Summary
Этот метод позволяет селективного окрашивания и количественного определения ДНК в гелях путем замачивания геля в зеленом SYBR я / нитро синий Tetrazolium решения и затем подвергая его солнечного света или синий источник света. Это создает видимый преципитат и почти не требует оборудования, что делает его идеальным для использования на местах.
Abstract
ДНК пятная методы очень важны для биомедицинских исследований. Мы разработали простой метод, который позволяет визуализировать ДНК невооруженным глазом формирование цветные преципитат. Она работает путем замачивания акриламида или агарозы дна гель в растворе 1 x (эквивалент 2,0 мкм) SYBR зеленый я (SG я) и 0,20 мм нитро синий tetrazolium, которая производит фиолетовый осадка из Формазаны при воздействии солнечного света или специально синий свет. Кроме того восстановление ДНК были проведены с использованием ампициллина устойчивостью плазмида в агарозном геле, окрашенных с нашим методом. Большее количество колоний был получен с нашим методом чем с традиционными окрашивание с помощью SG я с ультрафиолетовым освещением. Описан метод быстро, конкретные и нетоксичные для обнаружения ДНК, позволяя визуализации биомолекул «невооруженным глазом» без transilluminator и недорогой и подходит для использования в полевых. По этим причинам наши новые ДНК, окрашивание метод имеет потенциальные выгоды для научных исследований и промышленности.
Introduction
С достижениями в биохимии и молекулярной биологии исследования, с участием ДНК требуют более совершенных методов для анализа ДНК. Первый метод для окрашивания ДНК был серебряный пятнать, который очень чувствителен, но не хватает избирательности и не позволяют пример восстановления. Позже развитие флуоресцентные окрашивание ДНК допускается селективный количественного определения ДНК с возможностью восстановления образца. Одним из первых флуоресцентных красителей, используемых для количественного определения ДНК был бромид ethidium1, который является мутагенным2. Однако, теперь есть улучшение флуоресцентных красителей, которые являются более безопасным и более чувствительными, такие как GelRed и SYBR зеленый я (SG я)3; но все эти флуоресцентных красителей требуют использования ультрафиолетового (УФ) transilluminator или fluorimeter.
Существуют другие методы для пятнать заметно ДНК, например4 Метиленовый синий и фиолетовый кристалл5,6,,78,9, но все они страдают от пониженную чувствительность и избирательность. Tetrazolium соли органических соединений восприимчивы к сокращению и когда это происходит, они образуют нерастворимые и цветные Формазаны осадок10,11. Недавно было показано некоторые соли двухвалентной tetrazolium связываются с ДНК из-за их позитивные tetrazolium кольца12.
В недавней публикации13была предложена новая техника видимых пятен и количественного анализа ДНК в полиакриламидных гелей, используя сокращение соли двухвалентной tetrazolium под названием nitro синий tetrazolium (NBT) и флуоресцентных красителей как бромид ethidium, GelRed, SYBR зеленый, я и SYBR золото. Эта реакция работал в присутствии синий свет или солнечного света и позволило пример восстановления с улучшенным качеством по сравнению с использованием SG я с УФ transilluminator. Цель настоящего документа – представить подробный протокол окрашивание техники с использованием tetrazolium солей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка и запуск гель
- Подготовьте гели Денатурирующий гель полиакриламида 12% с помощью рецепта натрия Додециловый сульфат-Полиакриламид-гель электрофореза (SDS-PAGE) в Sambrook и Рассел14 , но использование воды вместо SDS.
- Подготовить 5 мл решения гелем, используйте 1,7 мл дистиллированной воды, 2 мл акриламида/бис акриламида (30/0,8% w/v), 1,3 мл 1,5 М трис рН 8,8, 0,05 мл 10% Персульфат аммония и 0,002 мл TEMED.
- Для подготовки 2 мл штабелируя гель использовать 1,5 мл воды, 0,33 мл акриламида/бис акриламида (30/0,8% w/v), 0,25 мл 1 М трис рН 6,8, 0,02 мл 10% Персульфат аммония и 0,002 мл TEMED. Размеры геля являются 7.3 x 8.2 см x 0,075 см (l x w x d).
Примечание: Расческой 15 хорошо толщиной 0,75 мм для лучших чувствительность.
- Добавьте необходимое количество 6 x загрузки буфера и образец ДНК в 1,5 мл microcentrifuge трубку (например использование 1 мкл 6 x загрузки буфера 5 мкл пример ДНК).
- Место в зале вертикального электрофореза геля.
- Заполните камеры с 750 мл 1 x TAE буфера для запуска 2 гели. Подготовить 1 Л 50 x TAE, 442 g Tris база, 57,1 мл уксусной кислоты кристаллизированной и 100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8. Долейте дестилированную воду до окончательного объемом 1 л.
- Загрузите образцы в геле. Побегите гель на 100 V 2 h.
- Кроме того Подготовьте 1 x TAE агарозном геле с помощью рецепт в Sambrook14.
- Добавить 300 мл 1 x TAE в палату горизонтального электрофореза. Побегите гель для 45 мин на 100 V.
2. Национальный банк Таджикистана SG я окрашивание (рис. 1).
-
Пятнать геля акриламида.
- Подготовка решения: 0.1% w/v НБТ и 1.2 x SG я.
Примечание: Это позволяет использовать бромид ethidium, GelRed и SYBR золото вместо SG я, но SG, я имел лучшую производительность. - Налить 16,75 мл 1,2 x SYBR зеленый я решение в контейнер соответствующего размера.
Примечание: Мы использовали крышку коробки наконечник пипетки как контейнер, и эти тома рассчитываются для покрытия гель, с помощью этого контейнера; его размеры составляют 11,6 х 7,6 см x 2,6 см (l x w x d). - Поместите гель в решении. Добавить 3.25 мл 0,1% раствора НБТ w/v дать 0,2 мм НБТ и 1 x (эквивалент 2,0 мкм) SG я окончательного концентрации.
- Печать контейнер с пластиковой пленкой и полностью обернуть контейнер с алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать любой освещенности.
Примечание: Пластиковой пленки используется для предотвращения разбрызгивания и избежать реакции алюминиевой фольги с окрашивание раствора. - Трясти за 25 мин на орбитальный шейкер на 60 об/мин.
- Удалите, алюминиевые и пластиковые покрытия. Подвергайте воздействию солнечного света в течение 90 минут максимум. Проверяйте каждые 5 мин до тех пор, пока появится полоса интерес.
- Чтобы использовать синий свет, подготовить печатную с 3 светоизлучающие диоды (СИД) и поместите светодиоды около 5 мм от поверхности геля (проверьте окрашивание непрерывно, как время необходимо будет зависеть от интенсивности светодиодный источник света).
- Подготовка решения: 0.1% w/v НБТ и 1.2 x SG я.
-
Гель агарозы пятная.
- После того, как подготовка и запуск агарозы 1% гель, как описано в разделах 1.4 (размеры являются 1 x 6,2 см x 7 cm; l x w x d), выполните те же действия, как и 2.1 с этими изменениями:
- Налить 41.9 мл 1,2 x SG я решение в крышке ящика наконечник пипетки; его размеры составляют 11,6 х 7,6 см x 2,6 см (l x w x d). Добавление 8.1 мл 0,1% раствора НБТ.
- Печать контейнер с пластиковой пленкой, а затем полностью обернуть контейнер с алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать любой освещенности.
- Трясти за 1 час на орбитальный шейкер на 60 об/мин.
3. анализ данных.
-
НБТ SG я калибровочных кривых.
- Получите гель изображения путем сканирования на 1200 dpi.
- Открытое программное обеспечение для анализа изображений. Выпрямление изображений с помощью редактора изображений. Запустите образ денситометрия.
- Вычислите площадь под кривой. Подготовьте графикМакс сигнал/сигнал против концентрации ДНК.
4. ДНК восстановления.
- Подготовить гель агарозы 1% в 1 x TAE с помощью рецепт найден в Sambrook14.
- Добавить 300 мл 1 x TAE в палату горизонтального электрофореза. Загрузка 4 µL 100 нг/мкл pDJ10015 плазмиды и лестница ДНК по схеме на рисунке 2. Побегите гель на 1 ч в 100 V.
- Марк и весят 2 пробки microcentrifuge 2 мл.
- Вырежьте гель посередине для того чтобы иметь две одинаковых половинки. Каждый из них должен содержать лестница и образец плазмида сравнить различные методы окраски. Схематическое представление находится на рисунке 2.
- Выведение одной половины с НБТ-SG я как в шаге 2.
- Вырежьте плазмиды группы с помощью чистой скальпель. Сохраните часть геля в одной из труб и весят.
- Пятно с другой частью гель с SG с 50 мл 1 x SG я решения и медленно взболтать (60 об/мин) гель для 1 h в темноте.
- Гель на transilluminator и выставить 2 мин вырезать из плазмиды группы с помощью чистой скальпель.
- Сохраните часть геля в другую трубу и весят.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, сохраняя трубы при-20 ° C.
- Выполнения извлечения плазмида с помощью комплекта извлечения коммерческих гель.
5. плазмида нормализации.
- В пробки microcentrifuge 1,5 мл добавьте 10 мкл извлеченные плазмиды и 60 мкл типа, которую я воды. Mix и передать Кюветы кварцевые 60 мкл или использовать 2 мкл непосредственно в Nanodrop.
- Измерение спектров поглощения между 230-320 нм. Вычислите образца плазмида концентрации с использованием следующей формулы:
где D — это применяется коэффициент разрежения (в данном случае это 70/10), Аx — поглощение x Нм, и 50 является коэффициент пересчета в мкг/мл для dsDNA. - Развести образцы 9.1 нг/мкл.
- Трансформировать сведущие клетки Escherichia coli (E. coli) (например XL10 золото) после16 Иноуэ процедура преобразования с использованием 5 мкл разбавленного образца.
- Подсчитать количество колоний на чашки Петри и отмечаем разрежения. Вычислить единиц образуя колонии (CFU) с следующие формулы17:
где D — коэффициент разрежения, применяется от первоначальной культуры. - Выполните непарных t тест.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Фиолетовый Формазаны преципитат появляется, где находится ДНК (Проверено13масс-спектрометрия). В эксперименте лестница ДНК был загружен сделать калибровочной кривой (рис. 3). Протокол работает для акриламида и агарозы гели, но она имеет снижение интенсивности и занимает больше времени в агарозы. Однако использование гелей агарозы позволяет восстановления образца с помощью коммерчески доступных комплект, и он не вмешиваться с добычей. Проб, взятых с помощью этого метода с голубыми светодиодами имеют лучшее качество по сравнению с SG я с помощью transilluminator (рис. 4).
Рисунок 1. Схема НБТ-SG I ДНК окрашивание и количественной оценки анализ. Эти шаги являются: A. Добавление SG я и NBT решения гелем. B. предоставление гель солнечного света или синий свет. C. Проверка геля на 1200 dpi. D. анализ геля изображения путем обработки изображений программное обеспечение для получения группы интенсивности. E. печати данных в интенсивности против концентрации сюжет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Схема анализа сравнение восстановления и целостности ДНК. А. ДНК электрофорез. B. резки гель на две части. C. окрашивание с двумя различными методами окрашивания (SG я и NBT-SG я). D. вырезания плазмида ДНК группы. E. процедура извлечения гель ДНК с помощью извлечения kit. F. ДНК количественная оценка методом спектрофотометрии измерения. G. ДНК концентрации нормализации для сравнения этих двух методов. H. бактериальных преобразование с образцами после нормализации I. колонии подсчета и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Калибровочная кривая ДНК на 1500 bp с помощью НБТ-SG I: 12,5% полиакриламидных гелей загружен с различной концентрации ДНК лестницы. Гели были запущены на 100 V 2 h в 1 x TAE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Сравнение эффективности преобразования между ДНК визуализированы с SG я и transilluminator и NBT-SG I: плазмида pDJ100 был загружен в гель агарозы 1% и запустить на 100 V на 1 ч в 1 x TAE. А затем гель было разрезать на две половинки. Одна половина был окрашенных с SG я и другая половина геля с НБТ-SG я. Плазмиды группы затем был извлечен из геля, используя набор для извлечения геля. Наконец извлеченные плазмида нормализованы и используется для преобразования компетентных клеток кишечной палочки . Преобразования были проведены n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чувствительных и Роман окрашивания методом ДНК на основе сокращения НБТ и использование SG, в этой статье был представлен. Важным шагом в этом протоколе это время инкубации геля в НБТ-SG я решение и концентрация НБТ. Время окрашивания гелей агарозы дольше акриламида гели из-за большей толщины Гели агарозы. Этот метод не работает хорошо в присутствии SDS как НБТ осаждается в контакте с ним. Если гель получит Фиолетовый фон, мы рекомендуем подготовить другой гель и сократить время воздействия света. Если витражи геля агарозы и не является достаточно чувствительность, рекомендуется увеличить время воздействия света. Если есть отсутствие чувствительности и опалесцирующая преципитат присутствует в гель, это может быть результатом загрязнения SDS. В этом случае подготовить новый гель и промывать перед добавлением окрашивание реагентов.
Высыпание происходит путем синий свет освещение, поставляемые свет синий светодиод или синего света присутствует ли естественно в солнечном свете. В связи с этим ограничением методики является источником света. Если там нет источника света, синий источник света, и если источник света не является однородной, это не возможно сделать сравнение, и по той же причине, это не возможно сделать количественную оценку. Однако полученные результаты будет несколько зависит от источника света используется. Если источник света не соответствует или uniform (например из-за изменений в интенсивности солнечного света в течение дня или неоднородность синий источник света), это будет более трудно прямых сравнений или количественной оценки различных образцов на различных уровнях раз.
Этот метод не нужно специального инструментария визуализировать ДНК, что делает его идеальным для использования на местах. Для количественные результаты можно использовать с высоким разрешением камеры или сканера office, как показано в этой работе.
Мы надеемся расширить эту технику в будущем, возможно, сочетая его с пятная других биомолекул с использованием двух различных методов окрашивания (например НБТ-SG с Кумасси) в том же гель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана парке Fondo Nacional de Desarrollo Científico y (НФНТИ), Чили, проект 11130263 (для CW), проекта НКНТИ + НКРЭ Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (для CW) и U-inicia от Vicerrectoría де Инвестигасьон Универсидад де Чили (по часовой стрелке).
Спасибо Татьяна Наранхо-Пальма за помощь на начальном этапе этого проекта, д-р Хорхе Babul и Диего Кирога-Роджер для полезной дискуссии, Роберт Lesch для пересмотра рукопись и Dirección de extensión de la факультет de Ciencias по y Farmacéuticas от Универсидад де Чили. Спасибо слишком Марсело Перес для редактирования видео и Нил Стивенс для исправления текста и Эррол Уотсон для предоставления голос за кадром.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
