Summary
이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.
Abstract
포유류에서 청각 부족을 재생성 하는 기능을 촉진 하는 mechanosensory 세포는 청력 손실에 대 한 치료를 제한 했다. 현재 재생 의학 전략 이식 줄기 세포 또는 주변 청각 상실을 해결 하기 위해 손상 된 줄기 세포의 교체를 장려 하는 내가 지원 세포의 유전자 조작에 집중 했다. 그러나, 기질 (ECM) 유도 하 고 세포의 기능 유지에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 잘 조사 하지. 인공 와우를 사용 하 여 성체 줄기 세포를 성장 하는 발판으로 ECM 어떻게 구성 및 extracellular 환경 아키텍처 셀에 에이즈 청력 기능을 유지 하는 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 우리는 분리 하 고 건설 기계 성인 줄기 세포 끼얹는다 수락으로 사용 하는 마우스에서 cochleae를 decellularizing 하는 방법을 제시. 현재 프로토콜에서 cochleae 안락사 쥐, decellularized, 그리고 석 으로부터 격리 됩니다. 그 후, 탯 줄에서 고립 된 인간의 튼 젤리 셀 (hWJCs) 각 달팽이 관에 끼얹는다 신중 하 게 했다. cochleae 생물 반응 기, 사용 하 고 셀 분석에 대 한 처리를 진행 하기 전에 30 일 동안 배양 되었다. Decellularized cochleae 식별 extracellular 구조를 유지 하지만 DNA의 현저한 조각 또는 셀의 존재를 공개 하지 않았다. 셀 달팽이 관에 끼얹는다 인테리어와 달팽이 관의 외관의 대부분을 침공 하 고 30 일의 기간 동안 사고 없이 성장 했다. 따라서, 현재 방법 어떻게 인공 ECM에 영향을 미치는 세포 발달 및 행동 연구를 사용할 수 있습니다.
Introduction
달팽이 관은 측 뼈에서 발견 하는 복잡 한 나선형 구조. 그것은 외부 뼈 미로 동심, 내부 membranous 미로1로 구성. Membranous 미로 3 유체 공간 구성: 스칼라 vestibuli, 스칼라 언론과 Scala tympani1. 스칼라 미디어 하우스 수많은 종류의 세포로 구성 되어, 감각 상피, 하지만 감각 머리 세포 (HC), 신경 충 동2음파 기계적 에너지 transduce는 특정 관심의. 음향 외상3,,45, 약6, 질병7,8, 및 노화9 노출 모두 HC 죽음 통해 장애인된 청각 기능 발생할 수 있습니다. 포유류에서 머리 세포 손실 부상10후 재생성 수 조류 HCs 달리 영구적 이다.
다양 한 현대 연구 노력 하고자 했다 손실된 HCs 복원 특정 실험적인 접근 다르지만. 감각 상피에 유전자 발현의 조작 및 몸 밖에 서 분화 하는 줄기 세포의 주입은 필드에서 지배적인 접근 인공 organoids로 줄기 세포를 분화 하는 유도 방법 있다 지만 시도11,,1213. 이 방법의 각각은 줄기 세포 나 줄기 세포; 사용 발달 큐에 직접 의존 그러나, 두 번째 공유 하 고 잠재적으로 중요 한 요소는 달팽이 관 자체의 ECM14,15.
ECM 뿐만 아니라 세포와 조직, 세포 접착, 확산, 생존, 및 마이그레이션에 대 한 서피스를 포함 하지만 또한 HCs와 나선형 ganglion15,16의 개발에 중요 한 역할에 대 한 물리적 지원 제공 ,17. 자연스럽 게 발생 ECM는 세포 표현 형 결정 및 세포 접착, 확산, 그리고 생존18가이드 수 유도 신호를 제공 합니다. 따라서, 교양된 hWJCs와 함께에서 decellularized 달팽이 관의 사용 ECM HC 재생의 역할을 탐구 하는 독특한 기회를 제공 합니다. HWJCs는 중간 엽 줄기 세포19처럼 인간의 탯에서 고립 된 쉽게 사용할 수, 비 논란이 셀 유형입니다. HWJCs는 neurosensory 세포 계보20,21아래로 차별 하는 능력을 보여주었다. 따라서, 현재 프로토콜 절연, decellularization, 및 cochleae 내가 조직 공학에 대 한 hWJCs와 C57BL 마우스 시체에서의 관류 자세히 설명합니다.
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Protocol
동물 안락사를 포함 하 여 모든 절차는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 프로토콜 (ACUP #2014-2234) 캔자스의 대학 의료 센터 (KUMC)에 따라 실시 했다.
참고: HWJCs 동의 제공 하는 환자에 의해 기증 된 인간 탯 으로부터 격리 되었고 표본 캔자스의 대학 인간 주제 위원회 (구 IRB #15402)에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 사용 했다.
1. 측 뼈 수확과 달팽이 관 절연
- 수술가 위, 날카로운 쌍 두개골과 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 적절 하 게 안락사, 15 주 된 마우스를 목을 벨 다음 스프레이로 소독 (그림 1A) 70% 에탄올과 머리.
- (그림 1B-C, 파선) 수술가 위 같은 날카로운 쌍을 사용 하 여 중간에 화살 평면에서 두개골 이등분
- (그림 1D, 화살촉) 집게의 쌍을 사용 하 여 두개골에서 뇌 조직을 제거 합니다.
- 청각의 존재 및 두개골 및 외관 (1 층 그림, 화살표)에서 외가도의 내부에 vestibular 신경 뿌리 (그림 1E-F, 화살촉) 통해 측 뼈를 식별 합니다. 측 뼈 두개골 (그림 1G)의 나머지에서 분리 두개골을 통해 조심 스럽게 잘라.
참고: 어떤 경우에, 그것 가능 할지도 모른다 섬세 하 게 절단 하지 않고도 측 뼈에서 두개골의 주변 뼈를. - 그래서 팁 달팽이 puncturing 위험 하지 않습니다 약 5 m m (그림 1 H), 외가도의 개통으로 미세 집게를 삽입 합니다. 부드럽게 깨 물집 (그림 1 H, 상단 빨간색 음영 처리 된 영역)의 뼈 그래서 그것 골절 (1I 그림, 빨간 점선 라인).
참고: 필요한 경우, 해 부 현미경 수 있습니다 원조이 과정에서 정확 하 게 배치 하 고 악기의 조작. - 미세 집게를 사용 하 여, 놀 리 려 멀리 측 뼈, 뼈 미로 달팽이 관 (그림 1J, 빨간 괄호)의 노출에서 물집의 나머지.
- 페 트리 접시 측 뼈를 충분히 큰 장소 (예를 들어, 30 m m 이상)는 해 부 아래 시야 범위와 함께 충분 한 인산 염 버퍼링 염 분 (PBS) 측 뼈 (예를 들어, 0.5 ~ 1 mL)를 작성.
- 향하도록 하는 달팽이 관의 타원형과 둥근 창문이 PBS에 제거 물집과 측 뼈를 잠수함.
참고: 달팽이 관에서 vestibular 시스템의 제거 필요는 없습니다,로 vestibular 시스템 역할 잘 조작 하 고 방향을 (1I 그림 및 그림 2B) 달팽이 관의 기능에 대 한 핸들. - 집게의 초 미세 쌍을 사용 하는 등골을 통과 stapedial 동맥을 제거 합니다.
- 어디 동맥을 통과 하는 등골의 아치를 통해 초 미세 집게의 한 끝을 삽입 하 고 섬세 하 게 위쪽으로 등골을 리프트. Disarticulated 등골 타원형 창에서 리프트 해야 합니다.
- 초 미세 집게의 한 팁을 사용 하 여 타원형 펑크 및 windows를 둥근.
- 튜빙 28.5 게이지 주사기 가득 1 x PBS를 사용 하 여 (내부 직경 0.28 m m, 외경 0.61 m m) 타원형 창 튜브를 놓고, (그림 2A -B).
참고: 튜브의 오프닝 조작할 수 있습니다 정확 하 게 배치 되도록 돕는 초 미세 집게를 사용 하 여.- 신선한 주사기와 튜브를 사용 하 여 각 달팽이 관에 대 한.
- 10% 항생제 antimycotic (방지) 및 10% 페니실린-스 (펜-strep) PBS에 5 분 이상 달팽이 관을 통해 제거 하는 perilymph의 2 개 mL perfuse 너무 빨리 너무 많은 압력으로 perfusing는 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 것입니다.
참고: 수동으로 perfuse 달팽이 관을 통해 액체를 손으로 주사기 운전은 효과적 이다, 관류 펌프 대신으로 사용 될 수 있지만.- 수동으로 perfusing, 자동 폐쇄 달팽이 관 (그림 2A) 안정 집게 관류 동안 측 뼈의 vestibular 부분을 파악,의 쌍을 사용 합니다.
참고: 필요 하지 않지만 이것은 두 손을 자유롭게 처리 계기; 다른 튜브를 배치할 수 있습니다 하는 동안 한 손으로 주사기 (그림 2A)를 구동할 수 있다 적절 하 게 (그림 2B). - 이 단계에서 앞으로, 공기에 불필요 하 게 달팽이 관을 노출 하지 않도록 주의. 유체 순환 차단 유체 공간으로 기포를 도입 하 고 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 더 밖으로 건조.
- 수동으로 perfusing, 자동 폐쇄 달팽이 관 (그림 2A) 안정 집게 관류 동안 측 뼈의 vestibular 부분을 파악,의 쌍을 사용 합니다.
- 제거 하 고 미세 집게를 사용 하 여 하 모든 나머지 근육 조직과 뼈 파편을 삭제.
- 필요한 경우, 최대 7 일간 항생제 솔루션 모든 48 h의 일정 변경에 대 한 10% 방지와 PBS에서 10% 펜 strep 솔루션에 4 ° C에서 고립 된 cochleae를 저장 합니다.
2. 인공 처리
- Decellularization
- 각 달팽이 관에 대 한 채우기 20 mL 유리 섬광 유리병으로 1% 나트륨 라우릴 황산 드 이온된 (DI) 수, 달팽이 관을 decellularize 하는 데 사용 되는에 (SDS) 솔루션.
- 개통은 달팽이 관 통과를 위해 충분히 큰 되도록 면도날을 사용 하 여 플라스틱 7 mL 전송 피 펫의 끝을 잘라.
- 전송 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 그릴 달팽이 관 피펫으로에 그래서 그것은 단지 몇 밀리미터에 의해 잘라 가장자리를 전달.
- 1 %SDS 솔루션 가득 섬광 유리병에 달팽이 관을 추방.
- 전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 드 이온된 (DI) 수에서 1 %SDS 2 개 mL를 순환.
- 회전으로 섬광 유리병을 놓고 실내 온도에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다.
- 1 %SDS 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 결코 공기에 달팽이 관을 노출 하는 SDS를 변경할 때 주의 합니다.
- 디 물으로 30 분 각각에 대 한 세 번 달팽이 관을 세척.
- 충분히 빠져들 달팽이 관을 계속 떠나 섬광 유리병에서 나머지 디 물을 제거 합니다.
- Decalcification를 하려면, 달팽이 관을 포함 하는 섬광 유리병에 디 물에 10 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.02 M)의 5 mL을 추가 합니다.
- 전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 디 물에 10 %EDTA 2 개 mL를 순환.
- 회전에 다시 섬광 유리병을 놓고 실 온에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다. 10 %EDTA 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 달팽이 관은 공기에 노출 되지 않습니다 있도록 솔루션을 변경할 때 주의 합니다.
- 2 h 각 1 x PBS;에 대 한 3 번 달팽이 린스 이 단계에서 달팽이 관은 석.
- 10% 방지, 10% 펜 strep 솔루션에 PBS에서 4 ° c.에 최대 72 h에 대 한 cochleae를 저장
참고: 긴 저장 기간 항생제 솔루션;의 일정 변경 가능 있을 수 있습니다. 그러나, 처리 된 cochleae의 확장된 저장이이 프로토콜에서 검증 되지 않았습니다.
3. 조달 및 hWJCs의 확장
- 이전에 게시 프로토콜22에 따라 hWJCs를 격리 합니다. 간단히, 3 cm 섹션으로 탯 세그먼트.
- 조심 스럽게 만들 메스로 절 개를 얕은 세로 각 탯 선분을 풀 튼의 젤리 탯의 노출에. 집게를 사용 하 여 혈관을 제거.
- 조직 잠수함 탯 세그먼트 (예를 들어, 60 mm 페 트리 접시에에서 40 mL) 충분 한 PBS로 두 번 씻는 다. 가늘게 조직 세그먼트 메스를 말하다. 다이제스트 100 mm 페 트리 접시 소화 매체의 50 mL와 조직 (0.2 %2 형 콜라, 1% 페니실린-스, 낮은 혈당에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)).
- 소화는 5% CO2, 37 ° C 배양 기에서 1 박 50 rpm에서 궤도 통에 중간에 티슈를 놓습니다. 다음 날, 소화 매체 2% 항생제-PBS에서 antimycotic에 1시 16분의 비율로 희석 하 고 실 온에서 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 (~ 27 ° C) 10 분 삭제 상쾌한에 대 한.
- Resuspend 펠 릿 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM)에서 하 고 세포를 재결합. 조직 문화에 7 x 103 셀/c m2 의 조밀도에 접시 셀 T-75 플라스 크 취급. MSCGM에서 HWJCs 문화 한 통로 5 실험을 확장 합니다.
참고: HWJCs 수 수 하위 양식 큰 T-플라스 크로 (예를 들어, T-150, T-300) 실험에 대 한 hWJCs의 수확량 증가를 뿌리고 때.
4입니다. Decellularized Cochleae에 hWJCs의 주입
- Decellularized cochleae을 준비
- 무 균 기술을 사용 하 여, 3 시간 30 분 대 한 1 x PBS에 저장된 cochleae 세척.
- Cochleae 24-잘 접시의 별도 우물으로 전송 하 고 37 ° C의 1 mL를 추가 MSCGM를 미리 예 열.
- Cochleae는 5% CO2, 세포의 주입 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 품 어.
- 해리 hWJCs 및 resuspend
- 37 ° c 워시 hWJCs 전 두 번 1 x PBS를 따뜻하게합니다.
- 37 ° c 충분 한 사전 예 열 셀 선박 표면에 0.5 %EDTA 트립 신.
- HWJCs는 5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 최대 5 분을 품 어.
- 세포의 90%는 거꾸로 현미경 세포를 확인 하 여 세포 문화 표면에서 분리 된 확인 합니다.
참고: 때 문화 배 도청 부드럽게 이동 하는 셀 분리 했습니다. 셀 고정, 남아 있는 분리 하지 있다. - 부드럽게 연결 된 셀을 더 꺼내 려 플라스 크의 측면을 누릅니다.
- 세포의 90%는 거꾸로 현미경 세포를 확인 하 여 세포 문화 표면에서 분리 된 확인 합니다.
- 무 균 기술을 사용 하 여, 해당 볼륨 MSCGM의 Trypsin의 볼륨을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 문화 선박에서 전송 hWJCs는 세포 분열을 사용.
- 실 온에서 500 x g에서 centrifuging 여는 hWJCs 작은 (~ 27 ° C) 5 분.
- 상쾌한, 발음 하 고 500, 000 셀/mL의 농도에서 MSCGM에 hWJCs를 resuspend.
- Cochleae perfuse
- Cochleae 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 24-잘 접시에 전송 합니다.
- 어떤 달팽이 관 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 각 달팽이 관에 MSCGM의 한 방울을 추가 합니다.
- 섬세 하 게 타원형과 둥근 창문을 향하도록 하 초 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관을 방향을 정하십시오.
참고: 주의 극단적인 달팽이 관 손상 쉽게 각 달팽이 관을 직접 처리 하는 경우. - 살 균 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 연결 된 튜빙, 0.2 mL resuspended hWJCs (100000 셀)를 그립니다.
- 멸 균된 미세 집게를 사용 하 여 케이블의 튜빙을 타원형 창에 놓으십시오.
- 섬세 하 게 그리고 천천히 perfuse 폴 리 에틸렌 튜브에 연결 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 resuspended hWJCs의 0.2 mL와 달팽이 관 (외경: 0.61 m m, 내경: 0.28 m m) 약 5 분 이상.
- 관류, 후 37 ° C의 0.8 mL를 추가할 필요는 잘 포함 하는 잘에서 1 mL 전체 볼륨을가지고 달팽이 관에 MSCGM를 미리 따뜻하게.
- 각 달팽이 관, 신선한 주사기를 사용 하 고 각 시간을 튜브에 대 한 4.3.3-4.3.7 단계를 반복 합니다.
- 5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터, 끼얹는다 cochleae를 놓고 미디어 주 당 3 시간을 변경 합니다.
5. 달팽이 수확 및 보존
참고: Cochleae 그리고 경작 수 있습니다 최대 30 일 후 관류 시간 언제 든 지 수확.
- Cochleae를 유지 하려면 1 x PBS 락 플랫폼에 4 ° C에서 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 수정 했다.
- 고정, 후 5 분에 대 한 세 번 1 x PBS 가진 cochleae 세척.
- 점차적으로 에탄올과 달팽이 관을 탈수 하 고 파라핀에 포함 하기 전에 지방 족 탄화수소 용 매로 취소 합니다.
- 에 톰 및 마운트를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 섹션 샘플 현미경 슬라이드 유리.
참고: 샘플 준비가 이제 조직학 immunohistochemical 처리 표준 프로토콜을 사용 하 여 또는.
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Representative Results
여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, cochleae의 성공적인 decellularization 4'를 통해 DNA의 유무를 검사 하 여 평가 했다 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩. Cochleae는 DNA 이었다 decellularized 달팽이 관 내에서 확인 되지 않는 경우 완전히 decellularized로 간주 됐다. Decellularization 또는 decalcification을 받을 하지 않았다 이전 실험에서 네이티브 달팽이 관 구조와 전통적으로 C57BL 마우스 달팽이 관에 있는 세포를 설명 하기 위해 긍정적인 제어로 사용 되었다. 어떤 hWJCs를 주입 하지 않은, decellularized-석된 달팽이 관, 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 아니 정량 DAPI 스테인드 세포 핵 조직 단면도 (그림 3)의 어떤 지역에서 관찰 되었다. 두 개의 cochleae decellularized 고 석, 되었고 현재 프로젝트에 대 한 hWJCs 주입. HWJCs와 함께 끼얹는다 했다 decellularized-석된 cochleae 수많은 DAPI를 달팽이와 달팽이 관 (표 1) 외부 뼈 껍질에 성장 핵 스테인드 관찰 되었다. 총 예상 셀 셀 밀도 생긴 첫 번째 달팽이 관 후 30 일 문화 (그림 4 및 그림 5)와 두 번째 달팽이 관에 대 한 문화의 30 일 후 118,732 세포/달팽이 관 113,759 세포/달팽이 관을 했다 (그림 6 과 그림 7)입니다. 이러한 셀 밀도 추정 Scala tympani, 스칼라, 그리고 스칼라 현관, 언론과 구조 3 유체 공간 내에서 볼륨을 포함 하지만 이러한 견적 제외 나머지 골 질 미로. 또한, 각 달팽이 관에서 샘플 Hematoxylin와 오신 스테인드 했다 (H & E) 세포와 각 달팽이 관 (그림 8) 내에서 해 부 특징의 존재를 보여. 와우 마이크로 구조의 심한 해부학 모든 스테인드 섹션;에 걸쳐 주로 불변에 남아 있었다 그러나, 셀 (그림 8B) decellularized-석된 섹션에서 식별 했다. 세포 핵의 식별 네이티브 달팽이 관 (그림 8A)과 셀 (그림 8C-D) 주입 decellularized 석된 cochleae 사이 극적으로 달랐다.
그림 1: 측 뼈 절연 마우스. 일단 마우스 적절 하 게 안락사 되었습니다, 두개골의 기지와 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 동물을 목을 벨 고 에탄올 소독 (A) 머리를 스프레이. 수술가 위, 뇌 조직 및 뼈를 통해 절단 날카로운 쌍을 사용 하 여 섹션B-(C)의 화살 평면에서 두개골 이등분 Bisected 마우스 머리 (D, 없는 실험적인 작품에 대 한 제거 하는 낮은 mandible) 뇌 조직 측 뼈를 제거 해야 합니다 다음. 청각과 vestibular 신경 통과 (E, 빨간 화살촉)는 유용한 두 foramina 측 뼈를 성공적으로 식별에 대 한 단서. 두개골 (F)에서 육체를 제거 합니다. 외부 귀 운하 (F, 화살표, 맨 위 패널) 뿐만 아니라 유용한 외부 큐를 제공합니다. 신중 하 게 멀리 측 고립 된 뼈 (G)에 그냥 떠나 초과 뼈 손질. 물집 (H, 상위 패널, 붉은 강조 표시 된 영역) 제거 해야 합니다 다음 수 섬세 하 게 잘 집게 (H, 낮은 패널)을 사용 하 여. 물집 얇은 뼈 이며, 수 있다 쉽게 부서진 떨어져 (나) 뼈 미로 달팽이 관의 계시 (J, 빨간 괄호) 될 때까지. 모든 이미지에 스케일 바는 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 인공 관류. 측 뼈 고립 되어가 물집 제거 되었습니다 일단 달팽이 관 다음 설정할 수 있습니다 현미경에 관류에 대 한. 튜빙 수동으로 구동된 주사기를 사용 하 여 perfusing (A, 라인을 점선) 때 자체 닫는 집게의 쌍을 사용 하 여 달팽이 관을 안정화 하는 데 도움이 수 있습니다. 부드럽게 측 뼈 (B)의 vestibular 부분에는 집게를 연결 하 고 페 트리 접시 (A)의 입술에 대 한 겸 휴식. 이것은 두 손을 자유롭게 관류 동안 악기를 조작 하. 한 손으로 다음, 액체의 유량을 제어 하는 동안 다른 손 집게 (B)의 두 번째 쌍을 사용 하 여 타원형 창을 통해 튜브를 배치할 수 있습니다 주사기를 조작할 수 있습니다. 튜브의 무료 끝 각도 절단 허용 쉽게 위치, 튜브의 시야를 차단 하지 않고 올바로 배치를 허용 합니다. 눈금 막대는 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: decellularized 마우스 달팽이 관의 조직 단면도. 똑바로 피 형광 현미경 (10 X 접 안 렌즈 및 20 X 목표) 200 X의 확대에서 샘플 이미지를 사용 했습니다. 이미지는 약 4 × 5 몽타주를 만들려고 함께 바느질 했다. 셀의 표시 부재 얼룩 핵 DAPI 패널 A DAPI 공통 필터 집합 (350 nm 여기, 470 nm 방출), 그리고 설쳐를 사용 하 여 fluorescein isothiocyanate (FITC) 일반적인 필터를 사용 하 여 autofluorescence의 회색 음영 이미지에에서 표시 됩니다. 세트 (490 nm 여기, 525 nm 방출), 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 패널 B에 표시 됩니다. 자동된 셀 수 A 와 B두 패널에 delineated 관심의 3 개 지역에서 수행 했다. 총 세포 수는 전체 조직 단면도 (1, 흰색 실선)과 달팽이 관 (2, 파선)에 대 한 계산 했다. 이 두 숫자 달팽이 관 이상으로 하지만 조직 섹션 (3, 점선 및 파선 사이의 공간)의 외부, 뼈 가장자리에서 뼈 구조에 있는 셀의 수를 계산 하는 데 사용 되었습니다. 모든 이미지에 규모 바 500 µ m입니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: decellularized 마우스 달팽이 관 1의 가까이 modiolar 섹션 들어갈 hWJCs. DAPI 핵 얼룩 A 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 설쳐, 회색조 autofluorescence에 중첩 패널에 표시 됩니다. 자동 셀 카운트 패널 A에 delineated 관심의 3 개 지역에서 수행 되었다. 총 세포 수는 전체 조직 단면도 (1, 흰색 실선)과 달팽이 관 (2, 파선)에 대 한 계산 했다. 이 두 숫자 달팽이 관 이상으로 하지만 조직 섹션 (3, 점선 및 파선 사이의 공간)의 외부, 뼈 가장자리에서 뼈 구조에 있는 셀의 수를 계산 하는 데 사용 되었습니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동화 된 정량화 사용 DAPI 얼룩의 임계값 C패널에 표시 됩니다. 모든 이미지에 스케일 바는 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: decellularized 마우스 달팽이 관 1의 가까이 modiolar 섹션의 높은 확대 보기 들어갈 hWJCs. DAPI 핵 얼룩 A 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 autofluorescence의 설쳐, 회색 음영 이미지에 중첩 패널에 표시 됩니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동된 셀 카운팅 하는 동안 사용 되는 임계값 이미지 C패널에 표시 됩니다. 유체 공간 및 달팽이 관 내에 위치 해 미세한 마이크로 구조는 decellularization 동안 잘 보존 실험의 문화 단계 세포. 스칼라 Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar 막 (BM), Tectorial Membrane (TM), 나선 Limbus (L), 로젠 탈의 운하 (RC), Modiolus (M), 나선형 인 대 (SL), 그리고 흔 Vascularis (*). Reissner의 막 조직 섹션에 명확 하 게 정의 되지 않았다 그리고 결과적으로 스칼라 미디어 명확 하 게 정의 되지 않았습니다. 스케일 바의 모든 이미지에는 250 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: modiolar에 가까운 부분의 hWJCs 주입 했다 decellularized 마우스 달팽이 2. DAPI 핵 얼룩 패널 A, 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 회색조 autofluorescence에 중첩에 표시 됩니다. 자동 셀 카운트 패널 A에 delineated 관심의 3 개 지역에서 수행 되었다. 총 세포 수는 전체 조직 단면도 (1, 흰색 실선)과 달팽이 관 (2, 파선)에 대 한 계산 했다. 이 두 숫자 달팽이 관 이상으로 하지만 조직 섹션 (3, 점선 및 파선 사이의 공간)의 외부, 뼈 가장자리에서 뼈 구조에 있는 셀의 수를 계산 하는 데 사용 되었습니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동화 된 정량화 사용 DAPI 얼룩의 임계값 C패널에 표시 됩니다. 모든 이미지에 스케일 바는 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: hWJCs 주입 했다 decellularized 마우스 달팽이 2의 가까이 modiolar 섹션의 높은 확대 보기. DAPI 핵 얼룩 패널 A, 해부학 적 랜드마크를 제공 하는 녹색 채널에서 회색조 autofluorescence에 중첩에 표시 됩니다. B, 패널에 표시 됩니다 절연 DAPI 얼룩이 지 고 자동된 셀 카운팅 하는 동안 사용 되는 임계값 이미지 C패널에 표시 됩니다. 유체 공간 및 미세한 마이크로 구조는 달팽이 관 내에 위치 해 실험의 decellularization 및 셀 문화 단계 동안 유지 됩니다. 스칼라 Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar 막 (BM), Tectorial Membrane (TM), 나선 Limbus (L), 로젠 탈의 운하 (RC), Modiolus (M), 나선형 인 대 (SL), 그리고 흔 Vascularis (*). Reissner의 막 조직 섹션에 명확 하 게 정의 되지 않았다 그리고 결과적으로 스칼라 미디어 명확 하 게 정의 되지 않았습니다. 스케일 바의 모든 이미지에는 250 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: Hematoxylin와 오신 얼룩 제어 및 치료 cochleae. 되며 및 네이티브 셀 현재 일반적인 달팽이 관을 표시 하는 섹션을 스테인드 오신 패널 A에 표시 됩니다. 패널 B 패널 A,으로 동일한 구조를 포함 하지만 세포 외 매트릭스 뒤에 완전히 decellularized 달팽이 관에서. 2 개의 이전 표시 cochleae hWJCs 주입 패널 C 와 D에서 볼 수 있습니다. 비록 특정 세포 인구와 위치는 극적으로 변경 된 총 인공 해부학 주로 decellularization 및 세포 배양 프로세스를 통해 그대로 남아 있습니다. 스칼라 Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), Basilar 막 (BM), Tectorial Membrane (TM), 나선 Limbus (L), 로젠 탈의 운하 (RC), Modiolus (M), 나선형 인 대 (SL), 그리고 흔 Vascularis (*). 스케일 바의 모든 이미지에는 250 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| A 1 달팽이 관 + 셀 | A2 달팽이 관 + 셀 | B2 부정적 |
표 1: 셀 수. DAPI 스테인드 인공 섹션 thresholded 되었고 관심 (밖에 서 뼈 미 궁, 측 뼈 인공 액체 공간 및 달팽이 관 내) 3 겹치지 않는 영역에 ImageJ의 자동 계산 도구를 사용 하 여 정량. ImageJ, 달팽이 관 단면적 측정 또한 되었다 그리고이 값 섹션 두께 (10 µ m)와 조합에서 섹션 볼륨을 계산 하는 데 사용 되었다. 산 티 외 에 의해 총 인공 볼륨의 견적을 사용 하 여 23, 주어진된 섹션의 상대 인공 볼륨 계산 했다. 전체 달팽이 관의 셀 밀도 짝된 셀 수 조합에 지정 된 섹션의 상대 인공 볼륨을 사용 하 여 추정 되었다.
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Discussion
우리는 성공적으로 복잡 한 3 차원 조직 발판으로 달팽이 관의 사용을 허용 하는 decellularization 과정을 통해 달팽이 관에서 네이티브 인공 세포를 제거할 수 있습니다 시연 했다. 산 티 외. 15 decellularizing cochleae에 대 한 초기 방법을 개발 하 고 정확 하 게 빛 시트 현미경23의 도움으로 많은 인공 구조를 통해 볼륨 견적 했다. 이러한 초기 작업 조직 엔지니어링과 세포 문화 기술을 여기에 대 한 강력한 기반으로 재직 했습니다. Decellularized 달팽이 관 수 성공적으로 융합 세포, 그리고 그 시간의 연장된 기간에 대 한 교양. 다양 한 동물에서에서 cochleae 수 이론적으로 세포 유형의 다양 한 유사 하 게와 함께 활용할 수 있습니다. 이러한 조합을 허용 여기에 제시 된 수많은 가능한 실험적인 디자인, 감각 상피 개발14검사, 약물의 새로운 제약 에이전트 테스트 하는 응용 프로그램 엔지니어링 조직에 활용 하는 기법 24, 와우 복구의 개발 모델25. 그러나, 이러한 기술의 광범위 한 적용에도 불구 하 고 그들은 되지 않습니다 제한 없이.
현재 기술의 한계 중 하나는 관류 개인에 따라 변수입니다. 달팽이 관에 대 한 홀더를 개발 하 고 주사기 펌프를 사용 하 여 perfusions를 수행 과정의 성공과 정확성 증가할 수 있습니다. 또한, 결정적으로 증명 하는 성공적인 decellularization 잠재적으로 여러 가지 방법을 통해 수행할 수 있는. 우리 DAPI 얼룩이 남아 있는 세포 핵을 계량 하는 데 사용 된 고용 하 고 우리가 관찰 아니 잔여 핵 게시물-decellularization. 또한, 표준 DNA 정량화 분석 실험 시 약, 녹색 염료 picogram 양의 DNA 핵 산 나머지, 시각적으로 핵의 작은 파편의 존재를 식별 DAPI 보다 더 민감한 수 있는 식별을 검색 활용 decellularized 조직26에 있는 산. 어떤 기법은 성공적인 decellularization의 유효성을 검사 하는 데 사용 됩니다에 발판으로 활용 하 여 이전 개별 달팽이 관의 완전 한 decellularization를 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 성공적이 고 강력한 decellularization 과정을 발견 했다.
현재 프로토콜에서 두 개의 가장 중요 한 단계는 고립 그리고 cochleae의 처리는 cochleae의 관류. 달팽이 관은 섬세 하 고 취 성 달팽이 관 처음 격리 된 때 신중을 기울여야 합니다. 집게와 달팽이 관을 처리 하는 동안 너무 많은 힘을 적용 하는 경우는 달팽이 관 수 조각화 됩니다. 따라서, decellularization 및 decalcification 전에 각 달팽이 관을 부드럽게 처리 하는 것이 필수적 이다. Vestibular 시스템 그대로, 겸 자와 함께 복잡 한 내 귀를 잡아와 달팽이 관을 향하는 큰 핸들로 사용 됩니다. 마찬가지로, perfusing 세포와 달팽이 관, 뒤에 관류 압력 너무 중대 해서는 안, 그렇지 않으면 세포는 관류 살아날 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 설명 했 듯이, 1 mL 인슐린 주사기의 끝에 튜브를 부착 한 손으로, 및 perfusing 다른 손으로 달팽이 관을 통해 셀에 정밀도와 달팽이 관의 쉽게 처리 할 수 있습니다.
다음 단계로 그것 자연 인공 ECM은 줄기 세포의 분화를 유도 하 고 있다와 그래서, 달팽이 관에서 특정 ECM 구성 요소를 셀에 변경 내용을 유도 확인을 발달 및 기능 표시를 평가 하는 것입니다. 다른 종류의 세포 (예를들면, 줄기 세포, neuroprogenitors, 섬유 아 세포, 등) 모니터 세포 분화 및 행동에 달팽이 관을 통해 perfusing 다른 매혹적인 후속 조사 될 것 이다. 또한, 세포 유전자 변형 또는 성장 인자 차별화 프로토콜에 노출 되는 인공 ECM neurosensory 개발을 지원 하는 방법에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하 고 청문회에서 함수 어쩌면 수 있습니다. 따라서, 현재 프로토콜 인공 ECM를 사용 하 여 내가 neurosensory 개발 및 유지 보수, 5 월 1 일 새로운 치료법의 개발로 이어질 청력 손실 복원 연구에 중요 한 첫 단계입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
현재 프로젝트 개념 펀드의 캔자스의 대학 증거에 의해 투자 되었다. 우리는 cochleae 문화 지원에 대 한 인간의 탯, 그리고 데이비드 조 젠 슨은 취득에 우리 위한 KUMC (캔사스 시, KS)에서 간호 직원을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
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