Summary
Un protocollo per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di un inibitore dell'assorbimento del calcio mitocondriale basato sul rutenio è presentato. Una procedura per valutare la sua efficacia in cellule di mammifero permeabilized è dimostrata.
Abstract
Dettagliamo la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]+ 5. La sintesi ottimizzata di questo composto ha inizio dalla [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1m NH4OH in un contenitore chiuso, ottenendo una soluzione verde. Purificazione viene eseguita mediante cromatografia a scambio cationico. Questo composto è caratterizzato e verificato per essere puro mediante spettroscopia UV-vis e IR. Le proprietà inibitorie di assorbimento di calcio mitocondriale sono valutate in cellule HeLa permeabilized dalla spettroscopia di fluorescenza.
Introduction
Calcio mitocondriale è un regolatore chiave per un certo numero di processi che sono fondamentali per la funzione normale delle cellule, tra cui l'apoptosi e la produzione di energia. 1 , 2 , 3 il calcio mitocondriale uniporter (MCU), una proteina del trasportatore dello ione che si trova sulla membrana mitocondriale interna, regola l'afflusso degli ioni di calcio nei mitocondri. 4 , 5 , 6 inibitori chimici della MCU sono strumenti preziosi per proseguire gli sforzi per studiare la funzione e i ruoli cellulari di questa proteina di trasporto e di calcio mitocondriale. Il composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, è uno degli inibitori selettivi noti soli per la MCU con un valore did K riferito di 24 µM.7 ,8,9,10 , questo complesso è una comune impurità trovata in formulazioni commerciali del rutenio rosso (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo "a ponte" hexacation della formula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, che è stato utilizzato anche come un inibitore di assorbimento del calcio. Anche se Ru360 è disponibile in commercio, è molto costoso. Inoltre, la sintesi e l'isolamento di Ru360 è sfidato da purificazione difficili procedure e metodi di caratterizzazione ambigua.
Recentemente abbiamo segnalato procedure alternative per accedere un Ru360 analogici, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 questo composto inibisce la MCU con alta affinità, simile a Ru360. In questo protocollo, descriveremo la nostra sintesi più efficace di questo composto, che comincia da [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificazione del prodotto utilizzando la resina a scambio cationico fortemente acido è dettagliato, insieme a trabocchetti comuni per questa procedura. Inoltre presentiamo metodi di caratterizzazione e valutazione della purezza del composto e delineare un approccio semplice per testare la sua efficacia nel bloccare l'assorbimento di calcio mitocondriale.
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Protocol
Nota: acidi concentrati e basi sono utilizzati in questa sintesi. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si esegue la reazione compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (PPE) tra cui occhiali, guanti, camice da laboratorio, pieno lunghezza pantaloni e scarpe chiuse.
1. preparazione di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- sintesi di Cl [Ru (NH 3) 5 Cl] 2 12
- dissolvere 1.00 g di RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru di peso, 4,1 mmol) in 5 mL di H 2 O. Cool la soluzione marrone scura a 0 ° C in un bagno di ghiaccio. Aggiungere mL 11 (0,23 mol) di soluzione di idrato di idrazina 80% in modo goccia a goccia. La reazione iniziale sarà vigorosa con il gas di evoluzione, risultante in una soluzione marrone. La soluzione risultante si mova augellin a temperatura ambiente per 16 h; la soluzione finale sarà rosso scuro
Attenzione: L'idrazina è acutamente tossici e cancerogeni. Inoltre, anidra forme di questo reagente sono esplosive. Come sempre, uso appropriati cappe PPE e fumi durante la manipolazione. Non concentrare queste soluzioni per secchezza. - Per questa soluzione, aggiungere circa 5-10 mL di HCl concentrato per aggiustare il pH a 2. A questo punto, la soluzione sarà giallo-marrone a colori.
- Calore questa soluzione a 105 ° C continuando a mescolare per 1-2 h. Un solido giallo precipita dalla soluzione. Quando non più visibilmente precipitare forme, togliere dal fuoco.
- Permettere la miscela di reazione per raffreddare a temperatura ambiente e quindi posto in un bagno di ghiaccio 0 ° C per 10 min. raccogliere il solido giallo di filtrazione sotto vuoto e lavaggio con 5 mL di etanolo ed etere etilico.
- Sciogliere completamente il prodotto grezzo in 15-25 mL di acqua calda. Chill 10 mL di una soluzione di HCl concentrata in una beuta per filtrazione collocandolo in un bagno di ghiaccio. Filtrare la soluzione gialla nella soluzione di HCl refrigerata per indurre la precipitazione di un solido puro giallo pallido. Questo precipitato di filtrare e lavare con 5 mL ciascuno di 0,5 M HCl, etanolo ed etere.
- Caratterizzare il composto utilizzando la spettroscopia IR. Verificare purezza tramite l'identificazione delle frequenze d'allungamento a 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e cm 801 -1. Una comune impurità minori a 2069 cm -1 è assegnata a [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3.
- dissolvere 1.00 g di RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru di peso, 4,1 mmol) in 5 mL di H 2 O. Cool la soluzione marrone scura a 0 ° C in un bagno di ghiaccio. Aggiungere mL 11 (0,23 mol) di soluzione di idrato di idrazina 80% in modo goccia a goccia. La reazione iniziale sarà vigorosa con il gas di evoluzione, risultante in una soluzione marrone. La soluzione risultante si mova augellin a temperatura ambiente per 16 h; la soluzione finale sarà rosso scuro
- Sintesi di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- sciogliere 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL di 1m NH 4 OH in un recipiente a pressione a fondo rotondo parete pesante 200 mL. Senza bloccare il recipiente con un tappo di cap e riscaldare la miscela di reazione a 75 ° C per 6 h. Togliere dal fuoco e mescolare a temperatura ambiente per 4 giorni per produrre una soluzione verde scura.
Attenzione! Riscaldamento un risultati di vaso sigillato in un accumulo di pressione. Assicurarsi di utilizzare appropriato cristalleria di pressione-cassetta di sicurezza. Per questa reazione, lo scopo di sigillare la nave è quello di minimizzare la perdita di gassosa NH 3. Pertanto, inserire il tappo senza stringere per consentire per il rilascio della pressione in eccesso.
- sciogliere 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 in 50 mL di 1m NH 4 OH in un recipiente a pressione a fondo rotondo parete pesante 200 mL. Senza bloccare il recipiente con un tappo di cap e riscaldare la miscela di reazione a 75 ° C per 6 h. Togliere dal fuoco e mescolare a temperatura ambiente per 4 giorni per produrre una soluzione verde scura.
- Purificazione mediante cromatografia a scambio cationico
- In un becher da 25 mL, sospendere la resina a scambio cationico 5g (ad es., Dowex 50WX2 200-400 mesh (forma H +) in 10 mL di 0.1 M HCl.
- Caricare questo impasto in una colonna di 10 mL (10 mm di diametro, altezza 15 cm) munito di un serbatoio solvente 50 mL. Lavare la resina con circa 20-30 mL di 0.1 M HCl, finché l'eluato è incolore. Soluzione di reazione di
- ritorno al verde isolata al punto 1.2.1. Per questa soluzione, aggiungere HCl concentrato per regolare il pH a 2, al punto che il colore della soluzione diventa marrone.
- Caricare questa soluzione acidificata alla colonna di resina di scambio cationico preparata al punto 1.3.2 pipettando delicatamente sopra la resina. Lasciate che l'eluato completamente scarico e continuare a caricare la soluzione. Ripetere questo processo fino a quando l'intera soluzione è stato aggiunto. Parte superiore della resina sarà marrone scuro/nero. La resina diminuisce di volume leggermente.
- Perle di vetro di uso per coprire la parte superiore della resina. Questi impedirà la resina di essere disturbati quando vengono aggiunte nuove soluzioni.
- Eluire la colonna con 20 mL di 1 M HCl.
- Eluire la colonna con una maggiore concentrazione di HCl di 1,5 M (≈ 50 mL). Una soluzione gialla inizierà a venire fuori la colonna. Aumentare la concentrazione di HCl 2 m e continuare ad eluizione finché l'eluato è incolore o giallo-verde molto pallido. Un volume totale di 150-200 mL sarà richiesto per questo processo.
- Aumentare la concentrazione di HCl a 2,5 M (20-50 mL). Raccogliere l'eluato come frazioni in provette. Aumentare a 3 M HCl. Il prodotto sarà eluire dalla colonna come soluzione di verde-marrone. Una frazione di rosso-marrone può anche cominciare a venire fuori la colonna. Come queste frazioni sono le impurità ossidato rutenio rosso, non fare piscina con le frazioni di verde-marrone.
- Caratterizzazione e la verifica della purezza di [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- tutte le frazioni da testare Passo 1.3.8. dalla spettroscopia UV-vis. Per eseguire questa operazione, aggiungere 100 µ l di una determinata frazione in 2 mL di 3 M NH3 e analizzare mediante spettroscopia UV-vis. Le frazioni contenenti il prodotto puro avrà una band di grande capacità di assorbimento a 360 nm e una meno intensa assorbanza a 600 nm. Assorbanza a 533 o 480 nm è indicativo di ossidato rutenio rosso e le impurità del rutenio rosso, rispettivamente.
- Piscina frazioni contenenti il prodotto puro ed evaporare la soluzione ad essiccazione per evaporazione rotante. Il prodotto sarà isolato come un solido verde-marrone. Rendimenti sono tipicamente dell'ordine di 5-15 mg (10-20% di rendimento). Monocristalli, adatti per diffrazione dei raggi x, possono essere ottenute dalla diffusione del vapore dell'etanolo in soluzioni acquose del composto.
- Per verificare la purezza, analizzare il composto dalla spettroscopia UV-vis in una soluzione di soluzione tampone fosfato pH 7.4 (PBS). Purezza può essere valutata prendendo il rapporto di intensità di 360 nm e 600 nm cime. Questo rapporto è 31 per un composto puro. Per i composti impuri, il rapporto sarà più piccolo.
- Analizzare il campione nella a stato solido di spettroscopia IR. Bande di diagnostiche sono al 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bande di impurità comuni sono visti al 1762 cm -1 e 1400 cm -1, caratteristico di NH 4 cl. rutenio rosso può essere identificato da bande a 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.
- Valutazione di inibizione di assorbimento del calcio mitocondriale dalla spettroscopia di fluorescenza
attenzione! Le procedure seguenti utilizzano cellule di mammiferi. Lavoro deve essere svolto in cappe a flusso laminare appropriati che sono certificate per sicurezza biologica di livello 2 (BSL2) ricerca.
Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 verrà essere denominato come [Ru] in questa sezione- Make tamponata contenenti glucosio soluzione salina (BGSS) il supporto di analisi. BGSS è una soluzione composta da 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1mm MgCl 2, 20mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), succinato del sodio di 5 mM, 30 µM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA). Combinare tutto tranne l'EGTA, regolare il pH a 7,4. Aggiungere EGTA e regolare il pH a 7,4. Per 50 mL di media saggio aggiungere 0,5 mL di glucosio 1 mg/mL.
- Cellule HeLa di cultura in 500 cm 2 piastre Petri Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) in un incubatore con 5% CO 2 al 37 cellule di C. amplificare HeLa ° che crescono in un 100mm di Petri da semina li in una capsula di Petri 2 500 cm. Il volume totale media nel grande piatto è 115 mL. Ogni piatto grande resa di circa 18 milioni di cellule, abbastanza per due esperimenti di spettroscopia di fluorescenza.
- Crescere le cellule fino a quando raggiungono il 90-95% confluenza. Rimuovere i supporti e lavare le cellule con 15 mL di PBS pH 7.4. Aggiungere 15 mL di 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS e incubare per 10 minuti staccare le cellule. Trasferire le cellule a 14 mL fondo falcon tubi tondi
- contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro con un microscopio invertito e calcolare il numero totale delle cellule ed il volume dei mezzi necessari per raggiungere 7,5 milioni di cellule per 1,8 mL di volume del mezzo. Centrifugare le cellule per 10 min a 5310 × g. decantare il supernatante e aggiungere il volume calcolato di BGSS. Risospendere delicatamente le cellule.
- Per questo test, preparare soluzioni di riserva di digitonina 40mm in dimetilsolfossido (DMSO), 1 mM calcio verde-5N in H 2 O e 10 mM CaCl 2 in soluzioni di riserva di H 2 O. [Ru], preparati in acqua pura, può variare da 1-3 mM.
Nota: calcio verde-5N è sensibile alla luce. Conservare al buio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
- Per questo test, preparare soluzioni di riserva di digitonina 40mm in dimetilsolfossido (DMSO), 1 mM calcio verde-5N in H 2 O e 10 mM CaCl 2 in soluzioni di riserva di H 2 O. [Ru], preparati in acqua pura, può variare da 1-3 mM.
- Setup il fluorimetro per eccitare a 506 nm e leggere l'emissione a 532 nm con il cuvetta-titolare controllato a 37 ° C. Prepare una cuvetta acrilico con ancoretta o ruota, 1,8 mL di sospensione cellulare da 1.5.2 sopra, 1,8 µ l di soluzione di digitonina, 3.6 & #181; L calcio verde-5N (soluzione) e 9 µ l [Ru] (per la soluzione 1 mM, concentrazione finale di 5 µM). Incubare le cellule per 15 min nel fluorimetro.
- Leggere i dati come rapporto di eccitazione/emissione invece l'assorbimento crudo. Questa pratica riduce al minimo gli errori associati con le fluttuazioni dell'intensità della sorgente luminosa.
- Svolgere analisi del prima campione in assenza di [Ru] per misurare l'effetto dell'aggiunta di CaCl 2 sulla risposta delle cellule.
- Analisi Begin il fluorimetro con le impostazioni descritte 1.5.4. Attendere circa 2 minuti per stabilire una base di emissione stabile e quindi aggiungere 1,8 µ l di CaCl 2 (concentrazione finale di 10 µM). L'intensità di emissione aumenterà immediatamente dopo l'aggiunta di CaCl 2 e quindi decadrà nel corso dei minuti come gli ioni di calcio entra i mitocondri. Attendere che il decadimento ha terminato (≈ 5 min). Aggiungere i boli supplementare del calcio per determinare la risposta di assorbimento del calcio mitocondriale delle cellule non trattate con [Ru].
- In un'altra provetta contenente 5 µM [Ru], ripetere l'esperimento, come descritto in precedenza in 1.5.4.3. In presenza dell'inibitore, intensità di emissione farà aumentare, ma non decadere. Questa osservazione indica bloccato l'assorbimento del calcio mitocondriale.
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Representative Results
Questo metodo descrive una sintesi di calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partire da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un materiale di partenza ben noto ruthenium(III). [Ru (NH3)5Cl] CL2 è caratterizzato dalla spettroscopia IR, con modi vibrazionali a 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1e 798 cm-1 (Figura 1). Un'impurità minore a 2069 cm-1 può essere attribuita a [Ru (NH3)5N2] Cl3. La reazione di questa specie di Ru(III) con 1m NH4OH offre [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. Il progresso di questa reazione è testimoniato da un drammatico cambiamento di colore della soluzione da giallo a verde. La soluzione di reazione finale è di colore verde scuro. L'acidificazione di questa soluzione con HCl concentrato provoca un cambiamento di colore marrone; un sottoprodotto di questa neutralizzazione è cloruro di ammonio, che possono contaminare il prodotto finale, se la cura non è esercitato. Purificazione del composto procede tramite cromatografia di scambio cationico utilizzando resine a mesh fortemente acida (forma H+ ). La resina è equilibrata prima con 0.10 M HCl e la soluzione di [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 viene caricata sulla colonna. Il sottoprodotto di cloruro di ammonio eluisce con i lavaggi di HCl 1 M. Composti contenenti rutenio eluire alle più alte concentrazioni di HCl. Una serie di frazioni gialle, che contengono non reagiti [Ru (NH3)5Cl] Cl2 materiale di partenza, venire fuori la colonna quando la concentrazione di HCl è 1,5 M. Il prodotto desiderato eluisce tra 2,5-3,0 M HCl e le frazioni risultanti vengono visualizzati verde di colore verde-marrone.
Prima della messa in comune delle frazioni del prodotto, deve essere verificata la loro purezza. Perché mescola desiderata esibisce alcune pH-dipendenza nel suo spettro UV-vis, consigliamo di aggiungere piccole aliquote delle frazioni di altamente basici 3M NH3 soluzioni per garantire che le caratteristiche spettrali sono gli stessi per tutte le frazioni. Frazioni pure dovrebbero visualizzare solo un picco intenso a 360 nm e un debole picco a 600 nm (Figura 2). Picchi vicino a 533 e 480 nm indicano la presenza di rutenio marrone e rosso, rispettivamente e un picco significativo a 260 nm, con una spalla a 290 nm, significa la presenza di [Ru (NH3)5Cl] Cl2 (nella figura 3 il materiale di partenza ). Evaporazione rotativa di frazioni pure offre una mescola desiderata come un solido verde-marrone.
Il composto isolato può essere ulteriormente caratterizzato dalla spettroscopia IR e UV-vis. L'UV-vis spettro (Figura 2) consente di visualizzare la 360 nm e 600 nm assorbanza bande come descritto sopra. Il coefficiente di estinzione per la band di nm 600 è di 850 M-1cm-1 e per la band 360 nm è 27000 M-1cm-1. Il rapporto tra l'intensità della band 360 nm rispetto alla banda 600 nm deve essere 31 in PBS pH 7.4, e questa metrica può essere efficacemente utilizzata per valutare la purezza del composto. Lo spettro IR dovrebbe apparire come mostrato in Figura 4. La frequenza di stretching O-Ru-Ru, ad esempio, è diagnostica a 850 cm-1. Lo spettro IR è stato impiegato per determinare il tratto di Ru-O-Ru e garantire che cloruro di ammonio non era presente nel prodotto finale. Cloruro di ammonio, una comune impurità, ha modi vibrazionali al 1762 cm-1 (molto debole) e 1400 cm-1 (forte) che possono essere facilmente individuate dallo spettro IR (Figura 5). Rutenio rosso è un comune sottoprodotto della reazione e può essere identificato in IR dello spettro con tratti al 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 e 800 cm-1, anche se alcuni si sovrappongono con il prodotto desiderato si verificherà ( Figura 6).
La risposta di assorbimento del calcio in cellule HeLa di digitonina-permeabilized è osservata (Figura 7). Gli asterischi indicano l'aggiunta di un bolo di CaCl2 . In presenza di [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 un aumento nell'intensità di emissione è riscontrato al momento dell'aggiunta del calcio, ma nessun decadimento a causa del calcio mitocondriale l'assorbimento è osservato.
Figura 1 : Spettri infrarossi di [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Gli spettri infrarossi [Ru (NH3)5Cl] Cl2 con una molto piccolo [Ru (NH3)5N2] Cl3 impurità. La freccia rossa indica l'impurità a 2.069 cm-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Spettri UV-vis di rappresentante per materiale puro. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] Spettri di assorbanza di CL5 UV-vis e del vicino infrarosso (inserto) preso in PBS pH 7.4. Il coefficiente di estinzione per l'assorbanza principale a 360 nm è 27.000 M-1 cm-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Spettri UV-vis della miscela di reazione greggio. [(OH2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH2)] CL5 UV-vis gli spettri di assorbanza della miscela di reazione greggio prima purificazione presi in PBS pH 7.4. Le frecce rosse indicano le impurità più comuni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Rappresentante spettri infrarossi per materiale puro. Gli spettri infrarossi di [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. Il tratto di Ru-O-Ru è a 850 cm-1, altri tratti sono da3 oscillatori NH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 5 : Spettri infrarossi contenente impurità di NH4Cl. Gli spettri infrarossi di [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 con impurità di cloruro di ammonio. La freccia rossa indica cloruro di ammonio a 1.400 cm-1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Spettri infrarossi di rutenio commerciale rosso Lo spettro infrarosso di [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 (traccia nera) e commerciale rutenio rosso (linea rossa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Risultati di assorbimento del calcio rappresentativa. L'aumento di fluorescenza a causa dell'aggiunta di calcio per un cocktail di digitonina-permeabilized le cellule HeLa, calcio verde-5N e [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 in BGSS. Il vuoto contiene nessun [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 e fluorescenza diminuzione a causa di assorbimento di Ca2 + nei mitocondri può essere visto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il calcio mitocondriale assorbimento inibitore [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 può essere sintetizzato da [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un ruthenium(III) ben noto a partire del materiale, come descritto in questa procedura. La sintesi di [Ru (NH3)5Cl] Cl2 è realizzata prontamente con poca difficoltà. Dopo agitazione RuCl3 per 16 h in idrazina idrato, il pH della soluzione deve essere regolato su un valore di 2 con HCl. Il calo di pH è fondamentale per ottenere il prodotto desiderato. Se desiderato, questa sintesi può essere modificata a forma [Ru (NH3)5Br] Br2 di riflusso in HBr invece di HCl.
Abbiamo osservato alcune strategie per ridurre al minimo la formazione di sottoprodotti indesiderati durante la sintesi dell'inibitore assorbimento mitocondriale del calcio. In particolare, mantenere il matraccio capped è fondamentale per il successo di questa reazione; Se il pallone è aperto, un numero di altri sottoprodotti, compreso rutenio rosso (RuRed), si forma in quantità apprezzabili. Presumibilmente, ammoniaca gassosa viene persa dal vaso di reazione aperta e questa formazione di compromessi di evento del prodotto desiderato. La dimensione del pallone e il volume di ammoniaca acquosa sono anche parametri importanti che non devono essere modificati in modo significativo da quelli descritti nel presente protocollo, come abbiamo notato che l'efficienza di questa reazione è diminuito in recipienti più piccoli. Questo metodo non aumenta drasticamente la resa di questo composto rispetto agli altri due metodi che avevamo precedentemente comunicato. Esso, tuttavia, contengono meno passaggi e danno luogo alla formazione di prodotto meno laterale, ad esempio RuRed. La bassa resa può essere attribuita alla presenza di una piccola quantità di non reagiti [Ru (NH3)5Cl] Cl2 come pure ignoto altamente caricata le impurità che vengono mantenute nella parte superiore della colonna. Anche se non abbiamo esplorato molte condizioni di reazione aggiuntiva, è possibile che i miglioramenti possono essere realizzati variando il tempo di reazione e le concentrazioni dei reagenti, per ottenere rendimenti più alti.
La purificazione di [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 è la più noiosa e difficile parte del presente protocollo. Una colonna ben imballata sarà di grande aiuto nella separazione; la resina come dei residui di carico è un efficace approccio per confezionare la colonna. Si deve osservare che, come la concentrazione di HCl è aumentata nel corso dell'eluizione di colonna, la resina si contrarrà in dimensione. Per ottenere con successo materiale puro, il tasso al quale viene aumentata la concentrazione di acido non deve deviare dalla procedura indicata. Il prodotto finale sarà un solido verde-marrone; una soluzione di base sarà verde scuro ma soluzioni acide sarà marrone. Se si osserva una soluzione di colore rosa-rosso brillante, contaminazioni di rutenio rosso sono presenti. La quantità di RuRed può essere determinata utilizzando il coefficiente di estinzione (62.000 M-1ma-1 a 533 nm). Questo processo di purificazione è relativamente generale per le colonne di resina di scambio cationico forte.
L'inibizione di assorbimento del calcio mitocondriale possa essere testato utilizzando cellule HeLa permeabilized, il sensore fluorescente calcio calcio verde-5N e una spettrofluorimetro. 13 , 14 questo test richiede una grande quantità di cellule e di conseguenza necessitano di amplificazione della cultura in una molto grande 500 cm2 di Petri. Queste boccette di grande coltura impediscono ulteriori sfide nel ridurre al minimo la contaminazione microbica perché le superfici esposte sono molto grandi. Lavoro deve essere svolto in un'unità a flusso laminare per mantenere la sterilità. La risposta di fluorescenza del calcio verde-5N in cellule HeLa permeabilized è controllata dalla spettroscopia di fluorescenza. L'aggiunta di un bolo esterno di calcio per la cuvetta innesca un immediato aumento di fluorescenza, derivanti dagli ioni di calcio che interagiscono con il sensore. Nel corso di alcuni minuti in assenza di un inibitore, l'intensità decade dovuto l'assorbimento di questi ioni di calcio nel mitocondrio, un organello che non può essere letta dal colorante. Quando questo test è effettuato in presenza di un inibitore l'aggiunta di un bolo di ioni calcio dà luogo ad un aumento nell'intensità di emissione. Il deperimento dovuto l'assorbimento di calcio mitocondriale, tuttavia, non è presente, verificare le proprietà inibitorie di assorbimento di calcio mitocondriale di questo composto. Questo processo utilizzabile come un generale dello schermo per gli inibitori di assorbimento del calcio. Inoltre, questa procedura può essere applicata ad altre cellule eucariotiche di interesse. Questo test dipende la permeabilizzazione esterna della membrana cellulare così non fornisce informazioni circa la capacità di assorbimento cellulare di un complesso.
In sintesi, questo protocollo descrivono la sintesi e la purificazione di un inibitore di assorbimento di calcio mitocondriale di romanzo basato su rutenio. Questo composto è di notevole valore per studiare la biologia di calcio mitocondriale e suo ruolo nella fisiologia della cellula di mammiferi. Il dosaggio relativamente semplice per il test di assorbimento del calcio mitocondriale è anche d'uso per lo screening e la ricerca di nuovi inibitori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cornell University. Questo lavoro fatto uso del Cornell Center per servizi in comune ricerca materiali, che sono supportati tramite il programma NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. riconosce il sostegno di un NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka per assistenza con gli esperimenti di calcio. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom - similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
References
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
