيخ. واعتبرت كوكليا ديسيلولاريزيد تماما إذا لم يتم تحديد هوية الحمض النووي داخل القوقعة ديسيلولاريزيد. القوقعة أصلية من تجربة سابقة والتي لم تطرأ ديسيلولاريزيشن أو ديكالسيفيكيشن كعنصر إيجابي لتوضيح الهياكل والخلايا الموجودة تقليديا في القوقعة ماوس C57BL. القوقعة ديسيلولاريزيد-ديكالسيفيد، الذي لم يكن لديه أي هوجكس غرست، استخدمت كعنصر سلبي. ولوحظت لا نواة الخلية DAPI الملون قابلة للقياس في أي منطقة من قسم الأنسجة (الشكل 3). كوتشلياي هما ديسيلولاريزيد وديكالسيفيد، ويملؤه ثم هوجكس للمشروع الحالي. كوتشلياي ديسيلولاريزيد-ديكالسيفيد التي كانت perfused مع هوجكس لوحظت لدى DAPI عديدة الملون الأنوية داخل القوقعة والمتزايد على شل عظمى خارج القوقعة (الجدول 1). يقدر إجمالي كثافة الخلية للخلية التي غرست القوقعة الأولى كانت 113,759 الخلايا/القوقعة بعد 30 يوما من الثقافة (الشكل 4 و الشكل 5) والقوقعة الثانية كانت 118,732 الخلايا/القوقعة بعد 30 يوما ثقافة (الشكل 6 و الشكل 7). تشمل هذه التقديرات كثافة الخلية حبل سكالا، سكالا وسائط الإعلام، ودهليز سكالا، ووحدات التخزين من الهياكل التي وجدت داخل المسافات السوائل الثلاثة، ولكن هذه التقديرات استبعاد أي من متاهة عظمى المتبقية. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت عينات من كل القوقعة ملطخة الهيماتوكسيلين وويوزين (ح & ه) لإظهار وجود خلايا والميزات التشريحية داخل كل القوقعة (الشكل 8). التشريح الإجمالي المجهرية cochlear لم يتغير أساسا طوال جميع أقسام الملون؛ بيد أن أي خلايا لم يمكن تحديدها في المقطع ديسيلولاريزيد-ديكالسيفيد (8B الشكل). وكان تحديد نواة خلية مختلفة إلى حد كبير بين القوقعة الأصلية (الشكل 8 أ) وفي ديسيلولاريزيد-ديكالسيفيد كوكليا يملؤه الخلايا (الشكل 8–د).

    Figure 1
    رقم 1: الماوس العزلة العظم الصدغي. بمجرد قد تم euthanized الماوس على النحو المناسب، قطع رأس الحيوان بقطع بين قاعدة الجمجمة وأول فقرة سرطان عنق الرحم، ورذاذ الرأس مع الإيثانول لتطهير (A). تقسم الجمجمة في طائرة السهمي من الفرع (ب–ج) استخدام زوج حادة مقص جراحي، قطع من خلال كل من أنسجة المخ والعظام. الماوس منطقتي الرأس (د، الفك السفلي إزالتها للعمل التجريبي لا علاقة لها) ثم يجب أن يكون لديك أنسجة المخ إزالتها لكشف العظم الصدغي. العظة الثقب اثنين من خلالها تمرير السمع والأعصاب دهليزي (رؤوس الأسهمالإلكترونية، أحمر) مفيدة لتحديد نجاح العظم الصدغي. إزالة اللحم من الجمجمة (F). قناة الإذن الخارجية (و، السهم، واللوحة العلوية) يوفر أحد الرموز خارجية مفيدة كذلك. تقليم بعناية بعيداً العظام الزائدة، وترك فقط العظم الصدغي معزولة (ز). الفقاعة (ح، أعلى اللوحة، المنطقة الحمراء المميزة) يجب ثم دقة إزالة استخدام الملقط غرامة (ح, الفريق أقل). الفقاعة العظام رقيقة، ويمكن سهولة متكسرة بعيداً (أنا) حتى متاهة عظمى من القوقعة كشف (بين قوسيني، أحمر). هي أشرطة مقياس على جميع الصور 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    رقم 2: نضح Cochlear. متى العظم الصدغي وقد تم عزلها وتم إزالة الفقاعة، القوقعة يمكن ثم إعداد التروية في مجهر. عندما بيرفوسينج باستخدام المحاقن يدوياً مدفوعة بأنابيب المرفقة (، خط منقط) قد يكون من المفيد لتحقيق الاستقرار في قوقعة الإذن باستخدام زوج من الملقط الإغلاق الذاتي. بلطف إرفاقه الملقط الجزء الدهليزية من العظم الصدغي (ب) وبقية الملقط ضد الشفة طبق بتري (A). وهذا يترك كلتا يديه مجاناً التعامل مع الصكوك أثناء التروية. ثم معالجة ناحية المحاقن، التحكم في معدل تدفق السائل، بينما اليد الأخرى يمكن ضع الأنبوب الإطار البيضاوي باستخدام زوج ثاني من الملقط (ب). قطع حرة نهاية الأنبوب بزاوية يسمح لتحديد المواقع أكثر سهولة، مما يسمح الأنبوب لوضعها بشكل صحيح دون عرقلة في مجال الرؤية. هو شريط مقياس 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3: قسم الأنسجة من القوقعة الماوس ديسيلولاريزيد. واستخدمت مجهر فلوري epi تستقيم للصور عينات في بير 200 X (10 X العدسة و 20 X الهدف). الصور كانت مخيط معا لإنشاء مونتاج 4 × 5 تقريبا. ويرد DAPI النووية تلطيخ تبين عدم وجود خلايا في الفريق استخدام DAPI عامل تصفية مجموعة مشتركة (350 نانومتر الإثارة، 470 نانومتر الانبعاث)، وتعريض، صورة درجات الرمادي أوتوفلوريسسينسي استخدام مرشح مشترك fluorescein isothiocyanate (فيتك) مجموعة (490 نانومتر الإثارة، 525 نانومتر الانبعاث)، التي تنص على المعالم التشريحية، يظهر في لوحة ب. عدد خلايا الآلي أجريت في ثلاث مناطق من الفائدة، التي هي محددة في كلا الفريقين A و B. تم حساب عدد خلايا مجموع المقطع كامل الأنسجة (1، خط بيضاء صلبة) والقوقعة (2، خط متقطع). واستخدمت هذه الأرقام اثنين لحساب عدد الخلايا في الهياكل العظمية خارج القوقعة ولكن داخل حواف الخارجي، عظمى قسم الأنسجة (3، المسافة بين الخط المنقط وخط متقطع). أشرطة مقياس على جميع الصور هي 500 ميكرومتر.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Figure 4
    الشكل 4: قسم موديولار بقرب من الماوس ديسيلولاريزيد القوقعة 1 يملؤه هوجكس. DAPI تلطيخ النووية يظهر في لوحة أ مضافين إلى أوتوفلوريسسينسي رمادي زائدة، من قناة الأخضر، الذي يوفر المعالم التشريحية. الآلي خلية التهم أجريت في ثلاث مناطق من الفائدة، التي هي محددة في الفريق A. تم حساب عدد خلايا مجموع المقطع كامل الأنسجة (1، خط بيضاء صلبة) والقوقعة (2، خط متقطع). واستخدمت هذه الأرقام اثنين لحساب عدد الخلايا في الهياكل العظمية خارج القوقعة ولكن داخل حواف الخارجي، عظمى قسم الأنسجة (3، المسافة بين الخط المنقط وخط متقطع). تلوين DAPI معزولة يظهر في لوحة ب، وعتبة DAPI تلطيخ المستخدمة أثناء القياس الكمي الآلي يظهر في لوحة ج. أشرطة مقياس على جميع الصور هي 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 5
    الرقم 5: عرض التكبير عالية من قسم موديولار بالقرب من الماوس ديسيلولاريزيد القوقعة 1 يملؤه هوجكس. DAPI تلطيخ النووية يظهر في لوحة أ مضافين إلى صورة درجات رمادي زائدة، أوتوفلوريسسينسي من قناة الأخضر، الذي يوفر المعالم التشريحية. تلوين DAPI معزولة يظهر في لوحة ب، والصورة العتبة المستخدمة أثناء العد الآلي خلية يظهر في لوحة ج. ممنوع السوائل والمجهرية الدقيقة داخل القوقعة يتم الاحتفاظ بشكل جيد أثناء ديسيلولاريزيشن وخلية ثقافة مراحل التجربة. سكالا فيستيبولي (SV)، حبل سكالا (SM)، الغشاء باسيلار (بي أم)، Tectorial Membrane (TM)، دوامة ليمبوس (L) وقناة (اتفاقية روتردام) روزنتال، موديولوس (M)، ودوامه الرباط (SL) وفاسكولاريس ستريا (*). غشاء ريسنير لكان لم بوضوح في مقاطع الأنسجة، ونتيجة لوسائل الإعلام سكالا كانت غير محددة بوضوح. أشرطة مقياس على جميع الصور هي 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 6
    رقم 6: قسم موديولار بقرب من القوقعة الماوس ديسيلولاريزيد 2 الذي كان يملؤه هوجكس. DAPI تلطيخ النووية يظهر في لوحة أ، مضافين إلى تدرج الرمادي أوتوفلوريسسينسي من قناة الأخضر، الذي يوفر المعالم التشريحية. الآلي خلية التهم أجريت في ثلاث مناطق من الفائدة، التي هي محددة في الفريق A. تم حساب عدد خلايا مجموع المقطع كامل الأنسجة (1، خط بيضاء صلبة) والقوقعة (2، خط متقطع). واستخدمت هذه الأرقام اثنين لحساب عدد الخلايا في الهياكل العظمية خارج القوقعة ولكن داخل حواف الخارجي، عظمى قسم الأنسجة (3، مسافة بين خط منقط وخطوط متقطعة). تلوين DAPI معزولة يظهر في لوحة ب، وعتبة DAPI تلطيخ المستخدمة أثناء القياس الكمي الآلي يظهر في لوحة ج. أشرطة مقياس على جميع الصور هي 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 7
    رقم 7: عرض التكبير عالية من قسم موديولار بالقرب من القوقعة الماوس ديسيلولاريزيد 2 الذي كان يملؤه هوجكس. DAPI تلطيخ النووية يظهر في لوحة أ، مضافين إلى تدرج الرمادي أوتوفلوريسسينسي من قناة الأخضر، الذي يوفر المعالم التشريحية. تلوين DAPI معزولة يظهر في لوحة ب، والصورة العتبة المستخدمة أثناء العد الآلي خلية يظهر في لوحة ج. يتم الاحتفاظ المسافات السوائل والمجهرية الدقيقة داخل cochlear خلال مراحل الثقافة ديسيلولاريزيشن وخلية من التجربة. سكالا فيستيبولي (SV)، حبل سكالا (SM)، الغشاء باسيلار (بي أم)، Tectorial Membrane (TM)، دوامة ليمبوس (L) وقناة (اتفاقية روتردام) روزنتال، موديولوس (M)، ودوامه الرباط (SL) وفاسكولاريس ستريا (*). غشاء ريسنير لكان لم بوضوح في مقاطع الأنسجة، ونتيجة لوسائل الإعلام سكالا كانت غير محددة بوضوح. أشرطة مقياس على جميع الصور هي 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 8
    الشكل 8: تلوين الهيماتوكسيلين وويوزين للتحكم والمعالجة كوتشلياي- توضع وويوزين الملون مقاطع عرض القوقعة نموذجية مع الخلايا الأصلية هذا يظهر في لوحة أ. الفريق ب يحتوي على هياكل نفسه كلوحة أ، ولكن من القوقعة تماما ديسيلولاريزيد، الذي يترك وراءه المصفوفة خارج الخلية. وتعتبر كوكليا المبين سابقا هما يملؤه هوجكس في لوحات ج ود. تشريح cochlear الإجمالي لم يتغير أساسا من خلال ديسيلولاريزيشن وخلية ثقافة العمليات، على الرغم من أن السكان خلية محددة ومواقع هي تغييرا هائلا. سكالا فيستيبولي (SV)، حبل سكالا (SM)، الغشاء باسيلار (بي أم)، Tectorial Membrane (TM)، دوامة ليمبوس (L) وقناة (اتفاقية روتردام) روزنتال، موديولوس (M)، ودوامه الرباط (SL) وفاسكولاريس ستريا (*). أشرطة مقياس على جميع الصور هي 250 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    A1 القوقعة + الخلايا A2 القوقعة + الخلايا B2 neg.
    القوقعة التحكم متاهة عظمى خارجية 3,758 549 0 العظام خارج القوقعة ممنوع 248 586 0 داخل قوقعة الإذن 518 701 0 مجموع الخلايا 4,524 1,836 0 حجم المقطع (ميكروليتر) 0.0077 0.0100 0.0147 في المئة من حجم القوقعة 0.46 في المائة 0.59% 0.87 في المائة قدرت كثافة الخلايا داخل القوقعة 113,759 118,732 0

    الجدول 1: الخلية التهم. وكانت DAPI الملون المقاطع cochlear ثريشولديد وكمياً باستخدام أدوات العد التلقائي في إيماجيج في 3 مناطق غير متداخلة للفائدة (خارج متاهة عظمى، العظم الصدغي خارج المسافات السوائل cochlear، وداخل القوقعة). كما تم قياس مساحة مقطعية cochlear في إيماجيج، وقد استخدمت هذه القيمة لحساب حجم القسم بالاشتراك مع قسم سمك (10 ميكرون). استخدام تقدير إجمالي حجم cochlear نشرتها سانتي et al. وقد حسبت 23، حجم cochlear النسبية لقسم معين. وقدرت كثافة الخلية القوقعة كامل باستخدام حجم cochlear النسبية لمقطع معين في تركيبة مع عدد الخلايا المزدوجة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    لقد أظهرنا بنجاح أن يمكن إزالة الخلايا cochlear الأصلية من القوقعة عبر عملية ديسيلولاريزيشن، الذي يسمح باستخدام القوقعة سقالة أنسجة معقدة، ثلاثية الأبعاد. سانتي وآخرون. 15 تطوير أسلوب كوكليا ديسيلولاريزينج الأولية، ودقة ويقدر حجم العديد من الهياكل cochlear عن طريق مع المعونة من الورقة الخفيفة الميكروسكوب23. مثل هذا العمل في وقت مبكر بمثابة أساس قوي لهندسة الأنسجة والخلية ثقافة التقنيات المعروضة هنا. ديسيلولاريزيد القوقعة يمكن بنجاح يملؤه الخلايا، ومثقف ثم لفترة طويلة من الزمن. ويمكن نظرياً الاستفادة كوكليا من مجموعة واسعة من الحيوانات في تركيبة مع مجموعة واسعة وكذلك أنواع الخلايا. هذه التركيبات تسمح التقنيات المعروضة هنا الاستفادة منها في العديد من التصاميم التجريبية المحتملة، مثل الأنسجة التطبيقات التي تدرس ظهارة الحسية التنمية14، المخدرات اختبار لوكلاء الأدوية الجديدة الهندسية 24، ونماذج التنمية لإصلاح cochlear25. ومع ذلك، على الرغم من انطباق واسع النطاق لهذه التقنيات فليست دون قيود.

    أحد أوجه قصور الأسلوب الحالي نضح متغير استناداً إلى الفرد. وضع حامل للقوقعة، واستخدام مضخة الحقن بإجراء بيرفوسيونس قد زيادة دقة ونجاح العملية. بالإضافة إلى ذلك، تثبت نهائياً ديسيلولاريزيشن ناجحة يمكن يحتمل أن إنجازه من خلال عدة طرق. استخدمنا DAPI تلطيخ التي تم استخدامها لتحديد مقدار نويات الخلايا المتبقية، ولاحظنا لا وظيفة-ديسيلولاريزيشن الأنوية المتبقية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الحمض النووي معيار القياس الكمي فحوصات الكاشف، الصبغة الخضراء كشف كميات حلول للحمض النووي، والتعرف على بقايا الحمض النووي، التي قد تكون أكثر حساسية من DAPI بصريا لتحديد وجود شظايا صغيرة من النووية الأحماض في الأنسجة ديسيلولاريزيد26. بغض النظر عن التقنيات التي تستخدم للتحقق من صحة ديسيلولاريزيشن ناجحة، قد لا تكون ممكنة لإظهار ديسيلولاريزيشن كاملة من القوقعة الفردية قبل استخدام ذلك سقالة. ومع ذلك، وجدنا أن عملية ديسيلولاريزيشن لتكون ناجحة وقوية.

    هي الخطوات الأكثر أهمية اثنين في البروتوكول الحالي على العزلة ومناولة كوكليا، ونضح من كوكليا. يجب إيلاء عناية كبيرة عند القوقعة معزولة في البداية، كما القوقعة حساسة وهشة. إذا تم تطبيق قوة كبيرة جداً أثناء التعامل مع القوقعة مع الملقط، يمكن تجزئة القوقعة. وبالتالي، من الضروري التعامل مع كل قوقعة الإذن بلطف قبل ديسيلولاريزيشن وديكالسيفيكيشن. ويعمل النظام الدهليزية، إذا تركت سليمة، كمؤشر كبير للاستيلاء على الإذن الداخلية المعقدة مع الملقط، وتوجيه القوقعة. وبالمثل، عندما بيرفوسينج القوقعة مع الخلايا، الضغط خلف نضح يجب لن يكون كبيرا جداً، خلاف الخلايا قد لا البقاء على قيد الحياة في التروية. كما ورد في البروتوكول الحالي، ربط الأنابيب إلى نهاية حقنه الأنسولين 1 مل يسمح لتسهيل التعامل للقوقعة مع جهة، وقدر أكبر من الدقة في بيرفوسينج الخلايا عن طريق القوقعة باليد الأخرى.

    كخطوة تالية، سيكون من الطبيعي لتقييم علامات التنموية والوظيفية لتحديد إذا كان المحتوى cochlear هو الذي يحفز التمايز للخلايا الجذعية، وإذا كان ذلك، أي مكونات محددة من مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة في القوقعة هي حمل تغييرات في الخلايا. بيرفوسينج أنواع مختلفة من الخلايا (مثلالخلايا الجذعية، نيوروبروجينيتورس، الليفية، إلخ) عن طريق القوقعة لمراقبة الخلية التمايز والسلوك سيكون آخر رائعة متابعة التحقيق. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا التي تم تعديلها وراثيا أو يتعرض لبروتوكول تمايز عامل النمو قد تقدم رؤى جديدة في كيفية cochlear ECM يدعم التنمية الحسية، وربما الدالة في جلسة الاستماع. وهكذا، البروتوكول الحالي هو خطوة أولى هامة في استخدام المحتوى cochlear لدراسة التنمية الحسية الإذن الداخلية والصيانة، وهي اليوم قد يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة لاستعادة السمع.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgments

    بإثبات جامعة كانساس مفهوم صندوق تمويل المشروع الحالي. نود أن نشكر موظفي التمريض في كومك (كانساس سيتي، كانساس) لمساعدتنا في الحصول على البشرية السرة الحبال، وديفيد يورجنسن لمساعدة مع الثقافات كوتشلياي.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Tags

    الهندسة الحيوية، العدد 131،: القوقعة، خلية الشعر، سقالة، ديسيلولاريزي، خلايا جيلي في وارتون، هندسة الأنسجة، زراعة الخلايا
    بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter