Summary
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации эффективным методом для decellularize и известь cochleae мыши для использования как подмости для ткани инженерных приложений.
Abstract
В млекопитающих, mechanosensory клетки волос, которые облегчают отсутствие слуха способность к регенерации, которая имеет ограниченные лечения потери слуха. Нынешние стратегии регенеративной медицины были сосредоточены на трансплантации стволовых клеток или генетические манипуляции окружающих клетки поддержки внутреннего уха для поощрения замены поврежденных стволовых клеток для исправления потере слуха. Тем не менее внеклеточная матрица (ECM) могут играть жизненно важную роль в склонение и поддержание функции клетки волос и не хорошо исследовано. С помощью кохлеарной ECM как леска выращивать стволовые клетки могут обеспечить уникальные понимание как состав и архитектуры внеклеточных среды помогает клетки в поддержании функции слуха. Здесь мы представляем метод для изоляции и decellularizing cochleae от мышей для использования в качестве строительных лесов, принимая перфузии взрослых стволовых клеток. В текущем протоколе cochleae изолированы от Усыпленных мышей, decellularized и decalcified. Потом клетки человека Уортон желе (hWJCs), которые были изолированы от пуповины были тщательно увлажненную в каждом улитки. Cochleae были использованы как биореакторов, и клетки были культивированный на 30 дней перед прохождением обработки для анализа. Decellularized cochleae сохранила идентифицируемой внеклеточного структур, но не выявили наличие клеток или заметно фрагменты ДНК. Клетки, увлажненную в улитке захватила большую часть интерьера и экстерьера улитки и вырос без инцидентов в течение 30 дней. Таким образом текущий метод может использоваться для изучения как улитковый ECM влияет на развитие клеток и поведение.
Introduction
Улитки является сложной спиральной структуры, в височной кости. Он состоит из наружной костлявые лабиринта и концентрические, внутренний лабиринт membranous1. Лабиринт membranous состоит из трех пространств жидкости: vestibuli Скала, Скала средства массовой информации и скала литавры1. Скала издательства сенсорные эпителия, который состоит из множества типов клеток, но Сензорные клетки волос (HC), которые передают механическую энергию в звуковые волны для нервных импульсов2, представляют особый интерес. Воздействие Акустическая травма3,4,5, лекарства6,7,болезни8и старения9 может привести в нарушение слуховой функции через HC смерти. Потеря волос клеток млекопитающих является постоянным, в отличие от птичьего HCs, которые могут восстанавливаться после травмы10.
Целый ряд современных исследовательских усилий стремились восстановить потеряли HCs, хотя конкретные экспериментальные подходы различаются. Манипуляция экспрессии генов в эпителии сенсорные и Вживление стволовых клеток продифференцировано вне тела являются доминирующей подходы в этой области, хотя методы индукции, стремящихся дифференцироваться стволовых клеток в улитковый organoids были попытка11,12,13. Каждый из этих подходов является либо непосредственно зависит от стволовых клеток или развития подсказки, используемые стволовых клеток; Однако, второй совместно, и потенциально критические, элемент ECM улитки, сам14,15.
ЭХО не только обеспечивает физическую поддержку клетки и ткани, которая включает в себя поверхность для клеточной адгезии, распространения, выживания и миграции, но также играет важную роль в развитии HCs и спираль ганглия15,16 ,17. Естественно происходя ECM предоставляет индуктивный сигналы, которые могут направлять Определение фенотипа клетки или клетки адгезии, распространением и выживания18. Следовательно использование decellularized улитки в сочетании с искусственного hWJCs предлагают уникальную возможность изучить роль ECM и HC регенерации. HWJCs являются легкодоступными, неспорным ячейки тип изолированы от человеческого пуповины, которые ведут себя как мезенхимальные стволовые клетки19. HWJCs показали способности различать вниз нейросенсорные клеток линий20,21. Таким образом текущий протокол детали изоляции, decellularization и перфузии cochleae от туши C57BL мыши с hWJCs для внутреннего уха тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, включая эвтаназии животных, были проведены согласно утвержденным институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) протокол (ACUP #2014-2234) в медицинском центре университета Канзаса (KUMC).
Примечание: HWJCs были изолированы от человеческого пуповины, которые были подарены пациентов, которые предоставлены осознанного согласия и образцы были использованы в соответствии с протоколами, утвержденных Комитетом университета Канзаса по предметам (ку-СИБ #15402).
1. височной кости урожая и улитки изоляции
- Обезглавить надлежащим образом Усыпленных, 15-недельных мыши путем разрезания между череп и первого шейного позвонка с парой острые ножницы хирургические, а затем спрей вниз головой с 70% этанола для дезинфекции (рис. 1A).
- Пополам черепа в середине сагиттальной плоскости, с использованием той же резкое пары Ножницы хирургические (рис. 1B- C, пунктирные линии).
- Удаление ткани мозга от черепа с помощью пары щипцов (рис. 1 d, стрелки).
- Выявления височной кости через присутствие слухового и вестибулярного нерва корни (Рисунок 1E-F, стрелки) на интерьер черепа и ушного канала от внешнего (Рисунок 1F, стрелка). Аккуратно вырежьте через череп изолировать височной кости от остальной части черепа (рис. 1 g).
Примечание: В некоторых случаях, может можно деликатно подглядывать окружающие кости черепа от височной кости без необходимости резки. - Вставьте тонкой щипцами в открытии ушного канала примерно 5 мм (рис. 1 H), поэтому советы не рискуйте проколов улитки. Аккуратно вскрывать кости буллы (рис. 1 H, верхний красный затененной области) поэтому переломы (Рисунок 1I, красная пунктирная линия).
Примечание: В случае необходимости, микроскопом рассечение может помочь в этом процессе для обеспечения точного размещения и обработки документов. - С помощью тонкой щипцы, совать нос от оставшейся части буллой от височной кости, подвергая костлявые лабиринта улитки (Рисунок 1J, красный скобки).
- Место Петри блюдо достаточно большой, чтобы держать височной кости (например, 30 мм или больше) под рассекает область поля зрения и заполнить его с достаточно фосфат буфер солевой (PBS) для покрытия височной кости (например, 0,5 – 1 мл).
- Опускайте височной кости с буллы, удалены в PBS с овальной и круглой windows улитки вверх.
Примечание: Удаление вестибулярной системы от улитки не является необходимым, поскольку вестибулярной системы хорошо служит ручкой для манипулирования и ориентации функции улитки (Рисунок 1I и Рисунок 2B). - С помощью ультра-тонкой пара щипцов, удалите stapedial артерии, которая проходит через стремени.
- Вставьте один наконечник ультра-тонкой щипцов через арку стремени, где артерии прошел и деликатно Поднимите стремени вверх. Офф в овальном окне снять разъединённых стремени.
- Используя один наконечник ультрадисперсных щипцов, прокол овал и круглые окна.
- С помощью 1 x PBS заполнены 28,5 калибруйте шприц с трубки (внутренний диаметр 0,28 мм, наружный диаметр 0,61 мм) прилагается, расположите трубы через овальное окно (рисунок 2A -B).
Примечание: Открытие трубки можно манипулировать с помощью сверхтонкого щипцы, помогая обеспечить точное размещение.- Используйте свежие шприц и труб для каждой улитки.
- Perfuse 2 мл 10% антибиотик противогрибковое (анти анти) и 10% пенициллин стрептомицином (ручка стрептококк) в PBS через улитку более 5 мин для удаления перилимфе. Perfusing слишком быстро с слишком много давления приводит к повреждению тонких структур внутри улитки.
Примечание: Вручную вождения шприц вручную, чтобы perfuse жидкости через улитки является эффективным, хотя перфузионный насос может использоваться в качестве альтернативы.- Если вручную perfusing, используйте пару штрафа, самозакрывающиеся щипцы для стабилизации улитки (рисунок 2A) при перфузии, держа вестибулярной части височной кости.
Примечание: Хотя не требуется, это оставляет обе руки свободными для обработки документов; одной стороны может управлять шприца (рисунок 2A), а другой можно расположить трубы надлежащим образом (рис. 2B). - От этого шага вперед, заботиться, чтобы не подвергать улитки излишне для воздуха. Представляя пузырьков воздуха в жидкости пространства будет блокировать циркуляции жидкости, и дальнейшее высыхание приведет к повреждению тонких структур внутри улитки.
- Если вручную perfusing, используйте пару штрафа, самозакрывающиеся щипцы для стабилизации улитки (рисунок 2A) при перфузии, держа вестибулярной части височной кости.
- Снимите и выбросьте любые оставшиеся мышечной ткани и кости фрагменты с помощью тонкой щипцы.
- При необходимости хранения изолированных cochleae при температуре 4 ° C в анти анти 10% и 10% раствор Пен стрептококк в PBS на срок до семи дней с регулярные изменения антибиотик раствора каждые 48 ч.
2. улитковый обработка
- Decellularization
- Для каждого улитки заливка стекла 20 мл флакон Сцинтилляционный с 1% натрия Додециловый сульфат (SDS) решения в деионизированной воде (DI), который используется для decellularize улитки.
- Отрежьте кончик офф пипетки пластиковые 7-мл передачи с помощью лезвия бритвы, так что открытие является достаточно большой для улитки пройти через.
- С помощью пипетки передачи, аккуратно составить улитки в пипетку так он просто передает краю отсечения на несколько миллиметров.
- Высылать улитки в пробирку раствор заполнены сцинтилляционные SDS 1%.
- Распространение 2 мл 1% SDS в деионизированной воде (DI) через улитку сцинтилляционные флакон с помощью пипетки передачи.
- Поместите сцинтилляционные флакона в ротатор и позволяют сцинтилляционные флакон для поворота 10 об/мин за 72 ч при комнатной температуре.
- Измените SDS 1% раствора каждые 24 ч в течение 72 ч. Соблюдайте осторожность при изменении SDS никогда не подвергать улитки воздух.
- Вымойте улитки три раза по 30 мин с ди водой.
- Удалите оставшуюся воду ди из сцинтилляционного флакон, оставляя только достаточно, чтобы держать улитки погруженной.
- Чтобы начать декальцинации, добавьте 5 мл 10% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (0,02 М) в воде ди сцинтилляционные флакон, содержащий улитки.
- Распространение 2 мл 10% ЭДТА в DI воды через улитку сцинтилляционные флакон с помощью пипетки передачи.
- Место сцинтилляционные флакон обратно в ротатор и позволяют сцинтилляционные флакон для поворота 10 об/мин за 72 ч при комнатной температуре. Измените ЭДТА 10% раствора каждые 24 ч в течение 72 ч. Соблюдайте осторожность при изменении решения, так что улитки не подвергается воздействию воздуха.
- Промойте улитки 3 раза по 2 ч с ПБС; на данном этапе является decalcified улитки.
- Хранить cochleae до 72 часов в 10% анти анти, 10% перо стрептококк раствора в PBS на 4 ° C.
Примечание: Длительного хранения может быть возможным с регулярные изменения антибиотик раствора; Однако длительное хранение обработанных cochleae не были протестированы в настоящем Протоколе.
3. закупки и расширение hWJCs
- Изолируйте hWJCs согласно ранее опубликованные протоколы22. Вкратце сегмент пуповины в разделы 3-см.
- Аккуратно сделайте мелкий разрез с помощью скальпеля продольно на каждом сегменте пуповины раскатывают и подвергать Уортон желе пуповины. Используйте щипцы для удаления кровеносных сосудов.
- Вымойте пуповины сегментов дважды с достаточно PBS (например, 40 мл в 60 мм Петри) погружаться в ткани. Мелко фарш ткани сегментов с помощью скальпеля. Дайджест ткани в 100 мм Петри с 50 мл среды пищеварения (коллагеназа типа 2 0.2%, 1% пенициллин стрептомицином, в низкой глюкозы Дульбекко изменение орла среднего (DMEM)).
- Место ткани в переваривания среднего на орбитальный шейкер на 50 об/мин на ночь в 5% CO2, 37 ° C инкубатора. На следующий день, разбавить среднего пищеварение в соотношении 1:16 на 2% антибиотик противогрибковое в PBS и Пелле клетки центрифугированием на 500 x g при комнатной температуре (~ 27 ° C) для 10 минут удалить супернатант.
- Ресуспензируйте окатышей в средний рост мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM) и перекомбинировать клетки. Плита клетки на плотности 7 х 103 клеток/см2 в культуре ткани лечение T-75 колбы. Культура HWJCs в MSCGM и расширить проход 5 для экспериментов.
Примечание: HWJCs может быть югу культивировали в больших T-фляги (например, T-150, T-300) когда пассированый увеличить доходность hWJCs для экспериментов.
4. настой hWJCs в Decellularized Cochleae
- Подготовка decellularized cochleae
- С помощью асептического технику, мыть хранимой cochleae в однократном ПБС три раза по 30 мин.
- Перевести cochleae на отдельных скважинах 24-ну плиты и добавьте 1 mL 37 ° C предварительно разогретую MSCGM.
- Инкубируйте cochleae в 5% CO2, 37 ° C клетки культуры инкубатор для минимум 1 ч до инфузии клеток.
- Отделить hWJCs и Ресуспензируйте
- Мойка hWJCs с 37 ° C предварительно разогретую ПБС дважды.
- Добавьте достаточно 37 ° C предварительно разогретую трипсина с 0,5% ЭДТА для покрытия поверхности клетки судна.
- Инкубируйте hWJCs до 5 минут в 5% CO2, 37 ° C инкубатор культуры клеток.
- Убедитесь, что 90% клеток отделен от поверхности культуры клеток, просмотрев клетки под инвертированным микроскопом.
Примечание: Клетки, которые двигают когда судно культуры осторожно прослушиваются, отсоединены. Клетки, которые остаются неподвижными, не отсоединяется. - Аккуратно постучите по стенкам колбы для дальнейшего вытеснения прилагаемый клетки.
- Убедитесь, что 90% клеток отделен от поверхности культуры клеток, просмотрев клетки под инвертированным микроскопом.
- С помощью асептической техники, передачи hWJCs от культуры судна в 50-мл конические трубку, содержащий эквивалентный объем MSCGM объему трипсина используется для разбить ячейки.
- Пелле hWJCs центрифугированием на 500 x g при комнатной температуре (~ 27 ° C) за 5 мин.
- Аспирационная супернатанта и Ресуспензируйте hWJCs в MSCGM в концентрации 500000 клеток/мл.
- Perfuse cochleae
- Передача cochleae новый 24-ну пластине с помощью пипетки передачи.
- Добавьте каплю MSCGM каждого улитки, чтобы предотвратить любые улитки от высыхания.
- Деликатно Ориентируйте улитки с помощью сверхтонкого щипцы, так что овальные и круглые окна вверх.
Примечание: Принять крайней осторожностью при непосредственно обработка каждого улитки улитки легко повредить. - С помощью шприца стерильные 28,5 калибруйте инсулина с подключенным труб, составить 0,2 мл высокомобильна hWJCs (100000 клеток).
- Использование стерилизованные тонкой щипцы, позиция трубы через овальное окно.
- Деликатно и медленно perfuse улитки с 0,2 мл ресуспензированы hWJCs, с помощью шприца инсулина 28,5 датчик подключен к полиэтиленовые трубки (наружный диаметр: 0,61 мм, внутренний диаметр: 0,28 мм) над примерно 5 мин.
- После перфузии, добавить 0,8 мл 37 ° C предварительно разогретую MSCGM хорошо содержащие улитки довести общий объем в скважине до 1 мл.
- Повторите шаги 4.3.3-4.3.7 для каждого улитки, используя свежие шприц и НКТ каждый раз.
- Перфузии cochleae в 5% CO2, 37 ° C инкубатор культуры клеток и изменить СМИ три раза в неделю.
5. улитки урожай и сохранение
Примечание: Cochleae может быть культивировали и собирают в любой момент времени до 30 дней после перфузии.
- Чтобы сохранить cochleae, исправить в параформальдегида 4% в однократном ПБС на ночь при 4 ° C на качающейся платформе.
- После фиксации мыть cochleae с ПБС три раза за 5 мин.
- Постепенно обезвоживает улитки с этанолом и очистка растворителем алифатических углеводородов до встраивания в парафин.
- В разделе образцы толщиной до 10 мкм, используя микротом и смонтировать на стеклянных скольжениях микроскопа.
Примечание: Образцы для теперь готовы гистологические или иммуногистохимических обработки с использованием стандартных протоколов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С использованием представленные здесь методы, успешно decellularization cochleae оценивалась путем изучения наличие или отсутствие ДНК через 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) пятнать. Cochleae были рассмотрены полностью decellularized, если ДНК не был выявлен в рамках decellularized улитки. Родной улитки от предыдущих эксперимент, который не проходят decellularization или декальцинации был использован как позитивный элемент управления для иллюстрации структуры и клеток традиционно в C57BL мыши улитки. Decellularized-decalcified улитки, которые не имеют каких-либо hWJCs переплетаются, использовался в качестве отрицательного контроля. Не поддающиеся количественной оценке клеточных ядер DAPI витражи были замечены в любом регионе секции ткани (рис. 3). Два cochleae были decellularized и decalcified, а затем infused с hWJCs для текущего проекта. Decellularized-decalcified cochleae, которые были увлажненную с hWJCs были замечены иметь многочисленные DAPI окрашенных ядер внутри улитки и растущих на костлявые оболочки вне улитки (Таблица 1). Общая смета, плотность клеток для ячейки проникнуты первый улитки были 113,759 клеток/улитки, после 30 дней культуры (рис. 4 и 5), а также для второго улитки были 118,732 клеток/улитки после 30 дней культуры (Рисунок 6 и Рисунок 7). Эти оценки плотности ячеек включают литавры Скала, Скала СМИ и скала вестибюль и томов структур, обнаруженных в течение трех жидкости запрещено, но эти оценки исключается любой из оставшихся костлявые лабиринта. Кроме того, образцы из каждой улитки окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) чтобы показать наличие клеток и анатомических особенностей в каждом улитки (рис. 8). Анатомии улитковый микроструктур преимущественно неизменный во всех разделах пятнами; Однако никакие клетки Идентифицируемы в разделе decellularized-decalcified (Рисунок 8B). Выявление клеточных ядер резко отличалась между родной улитки (рис. 8A) и decellularized-decalcified cochleae, infused с ячейками (DРисунок 8 c–).
Рисунок 1: мышь височной кости изоляции. После того, как мышь была надлежащим образом умерщвлены, обезглавить животного, отрезав между основания черепа и первого шейного позвонка и спрей голову с этанолом для дезинфекции (A). Пополам черепа в сагиттальной плоскости сечения (CB–), используя пару острые ножницы хирургические, резка через мозговой ткани и кости. Головку пополам мыши (D, Нижняя челюсть, удалены для несвязанных экспериментальных работ) должны затем иметь ткани мозга удалены, чтобы раскрыть височной кости. Двух отверстий, через которые слухового и вестибулярного нервы перевал (E, красные стрелки) полезные подсказки для успешного выявления височной кости. Удаление плоть от черепа (F). Наружное ухо канала (F, стрелка, верхней панели) обеспечивает полезные внешние биток также. Тщательно обрежьте от избыточного кости, оставив только изолированные височной кости (G). Буллы (H, верхней панели, красный выделенной области) должны затем деликатно удалить с помощью тонкой щипцы (H, Нижняя панель). Булла-тонкие кости и может быть легко сколы от (I) пока костлявые лабиринта улитки не выявлено (J, красный скобки). Масштаб баров на все изображения, 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: улитковый перфузии. После того, как височная кость был выделен и буллы была удалена, улитки могут затем быть настроить для перфузии в Микроскоп. При perfusing с помощью вручную управляемые шприца с трубы (А, пунктир) это может быть полезно для стабилизации улитки, используя пару самозакрывающиеся щипцов. Аккуратно приложите щипцы вестибулярной части височной кости (B) и отдыха щипцы против губ Петри (A). Это оставляет обе руки свободно манипулировать инструментов во время перфузии. Одной стороны затем можно манипулировать шприц, контролировать скорость потока жидкости, в то время как другой стороны можно расположить трубы через овальное окно, с помощью второй пары щипцов (B). Резка свободный конец трубки с углом наклона позволяет легче позиционирования, позволяя трубки быть помещены правильно без блокирования поля зрения. Линейки-1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: часть ткани decellularized мыши улитки. Вертикальном положении epi флуоресцентный микроскоп был использован для изображения образцов на увеличение 200 X (10 X окуляр и 20 X цели). Изображения были сшиты вместе для создания примерно 4 x 5 монтаж. DAPI ядерной пятнать показаны отсутствие клеток показана в группа A с помощью DAPI общий набор фильтров (350 Нм возбуждения, 470 Нм выбросов) и переэкспонированными, изображение в градациях серого аутофлюоресценция, используя общие фильтр флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) набор (490 Нм возбуждения, 525 Нм выбросов), который обеспечивает анатомические ориентиры, отображаемые в панели B. Автоматизированный клеток были проведены в трех регионах, представляющих интерес, которые определены на обеих групп A и B. Общая клеток были рассчитаны для всей ткани секции (1, сплошной белой линией) и улитки (2, пунктирная линия). Эти два числа были использованы для расчета числа клеток в костные структуры вне улитки, но в пределах внешней, костлявые края ткани секции (3, пространство между пунктирной линией и пунктирная линия). Масштаб гистограммы на всех изображениях являются 500 мкм.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: возле modiolar раздел decellularized мыши улитки 1 infused с hWJCs. DAPI ядерной пятнать показан в панели, которые A накладывается на передержано, Аутофлюоресценция серого из зеленого канала, который обеспечивает анатомические ориентиры. Автоматизированная клеток, которые счетчики были проведены в трех регионах, представляющих интерес, которые определены в группе A. Общая клеток были рассчитаны для всей ткани секции (1, сплошной белой линией) и улитки (2, пунктирная линия). Эти два числа были использованы для расчета числа клеток в костные структуры вне улитки, но в пределах внешней, костлявые края ткани секции (3, пространство между пунктирной линией и пунктирная линия). Изолированные DAPI пятнать показан в группы B, и порог DAPI пятнать во время автоматизированного количественного определения отображается в панель C. Масштаб баров на все изображения, 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: высокое увеличение зрения вблизи modiolar секции decellularized мыши улитки 1 infused с hWJCs. DAPI ядерной пятнать показан в панели, которые A накладывается на изображение передержано, серого аутофлюоресценция от зеленого канала, который обеспечивает анатомические ориентиры. Изолированные DAPI пятнать показан в группы B, и порог изображение, используемое при подсчете автоматизированные ячейки отображается в панели C. Жидкости пространства и тонкие микроструктур, размещаются внутри улитки красиво, сохраняются во время decellularization и клеточной культуры фаз эксперимента. Scala Vestibuli (SV), Scala литавры (SM), Basilar мембраны (БМ), Tectorial Membrane (TM), спиральный лимба (L), канал (RC) Розенталя, Modiolus (M), спиральные связки (SL) и каннелюры Vascularis (*). Рейсснера мембрана не была четко определена в разделах ткани, и в результате Scala СМИ не была четко определена. Масштаб гистограммы на всех изображениях являются 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: возле modiolar раздел decellularized мыши улитки 2, infused с hWJCs. DAPI ядерной пятнать показана группа A, накладывается на серого аутофлюоресценция от зеленого канала, который обеспечивает анатомические ориентиры. Автоматизированная клеток, которые счетчики были проведены в трех регионах, представляющих интерес, которые определены в группе A. Общая клеток были рассчитаны для всей ткани секции (1, сплошной белой линией) и улитки (2, пунктирная линия). Эти два числа были использованы для расчета числа клеток в костные структуры вне улитки, но в пределах внешней, костлявые края ткани секции (3, пространство между пунктирной линией и пунктирные линии). Изолированные DAPI пятнать показан в группы B, и порог DAPI пятнать во время автоматизированного количественного определения отображается в панель C. Масштаб баров на все изображения, 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: высокое увеличение зрения вблизи modiolar секции decellularized мыши улитки 2, infused с hWJCs. DAPI ядерной пятнать показана группа A, накладывается на серого аутофлюоресценция от зеленого канала, который обеспечивает анатомические ориентиры. Изолированные DAPI пятнать показан в группы B, и порог изображение, используемое при подсчете автоматизированные ячейки отображается в панели C. Жидкости пространства и тонкие микроструктур, размещается в кохлеарном сохранились на этапах decellularization и клеточной культуры эксперимента. Scala Vestibuli (SV), Scala литавры (SM), Basilar мембраны (БМ), Tectorial Membrane (TM), спиральный лимба (L), канал (RC) Розенталя, Modiolus (M), спиральные связки (SL) и каннелюры Vascularis (*). Рейсснера мембрана не была четко определена в разделах ткани, и в результате Scala СМИ не была четко определена. Масштаб гистограммы на всех изображениях являются 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: гематоксилином и эозином пятнать контроля и обработанной cochleae. В группе Aпоказан гематоксилином и эозином, окрашенных разделах показано типичное улитки с родной клетки присутствуют. Группа B содержит те же структуры как группа A, но от полностью decellularized улитки, которая оставляет позади внеклеточного матрикса. Два ранее показанного cochleae, infused с hWJCs видны в панели C и D. Валовой анатомии улитковый преимущественно изменяется через decellularization и процессы культуры клеток, хотя конкретных клеточных популяций и местах резко меняются. Scala Vestibuli (SV), Scala литавры (SM), Basilar мембраны (БМ), Tectorial Membrane (TM), спиральный лимба (L), канал (RC) Розенталя, Modiolus (M), спиральные связки (SL) и каннелюры Vascularis (*). Масштаб гистограммы на всех изображениях являются 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| А1 + Клеток улитки | A2 + Клеток улитки | НЭГ B2 |
Таблица 1: сотовый графов. DAPI окрашенных улитковый разделы были показатели и количественных с помощью автоматического подсчета инструментов в ImageJ в 3 регионах non перекроя интереса (вне костного лабиринта, височной кости вне улитковый жидкости запрещено и внутри улитки). Площадь поперечного сечения улитковый также измеряется в ImageJ, и это значение используется для вычисления объема раздела в сочетании с толщина среза (10 мкм). С помощью оценки улитковый объема публикуемых Санти et al. 23, относительной улитковый объем данного раздела была рассчитана. Плотность клеток всего улитки оценивалась с использованием относительного улитковый объем данного раздела в сочетании с число парных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы успешно продемонстрировали, что родной улитковый клетки могут быть удалены из улитки через процесс decellularization, который позволяет использовать улитки как сложную, трехмерные ткани эшафот. Санти и др. 15 разработал первоначальный метод для decellularizing cochleae и точно оценить объемы многих улитковый структур путем с помощью света лист микроскопии23. Такая ранняя работа служит прочной основой для тканевой инженерии и представленные здесь методики культуры клеток. Decellularized улитку успешно может быть проникнуты с клетками и затем культивировали в течение длительного периода времени. Cochleae от широкий спектр животных теоретически могут быть использованы в сочетании с аналогичным образом широкого спектра типов клеток. Эти комбинации позволяют методы, представленные здесь, чтобы быть использованы в многочисленных возможных экспериментальных конструкций, таких как ткани, инженерных приложений, которые изучить сенсорные эпителия развития14, наркотиков, тестирование новых фармацевтических агентов 24, и разработка улитковый ремонт моделей25. Однако несмотря на широкую применимость этих методов они не без ограничений.
Одним из недостатков метода текущего является, что перфузии является переменной, основываясь на индивидуальных. Держатель для улитки, разработка и использование шприцевый насос для проведения орошений может повысить точность и успех этого процесса. Кроме того окончательно доказав успешных decellularization мог бы потенциально быть достигнуто через несколько методов. Мы заняты DAPI окрашивание, который был использован для количественной оценки оставшихся ядер клеток, и мы наблюдали без остаточного ядра пост decellularization. Кроме того Стандартные анализы ДНК количественной оценки используют реактив, зеленый краситель, обнаружения пикограмм количество ДНК, для выявления остатки нуклеиновых кислот, которые могут быть более чувствительны, чем DAPI визуально для выявления наличия небольших фрагментов нуклеиновых кислоты в decellularized тканей-26. Независимо от того, какие методы используются для проверки успешного decellularization может оказаться невозможным Показать полный decellularization отдельных улитки до использования его в качестве лески. Тем не менее мы нашли decellularization процесс, чтобы быть успешным и надежным.
Два наиболее важных шагов в текущий протокол являются изоляции и обработки cochleae и перфузии cochleae. Необходимо большую осторожность при улитки первоначально изолирован, как улитки, тонкие и ломкие. Если слишком много сил применяется при обработке улитки с щипцами, улитки могут фрагмент. Таким образом необходимо аккуратно обработать каждый улитки перед decellularization и декальцинации. Вестибулярный аппарат, если оставить нетронутыми, служит большие ручки для захвата внутреннего уха комплекс с щипцами и ориентировать улитки. Аналогично когда perfusing улитки с клетками, давление позади перфузии не должно быть слишком большим, иначе клетки не могут выжить перфузии. Как отмечено в протоколе текущей, подключение труб к концу шприц 1 мл инсулина позволяет легче обработку улитки с одной стороны и большую точность в perfusing клетки через улитки с другой стороны.
В качестве следующего шага было бы естественно для оценки развития и функциональных маркеры, чтобы определить, если улитковый ECM побуждение дифференцирования стволовых клеток, и если да, какие конкретные компоненты ECM в улитке вызывая изменения в клетках. Perfusing различные типы клеток (например, стволовые клетки, neuroprogenitors, фибробластов и т.д.) через улитку монитор дифференцировки клеток и поведение бы другой увлекательный последующего расследования. Кроме того клетки, которые были генетически изменены или подвергаются дифференциации протокол фактор роста может обеспечить новое понимание как улитковый ECM поддерживает нейросенсорные развития и возможно даже функции слуха. Таким образом текущий протокол является важным первым шагом в использовании кохлеарного ECM для изучения внутреннего уха нейросенсорные развития и обслуживания, которые могут в один день привести к разработке новых методов лечения для восстановления слуха.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Текущий проект финансировался университета Канзаса доказательство концепции фонда. Мы хотели бы поблагодарить медицинский персонал на KUMC (Канзас-Сити, KS) для оказания нам помощи в получении человека пуповины и Дэвид Йоргенсен для оказания помощи с cochleae культурами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
