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Bioengineering

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/56523
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

Summary

L'obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l'utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Abstract

Nei mammiferi, le cellule ciliate che mechanosensory che facilitano la mancanza dell'udito la capacità di rigenerare, che ha limitato i trattamenti per la perdita dell'udito. Attuali strategie di medicina rigenerativa sono concentrati sul trapianto di cellule staminali o la manipolazione genetica delle cellule di supporto nell'orecchio interno per incoraggiare la sostituzione delle cellule danneggiate di staminali per correggere la perdita della capacità uditiva circostanti. Ancora, la matrice extracellulare (ECM) può svolgere un ruolo vitale nell'induzione e mantenimento della funzione delle cellule ciliate e non è stato ben studiata. Utilizzando il cocleare ECM come impalcatura per crescere le cellule staminali adulte possono fornire intuizioni uniche come la composizione e l'architettura dell'ambiente extracellulare aiuta le cellule nel sostenere la funzione uditiva. Qui presentiamo un metodo per isolare e decellularizing coclee da topi da utilizzare come scaffold accettando irrorato le cellule staminali adulte. Nel protocollo attuale, coclee sono isolate da topi eutanasizzati, decellularized e decalcificati. In seguito, cellule di gelatina di Wharton umana (hWJCs) che sono state isolate da cordone ombelicale sono state irrorate con attenzione in ogni coclea. Le coclee sono stati usati come bioreattori, e le cellule sono state coltivate per 30 giorni prima in fase di elaborazione per l'analisi. Coclee decellularizzati mantenuto strutture extracellulari identificabili, ma non hanno rivelato la presenza di cellule o notevoli frammenti di DNA. Cellule irrorate nella coclea invasero la maggior parte dell'interno ed esterno della coclea ed è cresciuta senza incidenti nel corso di una durata di 30 giorni. Così, il metodo corrente può essere utilizzato per studiare come cocleare ECM colpisce cellule sviluppo e comportamento.

Introduction

La coclea è una struttura a spirale intricato trovata nell'osso temporale. Esso è composto da un labirinto osseo esterno e un labirinto membranoso concentrici, interno1. Il labirinto membranoso è costituito da tre spazi fluidi: vestibuli di scala, Scala media e tympani di Scala1. I mezzi di scala ospita l'epitelio sensoriale, che è composto da una moltitudine di tipi di cellule, ma le cellule ciliate sensoriali (HC), che trasducono energia meccanica in onde sonore in impulsi nervosi2, sono di particolare interesse. L'esposizione al trauma acustico3,4,5, farmaco6, malattia7,8e9 di invecchiamento può provocare di alterata funzione uditiva tramite morte HC. Perdita di capelli cellulare nei mammiferi è permanente, a differenza di aviaria HCs, che può rigenerare dopo lesioni10.

Una varietà di sforzi di ricerca contemporanea hanno cercato di ripristinare perso HCs, anche se gli approcci sperimentali specifici variano. Manipolazione dell'espressione genica in epitelio sensoriale e l'impianto di cellule staminali differenziate all'esterno del corpo sono approcci dominanti nel campo, anche se i metodi di induzione che cercano di differenziare le cellule staminali in organoids cocleari sono stati ha tentato di11,12,13. Ciascuno di questi approcci sia reliant direttamente su cellule staminali, o i segnali dello sviluppo utilizzati dalle cellule staminali; Tuttavia, un secondo ha condiviso, e potenzialmente critici, elemento è l'ECM della coclea stessa14,15.

L'ECM non solo fornisce supporto fisico per cellule e tessuti, che comprende una superficie di adesione delle cellule, proliferazione, sopravvivenza e migrazione, ma svolge anche il ruolo critico nello sviluppo di HCs e la spirale del ganglio15,16 ,17. Naturalmente che si verificano ECM fornisce segnali induttivi che possono guidare la determinazione del fenotipo cellulare e/o di adesione, proliferazione e sopravvivenza cellulare18. Di conseguenza, l'uso di decellularizzazione coclea in combinazione con hWJCs coltivate offrono un'occasione unica per esplorare il ruolo della rigenerazione ECM e HC. HWJCs sono un tipo di cellula prontamente disponibili, non controverso isolato dal cordone ombelicale umani che si comportano come cellule staminali mesenchimali19. HWJCs hanno dimostrato la capacità di differenziarsi verso il basso delle cellule neurosensoriali lignaggi20,21. Così, l'attuale protocollo dettagli l'isolamento, decellularizzazione e perfusione delle coclee da carcasse del mouse C57BL con hWJCs per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno.

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Protocol

Tutte le procedure, tra cui l'eutanasia degli animali, sono state condotte secondo il protocollo approvato del istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) (Coppa #2014-2234) presso l'University of Kansas Medical Center (KUMC).

Nota: HWJCs sono state isolate da cordone ombelicale umani che sono stati donati dai pazienti che ha fornito il consenso informato e gli esemplari sono stati utilizzati secondo i protocolli approvati dal comitato di soggetti umani di Università del Kansas (KU-IRB #15402).

1. osso temporale raccolto e coclea isolamento

  1. Decapita un mouse in modo appropriato eutanasizzato, 15-settimana-vecchio di taglio tra il cranio e la prima vertebra cervicale con un paio di forbici chirurgiche, quindi spruzzare giù la testa con etanolo al 70% per disinfettare (Figura 1A).
  2. Bisecare il cranio in un piano sagittale utilizzando lo stesso paio di forbici chirurgiche (Figura 1B- C, le linee tratteggiate).
  3. Rimuovere il tessuto di cervello dal cranio usando un paio di pinze (Figura 1, punta di freccia).
  4. Identificare l'osso temporale attraverso la presenza di uditivo e le radici del nervo vestibolare (Figura 1E-F, punte di freccia) all'interno del cranio e il condotto uditivo dall'esterno (Figura 1F, freccia). Accuratamente tagliato attraverso il cranio per isolare l'osso temporale dal resto del cranio (Figura 1).
    Nota: In alcuni casi, è possibile fare leva delicatamente le ossa circostanti del cranio dall'osso temporale senza la necessità di taglio.
  5. Inserire il forcipe fine nell'apertura del condotto uditivo circa 5 mm (Figura 1 H), in modo che le punte non si rischiano di perforare della coclea. Delicatamente, rompere l'osso della bulla (Figura 1 H, top rosso zona ombreggiata) così fratture (lineaFigura 1I, rosso punteggiato).
    Nota: Se necessario, un microscopio di dissezione può essere di aiuto in questo processo per assicurare un posizionamento preciso e manipolazione degli strumenti.
  6. Utilizzando una pinzetta, leva via il resto della bulla dall'osso temporale, esponendo il labirinto ossuto della coclea (Figura 1J, staffe rossi).
  7. Inserire una capsula di Petri sufficientemente grande da contenere l'osso temporale (ad esempio, 30 mm o maggiore) sotto la dissezione di campo di ambito e riempirlo con abbastanza Phosphate Buffered Saline (PBS) per coprire l'osso temporale (ad esempio, 0,5-1 mL).
  8. Immergere l'osso temporale con la bulla rimossa in PBS con le finestre ovale e rotonde della coclea rivolto verso l'alto.
    Nota: La rimozione del sistema vestibolare dalla coclea non è necessario, come il sistema vestibolare serve anche come un handle per il maneggiamento e orientando le caratteristiche della coclea (Figura 1I e Figura 2B).
  9. Utilizzando un ultra-sottile paio di pinze, rimuovere l'arteria stapediali, che passa attraverso lo stapes.
  10. Inserire una punta delle pinze ultra fine attraverso l'arco dello stapes dove l'arteria è attraversato e sollevare delicatamente lo stapes. Stapes disarticolate dovrebbe sollevare fuori la finestra ovale.
  11. Utilizzando una punta delle pinze ultra-sottile, l'ovale di puntura e finestre rotonde.
  12. Utilizzando un PBS 1X preriempita 28,5-manometro con tubo (diametro interno 0,28 mm, diametro esterno 0,61 mm) fissato, posizionare il tubo sopra la finestra ovale (Figura 2A -B).
    Nota: L'apertura del tubo può essere manipolato con forcipe ultra-fine, contribuendo a garantire un posizionamento preciso.
    1. Utilizzare una siringa fresco e tubi per ogni coclea.
  13. Irrorare di 2 mL di 10% antibiotico antimicotico (anti-anti) e 10% penicillina-streptomicina (penna-strep) in PBS tramite coclea oltre 5 min per rimuovere perilymph. Che irrora troppo veloce con troppa pressione danneggia le strutture fini all'interno della coclea.
    Nota: Guida manualmente la siringa a mano per irrorare il fluido attraverso la coclea è efficace, anche se una pompa di perfusione potrebbe essere utilizzata come alternativa.
    1. Se manualmente che irrora, usare un paio di belle, dichiusura forcipe per stabilizzare la coclea (Figura 2A) durante l'aspersione afferrando la parte vestibolare dell'osso temporale.
      Nota: Anche se non richiesto, questo lascia entrambe le mani libere maneggiare gli strumenti; una mano può guidare la siringa (Figura 2A) mentre l'altro può posizionare il tubo in modo appropriato (Figura 2B).
    2. Da questo punto in avanti, prendersi cura per evitare di esporre la coclea inutilmente all'aria. L'introduzione di bolle d'aria negli spazi fluidi bloccherà la circolazione dei fluidi, e ulteriore essiccazione danneggia le strutture fini all'interno della coclea.
  14. Rimuovere ed eliminare eventuali rimanenti frammenti di ossa e dei tessuti dei muscolo utilizzando una pinzetta.
  15. Se necessario, è possibile memorizzare isolati coclee a 4 ° C in anti-anti 10% e 10% soluzione di penna-strep in PBS per fino a sette giorni con cambi regolari di soluzione antibiotica ogni 48 h.

2. coclea elaborazione

  1. Decellularizzazione
    1. Per ogni coclea, riempire una fiala di scintillazione di vetro da 20 mL con un 1% sodio dodecil solfato soluzione (SDS) in acqua deionizzata (DI), che viene utilizzato per decellularize la coclea.
    2. Tagliare la punta fuori di una pipetta di plastica 7-mL trasferimento utilizzando una lama di rasoio in modo che l'apertura è abbastanza grande per una coclea di passare attraverso.
    3. Usando la pipetta, delicatamente redigere la coclea nella pipetta modo passa solo il bordo di taglio di pochi millimetri.
    4. Espellere la coclea nella fiala di scintillazione riempito di soluzione di 1% SDS.
    5. Circolare 2 mL di SDS 1% in acqua deionizzata (DI) attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.
    6. Collocare il flaconcino di scintillazione in un rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente.
      1. Cambiare 1% SDS soluzione ogni 24 ore, per un periodo di 72 h. Fare attenzione quando si cambia SDS per non esporre mai la coclea all'aria.
    7. Lavare la coclea tre volte per 30 minuti ciascuno, con dell'acqua distillata.
Eseguire i lavaggi del flaconcino di scintillazione stesso utilizzato per le spese di SDS; in questa fase, la coclea è decellularized.
  • Decalcificazione
    1. Rimuovere l'acqua residua DI dal flaconcino di scintillazione, lasciando appena sufficiente per mantenere la coclea sommersa.
    2. Per iniziare la decalcificazione, aggiungere 5 mL di 10% acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (0,02 M) in acqua distillata nel flaconcino di scintillazione contenente la coclea.
    3. Circolare 2 mL di EDTA 10% DI acqua attraverso la coclea nella fiala di scintillazione utilizzando una pipetta di trasferimento.
    4. Collocare il flaconcino di scintillazione indietro nel rotatore e lasciare riposare il flaconcino scintillazione ruotare a 10 giri per 72 h a temperatura ambiente. Cambiare la soluzione di EDTA 10% ogni 24 ore, per un periodo di 72 ore. Fare attenzione quando si cambia soluzioni in modo che la coclea non è esposto all'aria.
    5. Sciacquare la coclea 3 volte per 2 h ciascuna con PBS 1X; in questa fase, la coclea è decalcificata.
  • Deposito
    1. Memorizzare le coclee per fino a 72 h in un'anti-anti, 10% penna-strep soluzione al 10% in PBS a 4 ° C.
      Nota: Più lunghi periodi di stoccaggio possono essere possibili con cambi regolari di soluzione antibiotica; Tuttavia, stoccaggio prolungato di coclee trasformati non è stato convalidato in questo protocollo.

    • 3. appalti pubblici e l'espansione di hWJCs

    1. Isolare il hWJCs secondo protocolli precedentemente pubblicati22. Brevemente, segmento cordoni ombelicali in sezioni di 3 cm.
    2. Attentamente fare un'incisione superficiale con un bisturi longitudinalmente su ciascun segmento di cavo ombelicale per srotolare ed esporre gelatina di Wharton del cordone ombelicale. Utilizzare pinze per rimuovere i vasi sanguigni.
    3. Lavare cordone ombelicale segmenti due volte con abbastanza PBS (ad es., 40 mL in una capsula di Petri di 60 mm) per immergere il tessuto. Tritare finemente i segmenti di tessuto con un bisturi. Digerire il tessuto in un 100mm Petri con 50 mL di mezzo di digestione (collagenasi tipo 2 0,2%, 1% penicillina-streptomicina, in basso-glucosio Medium (DMEM dell'Aquila per volta di Dulbecco)).
    4. Posto del tessuto nella digestione medio su agitatore orbitale a 50 rpm durante la notte in un 5% CO2, incubatore 37 ° C. Il giorno seguente, diluire mezzo di digestione con un rapporto di 01:16 in 2% antibiotico antimicotico in PBS e pellet di cellule mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 10 min. Discard surnatante.
    5. Risospendere il pellet in Mesenchymal Stem Cell crescita medio (MSCGM) e ricombinare le cellule. Piastra le cellule ad una densità di 7 x 103 cellule/cm2 nella coltura del tessuto trattate boccette di T-75. HWJCs in MSCGM della cultura ed espandere al passaggio 5 per esperimenti.
      Nota: HWJCs può essere sub-coltivate in T-palloni più grandi (ad es., T-150, T-300) quando passaggio per aumentare la resa di hWJCs per gli esperimenti.

    4. infusione di hWJCs in Decellularized coclee

    1. Preparare decellularizzati coclee
      1. Utilizzando una tecnica asettica, lavare coclee stored in PBS 1X tre volte per 30 minuti ciascuno.
      2. Coclee di trasferimento in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 1 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM.
      3. Incubare le coclee in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C per un minimo di 1 h prima dell'infusione delle cellule.
    2. Dissociare hWJCs e risospendere
      1. HWJCs di lavaggio con 37 ° C pre-riscaldati 1X PBS due volte.
      2. Aggiungere sufficiente 37 ° C pre-riscaldati tripsina con EDTA 0,5% per coprire la superficie del vaso di cella.
      3. Incubare hWJCs per fino a 5 min in un 5% CO2, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C.
        1. Verificare che il 90% delle cellule staccato dalla superficie di coltura delle cellule visualizzando le cellule al microscopio invertito.
          Nota: Le cellule che si muovono quando la nave di cultura delicatamente è sfruttata, staccato. Le cellule che rimangono fisse, non siano staccate.
        2. Picchiettare delicatamente i lati del pallone per sloggiare ulteriormente cellule allegate.
      4. Utilizzando una tecnica asettica, hWJCs trasferimento dal recipiente di coltura in una provetta conica da 50 mL contenente un volume equivalente di MSCGM al volume di tripsina utilizzato per dissociare le cellule.
      5. A pellet il hWJCs mediante centrifugazione a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) per 5 min.
      6. Aspirare il supernatante e risospendere hWJCs in MSCGM ad una concentrazione di 500.000 cellule/mL.
    3. Irrorare le coclee
      1. Coclee di trasferimento ad una nuova piastra 24 pozzetti usando una pipetta di trasferimento.
      2. Aggiungere una goccia di MSCGM per ogni coclea per impedire qualsiasi coclea asciugarsi.
      3. Delicatamente e orientare la coclea utilizzando forcipe ultra-fine, in modo che le finestre ovali e rotonde sono rivolto verso l'alto.
        Nota: La estrema attenzione direttamente ogni coclea come la coclea è danneggiata facilmente.
      4. Usando una siringa sterile 28,5-calibro insulina con tubi collegati, redigere 0,2 mL risospese hWJCs (100.000 cellule).
      5. Con una pinzetta sterilizzata, posizionate tubi finestra ovale.
      6. Delicatamente e lentamente irrorare la coclea con 0,2 mL di sedimento hWJCs utilizzando una siringa da insulina 28,5-manometro collegata al tubo in polietilene (diametro esterno: 0,61 mm, diametro interno: 0,28 mm) sopra circa 5 min.
      7. Dopo aspersione, aggiungere 0,8 mL di 37 ° C pre-riscaldati MSCGM al bene contenente la coclea per portare il volume totale nel pozzo a 1 mL.
      8. Ripetere i passaggi 4.3.3-4.3.7 per ogni coclea, usando una siringa fresca e tubi ogni volta.
      9. Posto irrorati coclee in un cambiamento supporti tre volte alla settimana, incubatrice di coltura cellulare di 37 ° C e 5% CO2.

    5. conservazione e raccolto coclea

    Nota: Coclee possono essere coltivate e raccolgono in qualsiasi momento post-l'aspersione fino a 30 giorni.

    1. Per conservare le coclee, difficoltà in paraformaldeide al 4% in PBS 1X durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a dondolo.
    2. Dopo la fissazione, lavare coclee con PBS 1X tre volte per 5 minuti ciascuno.
    3. Gradualmente disidratare coclea con etanolo e chiaro con un solvente idrocarburo alifatico prima di incorporare in paraffina.
    4. Sezione campioni ad uno spessore di 10 µm utilizzando un microtomo e montare su vetrini.
      Nota: I campioni sono pronti per l'istologico o immunohistochemical elaborazione utilizzando protocolli standard.

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    Representative Results

    Utilizzando i metodi presentati qui, successo decellularizzazione di coclee è stata valutata esaminando la presenza o l'assenza di DNA attraverso 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) colorazione. Coclee sono stati considerati pienamente decellularizzati se il DNA non è stato identificato all'interno della coclea decellularizzata. Una coclea nativa da un esperimento precedente che non subissero decellularizzati o decalcificazione è stata utilizzata come controllo positivo per illustrare le strutture e le cellule che si trovano tradizionalmente in una coclea di mouse C57BL. Coclea decellularized-decalcificati, che non ha avuto alcun hWJCs infuso, è stata utilizzata come controllo negativo. Non quantificabili nuclei cellulari DAPI macchiati sono stati osservati in qualsiasi regione della sezione di tessuto (Figura 3). Due coclee erano decellularized e decalcificate e poi infuso con hWJCs per il progetto corrente. Le coclee decellularized-decalcificate sono stati irrorati con hWJCs sono stati osservati per avere numerosi DAPI macchiato nuclei all'interno della coclea e cresce su shell ossuta all'esterno della coclea (tabella 1). Totale stimato di densità delle cellule per la cella infuso prima coclea erano 113.759 cellule/coclea dopo 30 giorni di cultura (Figura 4 e Figura 5) e per la seconda coclea erano 118.732 cellule/coclea dopo 30 giorni di cultura (Figura 6 e Figura 7). Queste stime di densità cellulare includono il tympani di Scala mezzi di Scala e Scala vestibolo e volumi di strutture che si trovano all'interno di tre spazi fluidi, ma queste stime escluso qualsiasi del labirinto ossuto rimanente. Inoltre, i campioni da ogni coclea sono stati macchiati con ematossilina ed eosina (H & E) per mostrare la presenza di cellule e caratteristiche anatomiche all'interno ogni coclea (Figura 8). L'anatomia lorda di microstrutture cocleare rimasta prevalentemente immutata nel corso di tutte le sezioni macchiate; Tuttavia, le celle non erano identificabili nella sezione decellularized-decalcificate (Figura 8B). L'identificazione dei nuclei delle cellule era drammaticamente differente fra la coclea nativa (Figura 8A) e le coclee decellularized-decalcificate infusi con cellule (Figura 8–D).

    Figure 1
    Figura 1: Mouse osso temporale isolamento. Una volta che il mouse è stata eutanasia in modo appropriato, decapitare l'animale di taglio tra la base del cranio e la prima vertebra cervicale e la testa di spruzzo con etanolo per disinfettare (A). Bisecare il cranio in un piano sagittale della sezione (B–C) utilizzando un paio di forbici chirurgiche, taglio attraverso il tessuto cerebrale e l'osso. La testa del mouse bisecato (D, mandibola inferiore rimosso per lavoro sperimentale non correlati) deve quindi avere il tessuto di cervello rimosso per rivelare l'osso temporale. I due orifizi attraverso cui il pass uditivo e nervi vestibolari (punte di frecciaE, rosso) sono utili spunti per identificare correttamente l'osso temporale. Togliere la carne dal cranio (F). Il condotto uditivo esterno (F, freccia, pannello superiore) fornisce un'utile indicazione esterna pure. Accuratamente tagliare via l'osso in eccesso, lasciando solo l'osso temporale isolato (G). Bulla (H, pannello superiore, rosso area evidenziata) deve quindi essere rimosso delicatamente utilizzando una pinzetta (H, pannello inferiore). La bulla è osso sottile e può essere facilmente scheggiata via (io) fino a quando il labirinto ossuto della coclea è rivelata (staffeJ, rosso). Barre della scala su tutte le immagini sono di 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 2
    Figura 2: perfusione cocleare. Una volta che l'osso temporale è stato isolato e la bulla è stato rimosso, la coclea può quindi impostare per aspersione al microscopio. Quando che irrora usando una siringa manualmente guidata con tubazione collegata (A, linea punteggiata) può essere utile stabilizzare la coclea usando un paio di pinze di chiusura automatica. Delicatamente collegare le pinze alla parte vestibolare dell'osso temporale (B) e riposare il forcipe contro il labbro di Petri (A). Questo lascia entrambe le mani libere manipolare strumenti durante l'aspersione. Da un lato quindi possibile manipolare la siringa, controllo della portata del fluido, mentre l'altra mano può posizionare il tubo sopra la finestra ovale utilizzando un secondo paio di pinze (B). L'estremità libera del tubo di taglio ad angolo permette per un più facile posizionamento, permettendo il tubo essere posizionata correttamente senza bloccare il campo visivo. Barra della scala è di 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 3
    Figura 3: sezione di tessuto di una coclea del mouse decellularizzati. Un microscopio dritto di epi-fluorescente è stato utilizzato per immagine campioni ad un ingrandimento di 200x (oculare 10x e obiettivo X 20). Immagini erano cuciti insieme per creare circa un montaggio di 4 x 5. DAPI mostrando assenza di cellule di macchiatura nucleare è mostrato nel Pannello utilizzando un insieme di filtro comune DAPI (350 nm eccitazione, 470 nm emissione) e una sovraesposta, scala di grigi del autofluorescence utilizzando un filtro comune di fluoresceina isotiocianato (FITC) set (490 nm eccitazione, 525 nm emissione), che fornisce punti di riferimento anatomici, è mostrato nel pannello B. I conteggi delle cellule automatizzati sono stati effettuati in tre regioni di interesse, che sono delineati su entrambi i pannelli A e B. Conta delle cellule totali sono stati calcolati per l'intero tessuto sezione (1, solida linea bianca) e la coclea (2, linea tratteggiata). Questi due numeri sono stati utilizzati per calcolare il numero di cellule in strutture ossee di fuori della coclea, ma all'interno i bordi esterni, ossuti della sezione di tessuto (3, spazio tra la linea tratteggiata e la linea tratteggiata). Barre della scala su tutte le immagini sono 500 µm.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 4
    Figura 4: una vicino-modiolar sezione della coclea del mouse decellularizzati 1 infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A sovrapposta su un'autofluorescenza sovraesposti, in scala di grigi dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. Automatizzata delle cellule conteggi sono stati effettuati in tre regioni di interesse, che sono delineati nel pannello A. Conta delle cellule totali sono stati calcolati per l'intero tessuto sezione (1, solida linea bianca) e la coclea (2, linea tratteggiata). Questi due numeri sono stati utilizzati per calcolare il numero di cellule in strutture ossee di fuori della coclea, ma all'interno i bordi esterni, ossuti della sezione di tessuto (3, spazio tra la linea tratteggiata e la linea tratteggiata). La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e la soglia della colorazione DAPI utilizzato durante la quantificazione automatica viene visualizzata nel pannello di C. Barre della scala su tutte le immagini sono 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 5
    Figura 5: vista ad alto ingrandimento di una sezione vicino-modiolar della coclea del mouse decellularizzati 1 infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A sovrapposta su un'immagine in scala di grigi sovraesposti, del autofluorescence dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e l'immagine di soglia utilizzata durante la conta cellulare automatizzata è mostrato nel pannello C. Gli spazi fluidi e microstrutture più fini, ospitate all'interno della coclea sono ben conservate durante la decellularizzazione e delle cellule di fasi di cultura dell'esperimento. Vestibuli di scala (SV), Tympani di Scala (SM), membrana basilare (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), canale (RC) di Rosenthal, Modiolus (M), legamento a spirale (SL) e vascularis dello stria (*). Membrana di Reissner non era chiaramente definita nelle sezioni del tessuto, e di conseguenza la Scala Media non è stato chiaramente definito. Barre della scala su tutte le immagini sono 250 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 6
    Figura 6: una sezione vicino-modiolar della coclea del mouse decellularizzati 2 che è stato infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A, sovrapposto sul autofluorescence in scala di grigi dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. Automatizzata delle cellule conteggi sono stati effettuati in tre regioni di interesse, che sono delineati nel pannello A. Conta delle cellule totali sono stati calcolati per l'intero tessuto sezione (1, solida linea bianca) e la coclea (2, linea tratteggiata). Questi due numeri sono stati utilizzati per calcolare il numero di cellule in strutture ossee di fuori della coclea, ma all'interno i bordi esterni, ossuti della sezione di tessuto (3, spazio tra la linea tratteggiata e linee tratteggiate). La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e la soglia della colorazione DAPI utilizzato durante la quantificazione automatica viene visualizzata nel pannello di C. Barre della scala su tutte le immagini sono 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 7
    Figura 7: vista ad alto ingrandimento di una sezione vicino-modiolar della coclea del mouse decellularizzati 2 che è stato infuso con hWJCs. Macchiatura nucleare DAPI è mostrata nel pannello A, sovrapposto sul autofluorescence in scala di grigi dal canale verde, che fornisce punti di riferimento anatomici. La colorazione DAPI isolato è mostrato nel pannello B, e l'immagine di soglia utilizzata durante la conta cellulare automatizzata è mostrato nel pannello C. Gli spazi fluidi e microstrutture più fini, ospitate all'interno del cocleare vengono conservate durante le fasi di cultura decellularizzazione e cella dell'esperimento. Vestibuli di scala (SV), Tympani di Scala (SM), membrana basilare (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), canale (RC) di Rosenthal, Modiolus (M), legamento a spirale (SL) e vascularis dello stria (*). Membrana di Reissner non era chiaramente definita nelle sezioni del tessuto, e di conseguenza la Scala Media non è stato chiaramente definito. Barre della scala su tutte le immagini sono 250 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figure 8
    Figura 8: eosina e colorazione di controllo e trattati coclee. Ematossilina ed eosina macchiato sezioni visualizzati da una coclea tipica con cellule native presenti è mostrato nel pannello A. Pannello B contiene le stesse strutture come pannello A, ma è da una coclea completamente decellularizzata, che lascia dietro di sé la matrice extracellulare. Le due coclee precedentemente illustrati infusi con hWJCs sono visti in pannelli C e D. L'anatomia lorda coclea invariato principalmente attraverso la decellularizzazione e processi di coltura delle cellule, anche se le popolazioni di cellule specifiche e le posizioni sono alterati drammaticamente. Vestibuli di scala (SV), Tympani di Scala (SM), membrana basilare (BM), Tectorial Membrane (TM), spirale Limbus (L), canale (RC) di Rosenthal, Modiolus (M), legamento a spirale (SL) e vascularis dello stria (*). Barre della scala su tutte le immagini sono 250 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    A1 Coclea cellule + A2 Coclea cellule + B2 neg.
    Controllo coclea Labirinto osseo esterno 3.758 549 0 Osso spazi esterni di coclea 248 586 0 All'interno della coclea 518 701 0 Cellule totali 4.524 1.836 0 Sezione Volume (μl) 0.0077 0.0100 0.0147 Per cento del Volume di coclea 0.46% 0,59% 0.87% Calcola la densità delle cellule all'interno della coclea 113.759 118.732 0

    Tabella 1: conta delle cellule. DAPI cocleare sezioni macchiate erano con soglia e quantificati utilizzando strumenti di conteggio automatici di ImageJ in 3 regioni non sovrapposti di interesse (di fuori del labirinto osseo, osso temporale di fuori del cocleari spazi fluidi e all'interno della coclea). Area della sezione trasversale coclea inoltre è stata misurata in ImageJ, e questo valore è stato utilizzato per calcolare il volume di sezione in combinazione con spessore di sezione (10 µm). Utilizzando una stima del volume totale di cochlear pubblicato da Santi et al. 23, il volume relativo coclea di una determinata sezione è stata calcolata. La densità delle cellule della coclea intera è stata stimata utilizzando il relativo volume coclea di una determinata sezione in combinazione con il conteggio delle cellule accoppiati.

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    Discussion

    Abbiamo dimostrato con successo che le cellule cocleari native possono essere rimosso dalla coclea tramite un processo di decellularizzazione, che consente l'utilizzo della coclea come un'impalcatura di tessuto intricato, tridimensionale. Santi et al. 15 ha sviluppato il metodo iniziale per coclee decellularizing e hanno valutato esattamente i volumi di molte strutture cocleari attraverso con l'aiuto del foglio leggero microscopia23. Questi primi lavori servito come una solida base per l'ingegneria dei tessuti e tecniche di coltura cellulare presentati qui. Coclea decellularizzato con successo può essere infusa con le cellule e quindi coltivate per un periodo prolungato di tempo. Coclee da una vasta gamma di animali teoricamente potrebbero essere utilizzate in combinazione con una gamma altrettanto vasta di tipi di cellule. Queste combinazioni permettono le tecniche qui presentate per essere utilizzata in numerosi disegni sperimentali possibili, ad esempio applicazioni che esaminare epitelio sensoriale sviluppo14, test di nuovi agenti farmaceutici droga di ingegneria tissutale 24, e lo sviluppo del cocleare riparazione modelli-25. Tuttavia, nonostante l'ampia applicabilità di queste tecniche non sono senza limitazioni.

    Uno dei limiti della tecnica attuale è che la perfusione è variabile basata sull'individuo. Lo sviluppo di un supporto, per la coclea e usando una pompa a siringa per condurre le aspersioni può aumentare la precisione e il successo del processo. Inoltre, dimostrando definitivamente successo decellularizzazione potenzialmente potrebbe essere realizzato attraverso diversi metodi. Abbiamo impiegato DAPI colorazione utilizzata per quantificare i restanti nuclei delle cellule, e abbiamo non osservato nessun nuclei residui post-decellularizzati. Inoltre, le analisi di quantificazione del DNA standard utilizzano il reagente, colorante verde rilevare quantità picogrammo di DNA, per identificare i resti di acido nucleico, che possono essere più sensibili di DAPI visivamente per individuare la presenza di piccoli frammenti di acido nucleico acidi in tessuti decellularizzati26. Indipendentemente da quali tecniche vengono utilizzate per convalidare successo decellularizzazione, potrebbe risultare possibile mostrare decellularizzazione completa di una coclea individuo prima che utilizzano come impalcatura. Tuttavia, abbiamo trovato il processo di decellularizzazione per avere successo e robusto.

    L'isolamento e la manipolazione delle coclee e la perfusione delle coclee sono due fasi più critiche del protocollo corrente. Grande cura deve essere preso quando la coclea è inizialmente isolata, come la coclea è delicata e fragile. Se troppa forza viene applicata durante la manipolazione della coclea con il forcipe, potrebbe frammentare la coclea. Pertanto, è imperativo per gestire ogni coclea delicatamente prima di decellularizzazione e decalcificazione. Il sistema vestibolare, se lasciato intatto, serve come una grande maniglia per afferrare il complesso dell'orecchio interno con il forcipe e orientare la coclea. Allo stesso modo, quando che irrora la coclea con le cellule, la pressione dietro la perfusione non deve essere troppo grande, altrimenti le cellule non possono sopravvivere la perfusione. Come indicato nel protocollo attuale, fissaggio della tubazione fino alla fine di una siringa da insulina 1 mL consente per una maggiore maneggevolezza della coclea con una sola mano e una maggiore precisione in che irrora le cellule attraverso la coclea con l'altra mano.

    Come prossimo passo, sarebbe naturale per valutare marcatori funzionali e di sviluppo per determinare se l'ECM coclea è induzione della differenziazione delle cellule staminali, e se così, quali componenti ECM specifici nella coclea sono indurre cambiamenti nelle cellule. Che irrora di diversi tipi di cellule (per esempio, cellule staminali, neuroprogenitors, fibroblasti, ecc.) attraverso la coclea per differenziazione cellulare monitor e comportamento sarebbe un'altra affascinante indagine di follow-up. Inoltre, le cellule che sono state geneticamente modificate o sono esposti a un protocollo di differenziazione di fattore di crescita possono fornire nuove intuizioni come il ECM cocleare supporta lo sviluppo neurosensoriale e forse anche funzione in udienza. Così, l'attuale protocollo è un primo passo significativo nell'uso di ECM cocleare per studiare sviluppo neurosensoriale dell'orecchio interno e manutenzione, che un giorno potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie per ripristinare la perdita dell'udito.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgments

    L'attuale progetto è stato finanziato dalla prova dell'Università del Kansas di fondo di concetto. Vorremmo ringraziare il personale infermieristico a KUMC (Kansas City, KS) per aiutarci a ottenere cordoni ombelicali umani e David Jorgensen per assistere con culture di coclee.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Allegra X-14R Centrifuge Beckman-Coulter B08861
    Intramedic Semi-Rigid Tubing Becton Dickinson 427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler Eppendorf M1190-0002
    Surgical Scissors Fine Science Tools 14060-10
    Fine Forceps Fine Science Tools 11370-40
    Ultra-Fine Forceps Fine Science Tools 18155-13
    50-mL Conical Tubes Fisher Scientific 12565271
    Petri Dish Fisher Scientific FB087579B
    U-100 Insulin Syringe Fisher Scientific 14-829-1B
    Scintillation Vial Fisher Scientific 03-341-73
    Rotator Fisher Scientific 88-861-049
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    Razor Blade Fisher Scientific 12-640
    Antibiotic-Antimycotic Fisher Scientific 15-240-062
    Penicillin-Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122
    24-Well Plate Fisher Scientific 07-200-84
    SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
    Transfer Pipette Fisher Scientific 22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36935
    Clear-Rite 3 Fisher Scientific 22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator Fisher Scientific 13-998-078
    Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza PT-3001
    Trypsin-EDTA Lonza CC-3232
    TPP T-75 Culture Flask MidSci TP90076
    TPP T-150 Culture Flask MidSci TP90151
    TPP T-300 Culture Flask MidSci TP90301
    Dissection Microscope Nikon Instruments SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope Nikon Instruments MFA51010
    NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet NuAire NU-425-600
    1X PBS Sigma-Aldrich P5368-10PAK
    1% SDS Solution Sigma-Aldrich 436143-100G
    10% EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Bioingegneria problema 131,: Coclea delle cellule cigliate impalcatura decellularize cellule di gelatina di Wharton ingegneria tissutale coltura cellulare
    Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno
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    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., … More

    Neal, C. A., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H., Mellott, A. J. A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (131), e56523, doi:10.3791/56523 (2018).

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