Summary
이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.
Abstract
DNA 얼룩 메서드는 생물 의학 연구에 매우 중요 하다. 우리 설계 색된 침전의 형성에 의해 육안으로 DNA 시각화를 허용 하는 간단한 방법. 아크릴 아 미드를 몸을 담글 하 여 작동 또는 agarose DNA SYBR 녹색 1 x (2.0 µ M에 해당)의 해결책에 있는 젤 나 (SG 나) 보라색을 생성 하는 0.20 m m 블루 니트로 tetrazolium formazan 햇빛에 드러낼 때의 침전 또는 특별히 라이트 블루. 또한, DNA 복구 테스트가 우리의 방법으로 얼룩진 agarose 젤에는 암 피 실린 내성 플라스 미드를 사용 하 여 수행 되었습니다. 식민지의 많은 수와 함께 전통적인 보다 우리의 방법으로 얻은 SG를 사용 하 여 얼룩이 나 자외선 조명. 설명된 방법, 특정, 및 비-독성 DNA 검색, 시각화는 transilluminator 없이 "육안" 생체의 수 이며 저렴 하 고 필드 사용에 대 한 적절 한입니다. 이러한 이유로, 우리의 새로운 DNA 방법 얼룩이 지는 연구와 산업에 잠재적인 이점이 있습니다.
Introduction
생화학과 분자 생물학의 발전, DNA와 관련 된 연구는 DNA 분석을 더 나은 기술을 요구 했다. DNA 얼룩에 대 한 첫 번째 방법은 실버 얼룩, 매우 민감한 하지만 부족 선택 이었고 샘플 복구를 허용 하지 않습니다. 나중에, 형광 DNA 얼룩의 개발 샘플 복구의 가능성과 함께 DNA의 선택적 정량화를 허용. 첫 번째 형광 염료 DNA 정량화 사용 중 하나는 돌연변이2ethidium 평범한 사람1, 이었다.입니다. 그러나, 이제는 안전 하 고 더 민감한, GelRed, SYBR 녹색 등 향상 된 형광 염료 나 (SG 나)3; 그러나 모두 이러한 형광 염료의 자외선 (UV) transilluminator 또는 fluorimeter의 사용을 요구 한다.
가시 메 틸 렌 블루4 등 크리스탈 바이올렛5,6,7,,89, DNA, 얼룩에 대 한 다른 기술이 있다 하지만 이러한 모든 감소 된 감도에서 고통 및 선택도입니다. Tetrazolium 소금은 유기 화합물 감소, 취약 하 고이 경우 그들은 형성 된 불용 성 색된 formazan 침전10,11. 최근, 일부가 tetrazolium 소금 그들의 긍정적인 tetrazolium 반지12때문에 DNA에 바인딩할 표시 되었습니다.
최근 게시13, 얼룩 polyacrylamide 젤에서 DNA를 계량 하는 새로운 표시 기술 제안 했다, 니트로 블루 tetrazolium (NBT) 불리고 ethidium 평범한 사람, GelRed, 같은 형광 염료가 tetrazolium 소금의 감소를 사용 하 여 SYBR 녹색 어 SYBR 골드. 푸른 빛 또는 햇빛 있을 때 일을 하 고 향상 된 품질로 샘플 복구 허용이 반응에 비해 SG 사용 하 여 나 UV transilluminator와 함께. 이 문서의 목적은 tetrazolium를 사용 하 여 착 색 기술의 상세한 프로토콜 제공 하 염입니다.
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Protocol
1. 준비 하 고 실행 하는 젤
- 비 변성 시키기 12 %polyacrylamide 젤 젤 Sambrook와 러셀14 에 찾았지만 SDS 대신 물을 사용 하 여 나트륨 라우릴 황산 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제조 법을 사용 하 여 준비 합니다.
- 젤을 해결의 5 mL를 준비 하려면 1.7 mL 증류수, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 2 개 mL, 1.5 M Tris pH 8.8의 1.3 mL, 10% 염화 persulfate의 0.05 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다.
- 준비의 겹쳐 쌓이는 젤 2 mL 물 1.5 mL, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 0.33 mL, 1 M Tris pH 6.8의 0.25 mL, 10% 염화 persulfate, 0.02 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다. 젤의 크기는 7.3 c m x 8.2 c m 0.075 x cm (l x w x d).
참고: 0.75 m m 두께의 15 잘 빗을 사용 하 여 최고의 감도 대 한.
- 버퍼 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (6 x 로딩 버퍼 DNA 샘플의 5 µ L의예: 사용 1 µ L)에 DNA 샘플 로드 x 6의 적절 한 금액을 추가 합니다.
- 수직 전기 영동 챔버에 젤을 놓습니다.
- 2 젤을 실행 1 x TAE 버퍼의 750 mL 챔버를 채우십시오. 50의 1 리터를 준비 하기 x TAE, 트리 스 기지의 442 g, 빙 초 산의 57.1 mL 및 100 mL의 0.5 M EDTA pH 8 사용 하 여. 증류수 1 l.의 최종 볼륨을 추가
- 젤에서 샘플을 로드 합니다. 100 V 2 h에 젤을 실행 합니다.
- 또는, Sambrook14에서 제조 법을 사용 하 여 1 x TAE agarose 젤 준비.
- 1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 V에서 45 분 젤을 실행 합니다.
2. NBT SG 나 얼룩 (그림 1).
-
아크릴 아 미드 젤 얼룩입니다.
- 솔루션을 준비: 0.1 %w / v NBT 및 1.2 SG x 나.
참고: 그것은 ethidium 평범한 사람, GelRed 그리고 SYBR 골드 SG 대신 사용할 수, 하지만 SG 최상의 성능을 했다. - 1.2의 16.75 mL를 붓고 x SYBR 그린 나 적절 한 크기의 용기에 솔루션.
참고: 우리는 컨테이너, 피 펫 팁 상자 뚜껑을 사용 하 고 이러한 볼륨 커버 젤;이 컨테이너를 사용 하 여 계산 됩니다. 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l). - 솔루션에는 젤을 놓습니다. 0.2 m m NBT 주고 0.1 %w / v NBT 솔루션의 3.25 mL을 추가 및 1 x (2.0 µ M에 해당) SG 나 최종 농도.
- 플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.
참고: 플라스틱 필름 튀는 방지 하 고 얼룩 솔루션으로 알루미늄 호 일의 반응을 방지 하는 데 사용 됩니다. - 25 분 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.
- 알루미늄과 플라스틱 커버를 제거 합니다. 최대 90 분 동안 햇빛에 노출. 관심의 밴드 표시 될 때까지 5 분 마다 확인 합니다.
- 푸른 빛을 사용 하려면 3 발광 다이오드 (LED)와 protoboard를 준비 하 고 젤 표면 (표, 시간으로 얼룩 LED 광원의 강도에 따라 달라 집니다 필요)에서 약 5 m m Led를 배치 합니다.
- 솔루션을 준비: 0.1 %w / v NBT 및 1.2 SG x 나.
-
Agarose 젤 얼룩입니다.
- 준비 하 고 실행 하는 1 %agarose 젤 1.4 섹션에 설명 된 대로 후 (크기는 1 cm x 6.2 cm x 7 cm; l x w x d), 이러한 수정 2.1에서 동일한 단계를 수행:
- 1.2의 41.9 mL를 붓고 SG x 나 피 펫 팁 상자;의 뚜껑으로 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l). 0.1 %NBT 솔루션의 8.1 mL를 추가 합니다.
- 플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.
- 1 h 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.
3. 데이터 분석입니다.
-
NBT SG 나 보정 곡선.
- 1200 dpi에서 스캔 하 여 젤 이미지를 얻을.
- 이미지 분석을 위한 오픈 소프트웨어입니다. 이미지 편집기를 사용 하 여 이미지 직선 화. 이미지 densitometry를 실행 합니다.
- 곡선 아래 면적을 계산 합니다. DNA 농도 대 신호/신호최대 의 그래프를 준비 합니다.
4. DNA 복구입니다.
- 1에 1 %agarose 젤 준비 제조 법을 사용 하 여 x TAE Sambrook14에서 발견.
- 1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 ng / µ L pDJ10015 플라스 미드 DNA 사다리 구조 그림 2에 다음의 4 µ L을 로드 합니다. 100 V에 1 시간을 위한 젤을 실행 합니다.
- 표시와 두 2 mL microcentrifuge 튜브 무게.
- 젤을 두 개의 동일한 반쪽 위해서는 중간에 삭감. 각은 사다리 및 다른 얼룩 기법 비교 샘플 플라스 미드를 포함 해야 합니다. 그림 2에 도식 적인 표현이입니다.
- 얼룩 하나 절반 NBT SG 나 2 단계에서.
- 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드를 잘라. 젤 조각 한 튜브에 저장 하 고 무게.
- SG와 젤의 다른 부분에 얼룩이 나 1의 50 mL와 함께 SG x 나 솔루션 천천히 어둠 속에서 (60 rpm) 1 시간을 위한 젤을 흔들어.
- transilluminator에 젤을 놓고 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드 2 분 컷에 대 한 노출 합니다.
- 다른 튜브에 젤 조각을 저장 하 고 무게.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기-20 ° c.에 튜브를 유지 하면서
- 플라스 미드 추출 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
5. 플라스 미드 정규화입니다.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출 된 플라스 미드의 10 µ L와 내가 물 형식의 60 µ L를 추가 합니다. 믹스 60 µ L 석 영 cuvette에 전송 하거나는 Nanodrop에서 직접 2 µ L를 사용 하 여.
- 230 320 사이 흡수 스펙트럼을 측정 nm. 다음 수식을 사용 하 여 샘플의 플라스 미드 농도 계산.
여기서 D 는 적용 희석 요소 (이 경우에 그것은 70/10), Ax 는 x nm에서 흡수 하 고 50 µ g/ml dsDNA에 대 한 변환 인수입니다. - 9.1 ng / µ L를 희석 샘플입니다.
- 대장균 (대장균) 유능한 세포 (예: XL10 금) 변환 다음 희석 샘플의 5 µ L를 사용 하 여 이노우에 변환 절차16 .
- 배양 접시에 식민지의 수를 계산 하 고 희석 합니다. 다음 수식17:: 콜로 니 형성 단위 (CFU) 계산
여기서 D 는 초기 문화에서 적용 되는 희석 비율입니다. - 짝이 없는 t-검정을 수행 합니다.
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Representative Results
자주색 formazan 침전 (질량 분석13확인) DNA는 나타납니다. 실험에서 DNA 사다리 보정 곡선 (그림 3)을 로드 했습니다. 아크릴 및 agarose 젤에 대 한 프로토콜 작동 하지만 낮은 강도 있으며 agarose에서 더 긴 시간이 걸립니다. 그러나, agarose 젤의 사용 수 상용 키트를 사용 하 여 샘플의 복구 하 고 추출을 방해 하지 않습니다. 블루 Led와 함께이 메서드를 사용 하 여 복구 샘플 SG에 비해 더 나은 품질을가지고 나는 transilluminator (그림 4)를 사용 하 여.
그림 1. 회로도의 NBT SG 나 DNA 얼룩 및 정량화 분석. 단계: A. 추가 SG 어 젤에 NBT 솔루션. 2. 햇빛 또는 블루 빛 젤 노출. C. 1200 dpi에서 젤 스캐닝. 4. 이미지 프로세싱 밴드 강도를 소프트웨어에 의해 젤 이미지 분석. E. 데이터 음모를 꾸미고 농도 플롯에 대 한 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . DNA 복구 및 무결성 비교 분석 결과의 도식. A. DNA 전기 이동 법입니다. B. 절단 젤 두 조각으로. C. 2 개의 다른 착 색 방법으로 얼룩 (SG 어 NBT SG 나). D. 플라스 미드 DNA 밴드 밖으로 절단. E. DNA 젤 추출 키트를 사용 하 여 추출 프로시저. F. 분 광 광도 법 측정에 의해 DNA 정량화입니다. G. DNA 농도 정규화는 두 가지 방법 비교. H. 세균성 전이 샘플 정규화 I. 식민지 계산과 데이터 분석 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . NBT SG i:를 사용 하 여 1500 bp에서 DNA의 보정 곡선 12.5 %polyacrylamide 젤 DNA 사다리의 다른 농도와 로드. 젤 100 V 1에 2 시간에 실행 했다 x TAE. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 나는 transilluminator 및 NBT SG i: SG와 DNA 사이의 변환 효율의 비교 시각 pDJ100 플라스 미드 1 %agarose 젤에 로드 하 고 100 V 1 h 1에서에 실행 되었다 x TAE. 그런 다음 젤 2 개 반에 삭감 되었다. 1 반 어 NBT SG와 젤의 다른 반쪽 SG로 얼룩진 했다 나. 플라스 미드 밴드 다음 젤 젤 추출 키트를 사용 하 여에서 추출 되었다. 마지막으로, 추출 된 플라스 미드 정규화 하 고 대장균 유능한 세포를 변환 하는 데 사용 했다. 변환 n 실시 했다 = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
소설과 민감한 DNA 방법 얼룩 NBT의 감소 및이 문서에서 제시 했다 SG의 사용에 따라. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 NBT SG에 젤의 부 화 시간이 나 솔루션 및 NBT의 농도. Agarose 젤에 대 한 착 시간 agarose 젤 큰 두께 때문에 아크릴 아 미드 젤에 대 한 이상 이다. 이 메서드는 NBT 그것 접촉 침전으로 SDS 존재 잘 작동 하지 않습니다. 젤 보라색 배경 얻습니다, 경우 다른 젤 준비는 것이 좋습니다 및 빛의 노출 시간을 줄이기 위해. Agarose 젤은 스테인드 하는 경우 충분 한 감도 아니다 빛의 노출 시간을 증가 하는 것이 좋습니다. 감도의 부족 젖 침전은 젤에 존재 하는 경우이 SDS 오염의 결과 수 있습니다. 이 경우, 새로운 젤을 준비 하 고 착 색 시 약을 추가 하기 전에 그것을 씻어.
파란색 LED 또는 햇빛에서 자연적으로 블루 빛 현재의 빛에서 제공 하는 여부는 강수량 블루 빛 조명에 의해 발생 합니다. 이 때문에, 기술의 한계는 광원 이다. 거기 아무 광원, 파란색 광원 필요한 경우, 광원은 균질 경우 비교를 할 수는 없습니다 그리고, 같은 이유로 그것은 정량화 할 수 없습니다. 그러나, 결과 다소 사용 광원에 따라 있을 것입니다. 광원은 일치 하는 경우 (예: 일 또는 비 균질 블루 광원 중 햇빛의 강도에 변화), 비교를 직접 할 더 어려울 것 이다 제복 또는 다른 다른 샘플의 정량화 번입니다.
이 메서드는 필드 사용에 대 한 이상적 DNA를 시각화 하기 위해 특별 한 계측을 필요 하지 않습니다. 양적 결과 대 한 한 고해상도 카메라 또는이 작품에서 보여 줬던 오피스 스캐너를 사용할 수 있습니다.
아마도 두 개의 다른 얼룩 기법을 사용 하 여 다른 생체의 얼룩과 결합 하 여 미래에이 기법을 확장 하 고 하겠습니다 (예: NBT SG Coomassie와 나) 동일한 젤에.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품, Fondo 나시오날 드 개발 Científico y Tecnológico (Fondecyt), 칠레, 프로젝트 11130263 (CW)에, NERC 프로젝트 CONICYT + 프로그램이 드에 의해 지원 되었다 (CW)에 Colaboración 국제 PCI-PII20150073 및 Vicerrectoría de에서 U-inicia Investigación 대학 데 칠레 (CW)입니다.
Ciencias Químicas y를 박사 호르헤 Babul 그리고 디에고 Quiroga-로저 유용한 토론, 원고 및 주소 드 extensión 드 라 Facultad 드 수정에 대 한 로버트 Lesch에 대 한이 프로젝트의 초기 단계에 있는 도움에 대 한 타 호텔 팔 마에 감사 합니다. 칠레 대학에서에서 Farmacéuticas입니다. 마르셀 페 레 스는 비디오 편집을 제공 하는 음성-텍스트 및에 롤 왓슨 해결을 위한 닐 스티븐 스 너무 감사.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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