Summary
这种方法允许选择性染色和量化的 DNA 在凝胶中浸泡在 SYBR 绿 I/硝基蓝唑溶液, 然后暴露在阳光或蓝光光源。这会产生明显的沉淀, 几乎不需要任何设备, 这使得它非常适合于现场使用。
Abstract
DNA 染色方法是生物医学研究的重要内容。我们设计了一个简单的方法, 使 DNA 可视化到肉眼的形成一个有色沉淀。它的工作原理是浸泡丙烯酰胺或琼脂糖 DNA 凝胶在 1x (相当于2.0 µM) SYBR 绿色 i (SG i) 和0.20 毫米硝基蓝唑, 产生紫色沉淀的甲时暴露在阳光或特别蓝光。此外, 使用我们的方法染色的琼脂糖凝胶中的氨苄西林抗性质粒进行 DNA 恢复试验。用我们的方法获得的菌落数量比传统的紫外光照射法更大。所描述的方法是快速的, 特异的, 无毒的 DNA 检测, 允许生物分子的可视化, "肉眼" 没有一个 transilluminator, 是廉价和适当的现场使用。由于这些原因, 我们新的 DNA 染色方法对研究和工业都有潜在的好处。
Introduction
随着生物化学和分子生物学的进步, 涉及 dna 的研究需要更好的技术来分析 dna。DNA 染色的第一个方法是银染色, 这是非常敏感的, 但缺乏选择性, 不允许样品回收。后来, 荧光 dna 染色的发展使 dna 的选择性定量与样品的回收率的可能性。第一种用于 DNA 定量的荧光染料是溴溴化物1, 它是诱变性的2。然而, 现在有改进的荧光染料, 更安全, 更敏感, 如 GelRed 和 SYBR 绿色 i (SG i)3;但所有这些荧光染料都需要使用紫外线 (UV) transilluminator 或 fluorimeter。
还有其他技术可明显染色的 DNA, 如亚甲基蓝4和晶体紫5,6,7,8,9, 但所有这些都受到降低灵敏度和选择性.唑盐是有机化合物易受减少, 当这发生他们形成一个不溶性和色的甲沉淀10,11。最近, 一些二价唑盐被证明绑定到 DNA 由于其阳性唑环12。
在最近的出版物13中, 提出了一种在聚丙烯酰胺凝胶中染色和量化 DNA 的新的可见技术, 它使用了一种叫做硝基蓝唑 (NBT) 的二价唑盐和荧光染料, 如溴溴化物, GelRed,SYBR 绿我和 SYBR 金。这种反应是在蓝光或阳光的存在下进行的, 与使用紫外线 transilluminator 的 SG I 相比, 可以提高样品的回收率。本文的目的是提供一个详细的协议的染色技术使用唑盐。
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Protocol
1. 凝胶的制备和运行
- 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds 页) 在理查德·山姆布鲁克和罗素14中发现的不变性12% 聚丙烯酰胺凝胶的配方, 但使用水代替 sds。
- 要准备5毫升的溶解凝胶, 使用1.7 毫升蒸馏水, 2 毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (30/0.8% 瓦特/五), 1.3 毫升1.5 米的 pH 8.8, 0.05 毫升的10% 硫酸铵, 和0.002 毫升的 TEMED。
- 准备2毫升的堆叠凝胶使用1.5 毫升水, 0.33 毫升丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (30/0.8% 瓦特/五), 0.25 毫升1米的 pH 6.8, 0.02 毫升的10% 硫酸铵, 和0.002 毫升的 TEMED。凝胶的尺寸是7.3 厘米 x 8.2 cm x 0.075 cm (l x w x d)。
注意:使用15井梳子的0.75 毫米厚度的最佳灵敏度。
- 将适当数量的6x 载入缓冲液和 dna 样本添加到1.5 毫升的离心管 (例如使用1µL 的6x 加载缓冲区到5µL 的 dna 样本)。
- 将凝胶置于垂直电泳室。
- 用750毫升的1x 泰缓冲器填充会议厅, 以运行2凝胶。准备1升50x 泰, 使用442克的三基地, 57.1 毫升的冰醋酸, 100 毫升的0.5 米 EDTA pH 8。将蒸馏水加到最后一卷1升。
- 将样品装入凝胶中。在100伏的2小时运行凝胶。
- 或者, 用理查德·山姆布鲁克14中发现的配方制备1x 泰琼脂糖凝胶。
- 将300毫升的1x 泰加到水平电泳室。运行凝胶45分钟, 在 100 v
2. NBT-SG I 染色 (图 1)。
-
丙烯酰胺凝胶染色。
- 准备解决方案: 0.1% 瓦特/v NBT 和 1.2x SG i。
注意:它可以使用溴溴化物, GelRed 和 SYBR 黄金代替 sg i, 但 sg 我有最好的表现。 - 将16.75 毫升的 1.2x SYBR 绿色 I 溶液倒入合适大小的容器中。
注意:我们使用吸管尖端盒的盖子作为容器, 并且这些容量被计算用这个容器盖胶凝体;它的尺寸是 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm (l x w x d)。 - 将凝胶放入溶液中。添加3.25 毫升的0.1% 瓦特/v NBT 溶液给0.2 毫米 NBT 和 1x (相当于2.0 µM) SG I 最终浓度。
- 用塑料薄膜封住容器, 用铝箔将容器完全包裹起来, 以阻挡任何环境光线。
注意:该塑料薄膜用于防止飞溅, 避免铝箔与染色液的反应。 - 在 60 rpm 的轨道振动筛上摇动25分钟。
- 拆卸铝塑盖。暴露在阳光下90分钟最大。检查每5分钟, 直到感兴趣的波段出现。
- 要使用蓝光, 准备一个 protoboard 与3发光二极管 (led) 和地方的 led 约5毫米从凝胶表面 (检查染色连续, 因为需要的时间将取决于强度的 LED 光源)。
- 准备解决方案: 0.1% 瓦特/v NBT 和 1.2x SG i。
-
琼脂糖凝胶染色。
- 在准备和运行1% 琼脂糖凝胶, 如1.4 节 (尺寸是1厘米 x 6.2 厘米 x 7 厘米; l x w x d), 按照相同的步骤, 在2.1 与这些修改:
- 倒入41.9 毫升的 1.2x SG I 溶液进入吸管尖端盒的盖子;它的尺寸是 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm (l x w x d)。添加8.1 毫升的 0.1% NBT 溶液。
- 用塑料薄膜封住容器, 然后用铝箔将容器完全包裹起来, 以阻挡任何环境光。
- 在 60 rpm 的轨道振动筛上晃动1小时。
3. 数据分析。
-
NBT-SG I 校准曲线。
- 通过扫描 1200 dpi 获得凝胶图像。
- 用于图像分析的开放式软件。使用图像编辑器对图像进行伸直。运行图像密度测量。
- 计算曲线下的面积。准备一个信号/信号Max与 DNA 浓度的关系图。
4. DNA 恢复。
- 使用理查德·山姆布鲁克14中发现的配方, 在1x 泰秀中准备1% 琼脂糖凝胶。
- 将300毫升的1x 泰加到水平电泳室。在图 2中给出的方案之后, 加载4µL 100 ng/µL pDJ10015质粒和 DNA 阶梯。运行1小时的凝胶 100 v
- 马克和重量两2毫升离心管。
- 把凝胶切成中间, 以便有两个相同的一半。每一个都应该包含阶梯和样品质粒来比较不同的染色技术。示意图表示形式在图 2中。
- 染色一半与 NBT-SG I 如在步骤2。
- 用干净的手术刀切出质粒带。将凝胶片保存在一根管子内并称重。
- 染色的其他部分与 sg i 50 毫升的 1x sg i 溶液和缓慢晃动 (60 rpm) 在黑暗中的1小时凝胶。
- 将凝胶放在 transilluminator 上, 并暴露2分钟, 用干净的手术刀把质粒带出来。
- 将凝胶片保存在另一管中, 称量。
注意:该协议可以暂停在这里, 而保持在-20 ° c 的管。
- 使用商业凝胶萃取试剂盒进行质粒提取。
5. 质粒正常化。
- 在1.5 毫升离心管, 添加10µL 提取质粒和60µL I 型水。混合和转移到60µL 石英试管或使用2µL 直接在 Nanodrop。
- 测量吸收光谱在230到320毫微米之间。使用以下公式计算样品的质粒浓度:
其中D是应用的稀释因子 (在本例中为 70/10), Ax 是在x nm 上吸收的, 50 是用于 dsDNA 的µg/mL 的转换因子。 - 稀释样品至 9.1 ng/µL。
- 转换大肠杆菌(大肠杆菌) 有能力的细胞 (如XL10 金) 在井下转换过程16使用5µL 稀释样品。
- 计算培养皿上菌落数并注意稀释。使用以下公式计算菌落形成单元 (CFU)17:
其中, D是从初始区域性应用的稀释因子。 - 执行不配对 t 检验。
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Representative Results
一个紫色的甲沉淀出现在 DNA 的位置 (通过质谱13验证)。在实验中, 加载了一个 DNA 阶梯来制作一个校准曲线 (图 3)。该协议适用于丙烯酰胺和琼脂糖凝胶, 但它的强度较低, 在琼脂糖中需要较长的时间。然而, 使用琼脂糖凝胶允许回收样品使用一个商业可用的试剂盒, 它不干扰的提取。与 SG I 使用 transilluminator (图 4) 相比, 使用此方法与蓝色发光二极管恢复的样品质量更好。
图 1。NBT-SG I DNA 染色和定量分析的示意图.步骤是: a. 添加 SG I 和 NBT 溶液的凝胶。把凝胶暴露在阳光下或蓝光下。c. 在 1200 dpi 处扫描凝胶。通过图像处理软件对凝胶图像进行分析, 得到波段强度。在强度与集中图上绘制数据。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.DNA 恢复和完整性比较分析示意图.A. DNA 电泳。把胶切成两块。c. 用两种不同染色方法染色 (sg i 和 NBT-sg i)。d. 切出质粒 DNA 带。利用萃取试剂盒提取 DNA 凝胶的方法。用分光光度法测定 DNA 的定量。DNA 浓度归一化比较两种方法。h. 标准化后的细菌转化 i. 菌落计数和数据分析。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.1500 bp NBT-SG I: 12.5% 聚丙烯酰胺凝胶的 dna 标定曲线。凝胶是运行在100伏2小时, 在1x 泰。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.用 sg i 和 transilluminator 和 NBT-sg i 的 DNA 可视化转化效率的比较: pDJ100 质粒在1% 琼脂糖凝胶中加载, 在1x 泰的100伏处运行1小时。然后, 凝胶被切成两半。其中一半被染色与 sg i 和其他一半的凝胶与 NBT-SG i。然后用凝胶萃取试剂盒从凝胶中提取质粒带。最后, 提取的质粒被规范化, 并用于转化为大肠杆菌的合格细胞。转换被执行了 n = 3。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本文介绍了一种灵敏、新颖的基于 NBT 还原的 DNA 染色方法及其在 SG I 中的应用。该协议的关键步骤是凝胶在 NBT-SG I 溶液中的孕育时间和 NBT 的浓度。琼脂糖凝胶的染色时间比丙烯酰胺凝胶更长, 因为琼脂糖凝胶的厚度更大。这种方法在 SDS 存在时不能很好地与 NBT 沉淀物接触。如果凝胶获得紫色的背景, 我们建议准备另一种凝胶, 并减少曝光时间。如果琼脂糖凝胶是染色和没有足够的灵敏度, 建议增加光曝光时间。如果缺乏敏感性和乳白色沉淀存在于凝胶中, 这可能是 SDS 污染的结果。在这种情况下, 准备一个新的凝胶和冲洗之前, 添加染色试剂。
降雨雪发生由蓝色光照明, 是否提供由蓝色 LED 的光或蓝色光当前自然地在阳光下。由于这一点, 技术的局限性是光源。如果没有光源, 需要蓝色光源, 如果光源不均匀, 就不可能进行比较, 而且出于同样的原因, 不可能进行量化。然而, 所得到的结果将有点依赖于所使用的光源。如果光源不一致或不均匀 (例如由于白天光照强度的变化或非均质蓝光光源), 则在不同的样品上进行直接比较或定量化比较困难。次.
这种方法不需要特殊的仪器来可视化 DNA, 这使它的理想的现场使用。对于定量结果, 可以使用高分辨率相机或办公室扫描仪, 如本工作所示。
我们希望通过使用两种不同的染色技术 (如NBT-SG I 与马斯亮) 在同一凝胶中, 将其与其他生物分子的染色结合起来, 以便将来扩展这项技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了基金发展 Científico y Tecnológico (科技), 智利, 项目 11130263 (cw), 项目会 + NERC + 方案 de Colaboración 国际 PCI-PII20150073 (对 cw) 和 U inicia 从 Vicerrectoría de智利研究大学 (对 CW)。
感谢纳兰霍-帕尔马在这个项目的初始阶段的帮助, Dr. 巴布尔和迭基罗加-罗杰为有益的讨论, 罗伯特 Lesch 修订手稿和总署 de extensión Facultad 德 Ciencias Químicas yFarmacéuticas 来自智利大学。也感谢马塞洛佩雷斯的编辑视频和尼尔史蒂文斯为纠正文本和沃尔华提供的声音-结束。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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