Summary
Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA'ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.
Abstract
DNA boyama yöntemleri Biyomedikal Araştırma için çok önemlidir. Biz DNA görselleştirme çıplak gözle renkli bir çökelti oluşumunu sağlayan basit bir yöntem tasarlanmıştır. Akrilamid ıslatarak çalışır veya özel DNA SYBR yeşil 1 x (2.0 µM için eşdeğer) bir çözümde jel ben (SG ben) ve bir mor üretir 0.20 mM nitro mavi tetrazolium güneş ışığına maruz formazan, çökelti veya özellikle mavi ışık. Ayrıca, DNA kurtarma testleri bizim yöntemi ile lekeli bir özel jel Ampisilin dayanıklı bir plazmid kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Koloniler daha çok sayıda geleneksel ile bizim yöntemiyle elde edildi SG kullanarak boyama ben ultraviyole aydınlatmalı. Açıklanan yöntemi hızlı, belirli ve biomolecules bir transilluminator olmadan "çıplak gözle" görselleştirme izin DNA tespiti için toksik olmayan ve ucuz ve alan kullanımına uygun. Bu nedenlerden dolayı bizim yeni DNA'ları boyama yöntemi araştırma ve sanayi için potansiyel yararları vardır.
Introduction
Biyokimya ve moleküler biyoloji geliştirmelerle DNA'yla çalışmaları daha iyi teknikleri DNA analiz etmek için gerekli. DNA boyama için belgili tanımlık ilk yöntem gümüş boyama, hangi çok hassas ama yoksun seçicilik ve örnek kurtarma izin vermez. Daha sonra floresan DNA boyama geliştirme örnek kurtarma imkanı ile DNA'ın miktar seçici izin. DNA miktar için kullanılan ilk floresan boyalar etidyum bromür1, mutajenik2olan biriydi. Ancak, şimdi orada daha güvenli ve daha hassas, GelRed ve SYBR yeşil gibi geliştirilmiş floresan boyalar ben (SG ben)3; Ama bütün bu floresan boyalar bir ultraviyole (UV) transilluminator veya fluorimeter kullanımı gerektirir.
DNA, metilen mavisi4 ve kristal violet5,6,7,8,9gibi gözle görülür boyama diğer tekniği vardır, ama tüm-in bunlar azaltılmış hassasiyeti muzdarip ve seçicilik. Tetrazolium tuzları organik bileşikler azaltılması için duyarlı ve bu durumda onlar çözünmez bir formu ve renkli formazan çökelti10,11. Son zamanlarda, bazı bivalent tetrazolium tuzları için DNA nedeniyle onların olumlu tetrazolium halkaları12bağlamak için gösterilmiştir.
Bir son yayın13' te, nitro mavi tetrazolium (NBT) ve floresan boyalar gibi etidyum bromür, GelRed denilen bir bivalent tetrazolium tuz azaltma kullanarak leke ve DNA polyacrylamide jeller ölçmek için yeni bir görünür teknik önerilmiş, SYBR yeşil ben ve SYBR altın. Mavi ışık veya güneş ışığı huzurunda çalıştı ve kalite ile örnek kurtarma izin bu reaksiyon ben ile UV transilluminator SG kullanımına kıyasla. Bu kağıt tetrazolium boyama tekniği detaylı bir protokol sağlar tuzlar hedefidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması ve jel çalıştıran
- Sambrook ve Russell14 ' te bulundu ama su SDS yerine kullanarak Sodyum Lauryl Sülfat-Polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) tarifi kullanarak sigara denaturing % 12 polyacrylamide jel jelleri hazırlayın.
- 5 mL jel çözme hazırlamak için 1.7 mL distile su, 2 mL Akrilamid/BIS Akrilamid (%30/0,8 w/v), 1,5 M Tris pH 8.8 1.3 mL, 0.05 mL % 10 amonyum persülfat ve TEMED 0.002 mL kullanın.
- Yığın jel 2 mL hazırlamak için 1,5 mL su, Akrilamid/BIS Akrilamid (%30/0,8 w/v) 0.33 mL, 1 M Tris pH 6.8 0.25 mL, 0,02 mL % 10 amonyum persülfat ve TEMED 0.002 mL kullanın. 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 boyutlardır jel cm (l x g x d).
Not: 15 iyi tarak 0,75 mm kalınlıkta en iyi duyarlılık için kullanın.
- Tampon ve DNA örneği 1.5 mL microcentrifuge Tube (örneğin 6 x yükleme arabelleği için DNA örneği 5 µL kullanım 1 µL) yükleme x 6 uygun miktarda ekleyebilirsiniz.
- Jel Dikey Elektroforez odasına koyun.
- Odası 2 jelleri çalıştırmak için 1 x TAE arabellek 750 mL ile doldurulması. 1 L 50 hazırlamak için x TAE, 442 g Tris tabanının, buzul asetik asitin 57.1 mL ve 100 mL 0.5 M EDTA pH 8 kullanın. 1 L. son bir hacim için distile su ilave
- Jel örneklerinde yükleyin. Jel 100 V 2 h için çalıştırın.
- Alternatif olarak, 1 x TAE özel jel Sambrook14' te bulunan tarifi kullanarak hazırlayın.
- 1 300 mL ekleyin x TAE yatay Elektroforez odasına. 45 dk için jel 100 V çalıştırın.
2. NBT-SG ben boyama (şekil 1).
-
Akrilamid boyama jel.
- Çözümler hazırlamak: % 0,1 w/v NBT ve 1.2 x SG ben.
Not: Etidyum bromür, GelRed ve SYBR altın SG yerine kullanmak mümkündür ama SG en iyi performansı vardı. - 1.2 16.75 mL dökün x SYBR çözüm uygun büyüklükte bir konteyner içine ben yeşil.
Not: Kapsayıcı olarak bir pipet ucu kutusunun kapağı kullandık ve bu birimlerin bu kapsayıcı'ı kullanarak jel kapsayacak şekilde hesaplanır; onun boyutlardır 11,6 cm x 7,6 cm x 2.6 cm (l x g x d). - Jel çözümde yerleştirin. 3.25 mL % 0,1 w/v NBT çözeltisi 0.2 mM NBT vermek ekleyin ve 1 x (2.0 µM için eşdeğer) SG ben son konsantrasyonları.
- Plastik film ile konteyner mühür ve tamamen kapsayıcı herhangi bir ortam ışığı engellemek için alüminyum folyo ile sarın.
Not: Plastik film sıçramasına önlemek ve alüminyum folyo ile boyama çözüm reaksiyonu önlemek için kullanılır. - Orbital Çalkalayıcı 60 RPM üzerinde 25 min için salla.
- Alüminyum ve plastik kapağı çıkarın. İçin 90 dk en fazla güneş ışığına maruz. Grubun ilgi görünene kadar her 5 dakikada kontrol edin.
- Mavi ışık kullanmak için bir protoboard 3 ışık - yayan diyot (LED) ile hazırlamak ve jel yüzey (sürekli olarak zaman boyama LED ışık kaynağı yoğunluğuna bağlıdır onay) 5 mm LED yerleştirin.
- Çözümler hazırlamak: % 0,1 w/v NBT ve 1.2 x SG ben.
-
Özel boyama jel.
- Sonra hazırlama ve % 1'özel çalışan 1.4 bölümlerinde açıklandığı gibi jel (boyutlardır 1 cm x 6.2 cm x 7 cm; l x w x d), 2.1 Bu değişiklikleri ile olduğu gibi aynı adımları izleyin:
- 1.2 41,9 mL dökün SG x ben çözüm içine kapağı bir pipet ucu kutusunun; onun boyutlardır 11,6 cm x 7,6 cm x 2.6 cm (l x g x d). 8.1 mL %0,1 NBT çözeltisi ekleyin.
- Plastik film ile konteyner mühür ve sonra tamamen kapsayıcı herhangi bir ortam ışığı engellemek için alüminyum folyo ile sarın.
- Orbital Çalkalayıcı 60 rpm'de 1 h için salla.
3. veri analizi.
-
NBT-SG ben kalibrasyon eğrileri.
- Jel görüntüleri 1200 dpi çözünürlükte tarama yoluyla elde edilir.
- Açık Yazılım görüntü analizi için. Bir resim editörü kullanarak görüntüleri düzleştirin. Bir görüntü Dansitometresi çalıştırın.
- Eğri altındaki alan hesaplamak. Bir grafik sinyal/sinyalMax DNA toplama karşı hazırlamak.
4. DNA kurtarma.
- 1 ' % 1'özel jel hazırlamak tarifi kullanarak x TAE Sambrook14' te bulundu.
- 1 300 mL ekleyin x TAE yatay Elektroforez odasına. 100 ng/µL pDJ10015 Plazmid ve Şekil 2' de verilen düzeni takip DNA merdiven 4 µL yükleyin. 1 h için jel 100 V çalıştırın.
- Mark ve iki 2 mL microcentrifuge tüp tartın.
- Jel iki özdeş yarısı için ortadan kesti. Her biri merdiven ve farklı boyama teknikleri karşılaştırmak için örnek plazmid bulunması gerekmektedir. Şekil 2' de şematik bir gösterimidir.
- Bir leke yarım NBT-SG ile ben olduğu gibi adım 2.
- Temiz bir neşter kullanarak plazmid bant kesme. Bir tüp jel parça kaydedin ve tartmak.
- Jel SG ile diğer parçası leke ben 1 50 mL ile SG x ben çözüm ve yavaş yavaş (60 rpm) 1 h için jel karanlıkta sallamak.
- Bir transilluminator jel yerleştirin ve temiz bir neşter kullanarak plazmid grup dışarı 2 dk. kesim için maruz.
- Diğer tüp jel parça kaydedin ve tartmak.
Not: Protokol burada-20 ° C'de tüpler tutarken duraklatılmış
- Bir ticari jel ekstraksiyon kiti kullanarak plazmid ayıklama taşımak.
5. plazmid normalleştirme.
- 1.5 mL microcentrifuge tüp ayıklanan plazmid 10 µL ve ben su türü 60 µL ekleyin. Mix ve transfer 60 µL kuvars küvet veya 2 µL doğrudan bir Nanodrop kullanın.
- Ölçmek soğurma spektrumları arasında 230-320 nm. Örnek'ın plazmid konsantrasyonu aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
D uygulanan seyreltme faktörü nerede (Bu durumda 70/10 's), Ax x nm emme ve 50 µg/ml dsDNA için dönüştürme faktörü. - 9.1 ng/µL örnekleri sulandırmak.
- Escherichia coli (e.coli) yetkili hücreleri (örneğin XL10 altın) dönüştürmek 5 µL seyreltik örneği kullanarak Inoue dönüştürme yordamı16 takip.
- Koloniler Petri yemekler üzerinde saymak ve seyreltme unutmayın. Koloni oluşturan birimler (CFU) aşağıdaki formül17: ile hesapla
D ilk kültüründen uygulanan seyreltme faktörü nerede. - Bir unpaired t-Testi gerçekleştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mor formazan çökelti DNA olduğu (kütle spektrometresi13tarafından doğrulanmadı) görünür. Deneyde, bir DNA merdiven bir kalibrasyon eğrisi (şekil 3) yapmak için yüklendi. Protokol Akrilamid ve özel tırnaklar için jeller çalışır, ancak daha düşük bir şiddeti vardır ve özel daha uzun bir zaman alır. Ancak, piyasada bulunan bir seti kullanarak örnek kurtarma özel jelleri kullanılmasına ve ayıklama ile müdahale değil. Yeniden elde etmek istimal bu yöntem ile mavi LED'ler örnekleri için SG kıyasla daha kaliteli var ben bir transilluminator (şekil 4) kullanarak.
Şekil 1. Şematik, NBT-SG I DNA boyama ve miktar analizi. Adımlar şunlardır: A. ekleme SG ben ve jel NBT çözümler. B. güneş ışığı ya da mavi ışık jöleye açığa. C. jel 1200 dpi çözünürlükte tarama. Ö. tarafından bir görüntü işleme yazılımı bant yoğunluğu elde etmek için jel görüntü analiz. E. veri toplama arsa karşı bir yoğunluk içinde çizme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . DNA kurtarma ve bütünlük karşılaştırma testin şematik. A. DNA Elektroforez. B. kesme jel iki parçalar halinde. C. iki farklı boyama yöntemi ile boyama (SG ben ve NBT-SG ben). Ö plazmid DNA bant kesme. E. DNA ekstraksiyon kiti kullanarak çıkarma yordamı jel. F. DNA miktar spectrophotometry ölçüm tarafından. G. DNA toplama normalleştirme iki yöntem karşılaştırmak için. H. normalleştirme ı. koloni sayımı ve veri analizi sonra bakteriyel dönüştürme örnekleri ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . NBT-SG ı: kullanarak 1500 bp, DNA'ın kalibrasyon eğrisi % 12,5 polyacrylamide jeller DNA merdiven farklı konsantrasyonları ile yüklü. Jelleri 100 V 1 2 h için koşmak x TAE. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Dönüşüm verimliliği arasında DNA karşılaştırılması görselleştirildiği SG ile ben ve bir transilluminator ve NBT-SG ı: pDJ100 plazmid % 1'özel jel içinde yüklü ve 100 V 1 1 h için çalıştırmak x TAE. O zaman jel içinde iki yarım kesilmiş. Yarım ben ve diğer yarısı jel NBT-SG ile lekeli SG ile ben. Plazmid bant sonra bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak jel ayıklandı. Son olarak, ayıklanan plazmid normalleştirilmiş ve E. coli yetkili hücreleri dönüştürmek için kullanılan. Dönüştürmeleri n yapılmıştır = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Duyarlı ve roman yöntemi boyama DNA NBT azalma ve bu makalede sunulan SG kullanımı temel. Bu iletişim kuralı için kritik adım jel NBT-SG kuluçka zamanı ben çözüm ve NBT konsantrasyonu. Boyama için özel jelleri özel jelleri büyük kalınlığı nedeniyle Akrilamid tırnaklar için jeller daha uzun zamanı. NBT bu temas precipitates gibi bu yöntem de SDS huzurunda çalışmıyor. Jel mor bir arka plan alırsa, biz başka bir jel hazırlıklı olmak tavsiye ve ışık pozlama süresini azaltmak için. Eğer bir özel jel lekeli ve yeterince duyarlı değil, ışık çekim hızı artırmak için önerilir. Duyarlılık eksikliği ve altındaydı bir çökelti jel içinde varsa, bu SDS kirlenme sonucu olabilir. Bu durumda, yeni bir jel hazırlamak ve boyama reaktifler eklemeden önce durulayın.
Yağış mavi ışık aydınlatma tarafından mavi LED veya güneş ışığı mavi ışık mevcut doğal ışık tarafından sağlanan olup olmadığını oluşur. Bu nedenle, bir tekniği ışık kaynağı kısıtlamasıdır. Orada hiçbir ışık kaynağı, mavi bir ışık kaynağı gerekirse ve ışık kaynağı homojen değilse, bir karşılaştırma yapmak mümkün değildir ve aynı sebepten dolayı bu miktar yapmak mümkün değil. Ancak, elde edilen sonuçlar biraz kullanılan Işık kaynağına bağlı olacaktır. Işık kaynağı tutarlı değilse ya da üniforma (karşılaştırmalar doğrudan yapmak daha zor olacaktırörneğin güneş ışığı gün veya homojen olmayan mavi ışık kaynağı sırasında yoğunluğunu değişiklikler nedeniyle), ya da miktar itibariyle farklı farklı örnekleri kez.
Bu yöntem alan kullanım için ideal hale DNA, görselleştirmek için özel araçları gerek yoktur. Nicel sonucu elde etmek için bir yüksek çözünürlüklü bir fotoğraf makinesi veya bu çalışmada gösterildiği bir office tarayıcı kullanabilirsiniz.
Biz muhtemelen diğer biomolecules iki farklı boyama teknikleri kullanarak boyama ile birleştirerek bu teknik gelecekte genişletmek umut (örneğin NBT-SG ben Coomassie ile) aynı jel içinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser desteklenen Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Şili, (CW için) proje 11130263, proje CONICYT + NERC + Programa de tarafından Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (için CW) ve U-inicia: Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (CW için).
Tatiana Naranjo-Palma için Ciencias Químicas y Dr. Jorge Babul ve Diego Quiroga-Roger yararlı tartışma, el yazması ve Dirección de extensión de la Facultad de gözden geçirilmesi için Robert Lesch için bu projenin ilk aşaması yardım için teşekkür Universidad de Chile üzerinden Farmacéuticas. Marcelo video düzenleme için Pérez ve Neil Stevens ses sağlamak için metin ve Errol Watson düzeltmek için çok teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
