Summary
Denne metoden kan selektiv flekker og kvantifisering av DNA i gelé av soaking gel i en SYBR grønn jeg / Nitro blå Tetrazolium løsningen og deretter avslørte det sollys eller en blå lyskilde. Dette gir en synlig utløse og krever nesten ingen utstyr, gjør det ideelt for feltbruk.
Abstract
DNA flekker metoder er svært viktig for biomedisinsk forskning. Vi laget en enkel metode som tillater DNA visualisering for det blotte øye med dannelsen av en farget utløse. Det fungerer ved å nyte akrylamid eller agarose DNA gel i en løsning av 1 x (tilsvarer 2.0 µM) SYBR Green jeg (SG jeg) og 0.20 mM nitro blå tetrazolium som produserer en lilla føre til formazan når de utsettes for sollys eller spesielt blått lys. Også ble DNA utvinning tester utført med en ampicillin motstandsdyktig plasmider i en agarose gel med vår metode. Et større antall kolonier ble hentet med vår metode enn med tradisjonelle flekker med SG med ultrafiolett belysning. Metoden beskrevet er rask, bestemt og ikke-giftig for DNA deteksjon, slik at visualisering av biomolecules til "blotte øye" uten en transilluminator, og er rimelig og egnet for feltbruk. For disse grunner har vår nye DNA flekker metoden fordeler til både forskning og industri.
Introduction
Med fremskritt innen biokjemi og molekylærbiologi, har studier med DNA nødvendig bedre teknikker for å analysere DNA. Den første metoden for DNA flekker var sølv flekker, som er svært følsomme men mangler selektivitet og tillater ikke prøve gjenoppretting. Senere tillatt utvikling av fluorescerende DNA flekker selektiv kvantifiseringen DNA med mulighet for eksempel utvinning. En av de første fluorescerende fargestoffer brukes for DNA kvantifisering var ethidium bromide1, som er mutagent2. Men nå det er forbedret fluorescerende fargestoffer som er sikrere og mer følsomme, som GelRed og SYBR Green jeg (SG jeg)3; men alle disse fluorescerende fargestoffer krever bruk av en ultrafiolett (UV)-transilluminator eller fluorimeter.
Det er andre teknikker for synlig flekker DNA, som methylene blåfarge4 og crystal violet,5,,6,,7,,8,,9, men alle disse lider av redusert følsomhet og selektivitet. Tetrazolium salter er organiske forbindelser utsatt for reduksjon, og når dette skjer de danner en uløselig og farget formazan føre til10,11. Nylig har noen bivalent tetrazolium salter vist å binde til DNA på grunn av deres positive tetrazolium ringer12.
I en fersk publikasjon13, ble en ny synlig teknikk flekken og kvantifisere DNA i polyakrylamid gels foreslått, med reduksjon av et bivalent tetrazolium salt kalt nitro blå tetrazolium (NBT) og fluorescerende fargestoffer som ethidium bromide, GelRed, SYBR grønne jeg og SYBR gull. Denne reaksjonen jobbet i nærvær av blått lys eller sollys og tillatt prøve gjenoppretting med bedre kvalitet forhold til bruk av SG jeg med en UV-transilluminator. Målet med denne utredningen er å gi detaljert protokollen flekker teknikken bruker tetrazolium salter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forbereder og kjører Gel
- Forberede de ikke-denaturing 12% polyakrylamid gel gels med natrium Dodecyl Sulfate-polyakrylamid Gel geleelektroforese (SDS-side) oppskriften i Sambrook og Russell14 men bruk av vann istedenfor SDS.
- For å forberede 5 mL løse gel, bruke 1,7 mL destillert vann, 2 mL av akrylamid/bis akrylamid (30/0,8% w/v), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10% ammonium persulfate og 0.002 mL av TEMED.
- For å forberede bruke 2 mL stabling gel 1,5 mL vann, 0,33 mL av akrylamid/bis akrylamid (30/0,8% w/v), 0,25 mL 1 M Tris pH 6.8, 0.02 mL 10% ammonium persulfate og 0.002 mL av TEMED. Gel er 7.3 cm x 8.2 cm x 0.075 cm (l x b x d).
Merk: Bruk en 15 godt kam av 0,75 mm tykkelse for beste sensitiviteten.
- Legg til passende mengder av 6 x lasting buffer og DNA-prøve slik 1,5 mL microcentrifuge (f.eks bruk 1 µL av 6 x lasting buffer 5 µL av DNA-prøve).
- Plass gel i loddrett geleelektroforese kammeret.
- Fyll kammeret med 750 mL 1 x TAE buffer kjøre 2 gels. Å forberede 1 L 50 x TAE, bruke 442 g Tris base, 57.1 mL iseddik og 100 mL 0,5 M EDTA pH 8. Legge destillert vann til et endelig antall 1 L.
- Laste inn eksemplene i gel. Kjøre gel på 100 V for 2T.
- Alternativt kan du forberede en 1 x TAE agarose gel med oppskriften i Sambrook14.
- Legge til 300 mL 1 x TAE til vannrette geleelektroforese kammeret. Kjør gel for 45 min 100 V.
2. NBT-SG jeg flekker (figur 1).
-
Akrylamid Gel flekker.
- Utarbeide løsninger: 0,1% w/v NBT og 1.2 x SG jeg.
Merk: Det er mulig å bruke ethidium bromide, GelRed og SYBR gull i stedet for SG jeg, men SG jeg hadde den beste ytelsen. - Hell 16.75 mL 1.2 x SYBR grønne jeg løsningen i en beholder av passende størrelse.
Merk: Vi brukte lokket av en pipette tips boks som en beholder, og disse volumene beregnes gel bruker denne beholderen; dens dimensjoner er 11,6 cm x 7,6 cm x 2.6 cm (l x b x d). - Plass gel i løsningen. Legge til 3,25 mL 0,1% w/v NBT løsning å gi 0.2 mM NBT og 1 x (tilsvarer 2.0 µM) SG jeg endelig konsentrasjoner.
- Sel beholderen med plastfolie, og helt wrap beholderen med aluminiumsfolie blokkere noen omgivelseslys.
Merk: Plastfilmen brukes å forebygge spruting og unngå reaksjon av aluminiumsfolie med flekker løsning. - Rist for 25 min på en orbital shaker på 60 rpm.
- Fjern aluminium og plastdekselet. Utsettes for sollys i 90 min maksimal. Sjekk hver 5 min til bandet av interesse vises.
- For å bruke blått lys, forberede en protoboard med 3 Light - Emitting Diodes (LED) og plasser lysdioder cirka 5 mm fra gel overflaten (sjekk den flekker kontinuerlig, som nødvendig avhengig av intensiteten av LED-lyskilde).
- Utarbeide løsninger: 0,1% w/v NBT og 1.2 x SG jeg.
-
Agarose Gel flekker.
- Når forbereder og kjører en 1% agarose gel som beskrevet i delene 1.4 (er 1 cm x 6.2 cm x 7 cm; l x b x d), følg de samme trinnene som i 2.1 med disse endringene:
- Hell 41,9 mL 1.2 x SG jeg løsningen i lokket på en pipette tips boksen. dens dimensjoner er 11,6 cm x 7,6 cm x 2.6 cm (l x b x d). Legg 8.1 mL 0,1% NBT løsning.
- Sel beholderen med plastfolie, og deretter helt pakke beholderen med aluminiumsfolie blokkere noen omgivelseslys.
- Riste 1t på en orbital shaker på 60 rpm.
3. dataanalyse.
-
NBT-SG jeg kalibrering kurver.
- Skaff gel bilder ved å skanne i 1200.
- Åpen programvare for bildeanalyser. Rett opp bilder ved hjelp av bilderedigeringsprogrammet. Kjøre et bilde densitometry.
- Beregn arealet under kurven. Forberede en graf av Signal/SignalMax versus DNA konsentrasjon.
4. DNA utvinning.
- Forberede en 1% agarose gel i 1 x TAE med oppskriften funnet i Sambrook14.
- Legge til 300 mL 1 x TAE til vannrette geleelektroforese kammeret. Laste inn 4 µL av 100 ng/µL pDJ10015 plasmider og DNA stige etter ordningen i figur 2. Kjør gel 1t 100 V.
- Merke og veie to 2 mL microcentrifuge rør.
- Kuttet gel på midten for å ha to identiske halvdeler. Hver bør inneholde stigen og eksempel plasmider å sammenligne de forskjellige teknikkene som flekker. Et skjematisk oppsett er i figur 2.
- Flekk en halv med NBT-SG jeg som i trinn 2.
- Kuttet ut plasmider bandet bruker ren skalpell. Lagre gel stykket i en tube og veier.
- Flekk den andre delen av gel med SG med 50 mL 1 x SG jeg løsning og sakte rist (60 rpm) gel 1t i mørket.
- Plasser gel på en transilluminator og utsette for 2 min. kutt ut plasmider bandet bruker ren skalpell.
- Lagre gel stykket i andre røret og veier.
Merk: Protokollen kan pauses her samtidig rør på 20 ° C.
- Utføre plasmider utvinning bruker en kommersiell gel utvinning kit.
5. plasmider normalisering.
- I en 1,5 mL microcentrifuge tube, legge 10 µL av utdraget plasmider og 60 µL av typen jeg vann. Blanding og overføre til 60 µL kvarts søppel eller bruke 2 µL direkte i en Nanodrop.
- Måle absorpsjon spectra mellom 230 til 320 nm. Beregne prøvens plasmider konsentrasjon bruker følgende formel:
der D er fortynningsfaktoren brukt (i dette tilfellet det er 70/10), Ax er absorpsjonen på x nm og 50 er omregningsfaktoren til µg/mL for dsDNA. - Fortynne prøver å 9.1 ng/µL.
- Transformere Escherichia coli (E. coli) kompetente celler (f.eks XL10 gull) etter Inoue transformasjon fremgangsmåte16 bruker 5 µL av fortynnet prøve.
- Antall kolonier på Petri retter og Merk fortynning. Beregne den kolonien danner enheter (CFU) med de følgende formel17:
der D er fortynningsfaktoren brukt fra den første kulturen. - Utføre en kort t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lilla formazan utløse vises der DNA ligger (bekreftet av massespektrometri13). Eksperimentet var en DNA stige lastet for å gjøre en kalibreringskurven (Figur 3). Protokollen fungerer for både akrylamid og agarose gels, men den har en lavere intensitet og tar lengre tid i agarose. Men bruk av agarose gels gjør at gjenvinning av prøven ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit, og det påvirke ikke utvinning. Prøvene kommet til hektene benytter denne metoden med blå lysdioder har en bedre kvalitet sammenlignet SG jeg bruker en transilluminator (Figur 4).
Figur 1. Skjematisk av NBT-SG I DNA flekker og kvantifisering analyse. Trinnene er: A. legge SG jeg og NBT løsninger gel. B. utsette gel sollys eller blått lys. C. skanning gel i 1200. D. analysere gel bildet av en bildebehandling programvare for å få band intensitet. E. plotte dataene i en intensitet versus konsentrasjon tomten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Skjematisk av DNA utvinning og integritet sammenligning analysen. A. DNA geleelektroforese. B. kutte gel i to deler. C. farging i to forskjellige metoder for flekker (SG jeg og NBT-SG jeg). D. kutte ut plasmider DNA bandet. E. DNA gel utvinning prosedyre bruker utvinning kit. F. DNA kvantifisering av spectrophotometry måling. G. DNA konsentrasjon normalisering å sammenligne de to metodene. H. bakteriell transformasjon med prøvene etter normalisering I. kolonien teller og dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Kalibreringskurven DNA på 1500 bp bruker NBT-SG I: 12,5% polyakrylamid gels lastet med ulike konsentrasjoner av DNA stigen. Gels ble kjørt 100 V for 2t i 1 x TAE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Sammenligning av transformasjon effektivitet mellom DNA visualisert med SG jeg og transilluminator og NBT-SG I: pDJ100 plasmider ble lagt i en 1% agarose gel og kjøre 100 V 1t i 1 x TAE. Deretter ble gel kuttet i to halvdeler. En halv var farget med SG jeg og annen halvdelen av geléen med NBT-SG jeg. Plasmider bandet ble deretter Hentet fra gel med en gel utvinning kit. Endelig var det utdraget plasmider normalisert og brukes til å transformere E. coli kompetent celler. Transformasjonene ble utført n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En følsom og romanen DNA flekker metode basert på reduksjon av NBT og bruk av SG jeg ble presentert i denne artikkelen. Det kritiske trinnet i denne protokollen er den inkubasjon tiden av gel i NBT-SG jeg løsning og konsentrasjonen av NBT. Den flekker agarose gels er lenger enn til akrylamid gels på grunn av større tykkelsen på agarose gels. Denne metoden fungerer ikke bra i nærvær av SDS som NBT precipitates i kontakt med den. Hvis gel får en lilla bakgrunn, anbefaler vi at en annen gel være forberedt og redusere lys eksponeringstid. Hvis en agarose gel er farget, og det er ikke nok følsomhet, anbefales det å øke lyseksponering. Hvis det er en mangel på sensitivitet og en opaliserende bunnfall finnes i gel, kan dette være resultatet av SDS forurensning. I så fall forberede en ny gel og skyll den før du legger til farging reagenser.
Nedbør oppstår ved blå lys belysning, om levert av lyset fra et blå LED eller blått lys finnes naturlig i sollys. Fordi dette er en begrensning av teknikken lyskilden. Hvis det ikke lyskilden, en blå lyskilde er nødvendig, og hvis lyskilden ikke er ensartet, det er ikke mulig å gjøre en sammenligning, og for samme grunn er det ikke mulig å gjøre kvantifisering. Resultatene vil imidlertid være avhengig lyskilden brukes. Hvis lyskilden ikke er forenlig eller uniform (f.eks skyldes endringer i intensiteten av sollys på dagtid eller ikke-homogene blå lyskilde), blir det vanskeligere å direkte sammenligninger eller kvantifisering av ulike eksempler på forskjellige ganger.
Denne metoden trenger ikke spesielle instrumentering for å visualisere DNA, gjør det ideelt for feltbruk. Kvantitative resultater, kan man bruke en høy oppløsning kamera eller en office-skanner som ble vist i dette arbeidet.
Vi håper å utvide denne teknikken i fremtiden ved eventuelt kombinere det med den flekker av andre biomolecules ved hjelp av to ulike flekker teknikker (f.eks NBT-SG med Coomassie) i samme gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, Project 11130263 (til CW), prosjektet CONICYT ++ NERC Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (til CW) og U-inicia fra de Vicerrectoría Investigación Universidad de Chile (til CW).
Takk til Tatiana Naranjo-Palma for hjelp i den innledende fasen av dette prosjektet, Dr. Jorge Babul og Diego Quiroga-Roger nyttig informasjon, Robert Lesch for revisjon av manuskriptet og Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas fra Universidad de Chile. Takk også til Marcelo Pérez for redigering av video og Neil Stevens for å korrigere tekst og Errol Watson for å gi voice-over.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
