Summary
Este método permite la coloración selectiva y cuantificación de DNA en geles sumergiendo el gel en un SYBR Green I / solución Nitro azul de tetrazolio y luego exponerlo a la luz del sol o una fuente de luz azul. Esto produce un precipitado visible y no requiere casi ningún equipo, haciéndolo ideal para uso de campo.
Abstract
Métodos de tinción de ADN son muy importantes para la investigación biomédica. Hemos diseñado un método sencillo que permite la visualización de ADN a simple vista por la formación de un precipitado coloreado. Actúa empapando la acrilamida o agarosa ADN del gel en una solución de 1 x (equivalente a 2.0 μm) SYBR Green I (SG I) y 0,20 mM nitro blue tetrazolium que produce una púrpura precipitar de precipitado cuando se expone a la luz solar o específicamente la luz azul. También, se realizaron pruebas de recuperación de ADN usando un plásmido resistente a ampicilina en un gel de agarosa teñido con nuestro método. Se obtuvo un mayor número de colonias con nuestro método que tradicional que manchaba usando SG con iluminación ULTRAVIOLETA. El método descrito es rápido, específico y no tóxico para la detección de ADN, permitiendo visualización de biomoléculas a "simple vista" sin un transiluminador y es barato y apropiado para el uso del campo. Por estas razones, nuestro ADN nueva tinción tiene beneficios potenciales para la investigación y la industria.
Introduction
Con los avances en Bioquímica y biología molecular, los estudios de ADN han exigido mejores técnicas para analizar el ADN. El primer método para la tinción de ADN fue plata coloración, que es muy sensible, pero carece de selectividad y no permite recuperación de muestra. Más tarde, el desarrollo de la tinción fluorescente del ADN permitió la cuantificación selectiva de DNA con la posibilidad de recuperación de la muestra. Uno de los primeros tintes fluorescentes utilizados para la cuantificación de ADN fue de bromuro de etidio1, que es mutagénico2. Sin embargo, ahora hay mejores tintes fluorescentes que son más seguros y más sensibles, como GelRed y SYBR Green I (SG I)3; pero todos estos tintes fluorescentes requieren el uso de un transiluminador (UV) ULTRAVIOLETA o un Fluorímetro.
Existen otras técnicas de tinción visiblemente ADN, tales como azul de metileno4 y cristal violeta5,6,7,8,9, pero todos ellos sufren de disminución de la sensibilidad y selectividad. Las sales de tetrazolio son susceptibles a la reducción de compuestos orgánicos y cuando esto sucede forman un insoluble y formazan coloreado precipitado10,11. Recientemente, algunas sales de tetrazolio bivalente se han demostrado para atar al ADN debido a sus anillos de tetrazolio positivo12.
En una reciente publicación13, se propuso una nueva técnica visible mancha y cuantificar ADN en geles de poliacrilamida, mediante la reducción de una sal de tetrazolio bivalente se llama nitro azul tetrazolio (NBT) y tintes fluorescentes como el bromuro de etidio, GelRed, SYBR Green I y SYBR oro. Esta reacción trabaja en presencia de luz azul o luz del sol y permite la recuperación de la muestra con la mejora de la calidad en comparación con el uso de SG I con un transiluminador UV. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado de la técnica de tinción con tetrazolio sales.
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Protocol
1. preparar y ejecutar el Gel
- Preparar geles no desnaturalizantes 12% gel de poliacrilamida, utilizando la receta de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida Gel electroforesis (SDS-PAGE), encuentra en Sambrook y Russell14 pero usando agua en lugar de SDS.
- Para preparar 5 mL de solución de gel, uso de 1,7 mL de agua destilada, 2 mL de acrilamida/bis-acrilamida (30/0.8% w/v), 1,3 mL de Tris 1,5 M pH 8,8, 0,05 mL de persulfato de amonio 10% y 0,002 mL de TEMED.
- Para preparar 2 mL de gel de apilamiento utilice 1,5 mL de agua, 0,33 mL de acrilamida/bis-acrilamida (30/0.8% w/v), 0.25 mL de 1 M Tris pH 6.8, 0,02 mL de persulfato de amonio 10% y 0,002 mL de TEMED. Las dimensiones del gel son 7,3 cm x 8,2 cm x 0.075 cm (l x w x d).
Nota: Utilice un peine bien 15 de 0,75 mm de espesor para mayor sensibilidad.
- Agregar las cantidades apropiadas de 6 veces la carga del buffer y la muestra de ADN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (por ejemplo uso 1 μl de tampón de carga de 6 x a 5 μl de muestra de ADN).
- Colocar el gel en la cámara de electroforesis vertical.
- Llene la cámara con 750 mL de buffer x TAE 1 ejecutar el 2 geles. Para preparar 1 L de 50 x TAE, utilizar 442 g de Tris base, 57,1 mL de ácido acético glacial y 100 mL de pH de EDTA de 0.5 M 8. Añadir agua destilada hasta un volumen final de 1 L.
- Cargar las muestras en el gel. Correr el gel a 100 V durante 2 h.
- Por otra parte, preparar un gel de agarosa x TAE 1 usando la receta en Sambrook14.
- Añadir 300 mL de 1 x TAE a la cámara de electroforesis horizontal. Correr el gel por 45 min a 100 V.
2. NBT-SG que tinción (figura 1).
-
Gel de acrilamida de tinción.
- Preparar las soluciones: 0.1% w/v NBT y 1.2 x SG me.
Nota: Es posible utilizar el bromuro de etidio, GelRed y SYBR oro en vez de SG, pero tenía el mejor desempeño de la SG. - Verter 16,75 mL de 1.2 x SYBR I solución verde en un recipiente de tamaño adecuado.
Nota: Utilizamos la tapa de una caja de punta de pipeta como un contenedor, y estos volúmenes se calculan para cubrir el gel con este contenedor; sus dimensiones son 11,6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm (l x w x d). - Coloque el gel en la solución. Añadir 3,25 mL de solución de NBT 0,1% w/v para dar NBT de 0,2 mM y 1 x (equivalente a 2.0 μm) SG concentraciones finales.
- Sellar el recipiente con película plástica y envuelva completamente el recipiente con papel de aluminio para bloquear cualquier luz ambiente.
Nota: La película plástica se utiliza para evitar salpicaduras y evitar la reacción de aluminio con la solución de tinción. - Agitar durante 25 min en un agitador orbital a 60 rpm.
- Retire el aluminio y cubierta de plástico. Exponer al sol durante 90 minutos máximo. Compruebe cada 5 min hasta que aparezca la banda de interés.
- Para usar la luz azul, prepare un protoboard con 3 diodos emisores de luz (LED) y coloque los LEDs de 5 mm de la superficie del gel (verifica la tinción continuamente, como el tiempo necesario dependerá de la intensidad de la fuente de luz de LED).
- Preparar las soluciones: 0.1% w/v NBT y 1.2 x SG me.
-
Gel de agarosa de tinción.
- Después de preparar y ejecutar una agarosa 1% gel como se describe en las secciones 1.4 (las dimensiones son 1 x 6,2 cm x 7 cm, l x w x d), siga los mismos pasos que en 2.1 con estas modificaciones:
- Verter 41,9 mL de 1.2 x SG solución en la tapa de una caja de punta de pipeta; sus dimensiones son 11,6 cm x 7.6 cm x 2.6 cm (l x w x d). Añadir 8,1 mL de solución NBT 0,1%.
- Sellar el recipiente con película plástica y luego envolver completamente el recipiente con papel de aluminio para bloquear cualquier luz ambiente.
- Agitar durante 1 h en un agitador orbital a 60 rpm.
3. los datos análisis.
-
NBT-SG I curvas de calibración.
- Escaneo en 1200 ppp para obtener imágenes de gel.
- Software libre para análisis de imagen. Enderezar las imágenes usando un editor de imágenes. Ejecute una densitometría de la imagen.
- Calcular el área bajo la curva. Preparar un gráfico de laMax frente a concentración de ADN.
4. DNA recuperación.
- Preparar un gel de agarosa al 1% en 1 x TAE con la receta encontrada en Sambrook14.
- Añadir 300 mL de 1 x TAE a la cámara de electroforesis horizontal. Carga 4 μL de 100 ng/μl pDJ10015 plasmid y escalera de ADN siguiendo el esquema dado en la figura 2. Correr el gel durante 1 h a 100 V.
- Marca y pesan dos tubos de microcentrífuga de 2 mL.
- Corte el gel por la mitad para tener dos mitades idénticas. Cada uno debe contener la escala y el plásmido de muestra para comparar las diferentes técnicas de tinción. Es de una representación esquemática en la figura 2.
- La mancha una media con NBT-SG I como en el paso 2.
- Corte la banda de plásmido con un bisturí limpio. Guardar la pieza de gel en un tubo y pesar.
- La otra parte del gel con SG de la mancha I con 50 mL de 1 x SG solución y agitar lentamente (60 rpm) el gel durante 1 hora en la oscuridad.
- Coloque el gel en un transiluminador y expuestos durante 2 minutos corte hacia fuera de la banda de plásmido con un bisturí limpio.
- Guarde la pieza de gel en el otro tubo y pesan.
Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí manteniendo los tubos a-20 ° C.
- Llevar a cabo la extracción de plásmidos mediante un kit de extracción de gel comercial.
5. plásmido normalización.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 10 μl del plásmido extraído y 60 μL de tipo de agua. Mezclar y transferir a una cubeta de cuarzo de 60 μL o utilizar 2 μl directamente en un Nanodrop.
- Medir el espectro de absorción entre 230 a 320 nm. Calcular la concentración de plásmido de la muestra utilizando la fórmula siguiente:
donde D es el factor de dilución aplicado (en este caso es 70/10), es Ax a x nm y 50 es el factor de conversión μg/ml de dsDNA. - Diluir las muestras a 9,1 ng/μl.
- Transformar células competentes de Escherichia coli (e. coli) (e.g. XL10 oro) después de la de procedimiento de la transformación de Inoue16 con 5 μl de muestra diluida.
- Contar el número de colonias en las placas Petri y tenga en cuenta la dilución. Calcular las unidades de formación de Colonia (UFC) con la siguiente fórmula17:
donde D es el factor de dilución aplicado desde la cultura inicial. - Realice una prueba de t no pareada.
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Representative Results
Un precipitado de formazán púrpura aparece donde se encuentra el ADN (verificado por espectrometría de masas13). En el experimento, una escalera de ADN fue cargada para hacer una curva de calibración (figura 3). El protocolo trabaja para geles de acrilamida y agarosa, pero tiene una intensidad menor y tarda más tiempo en agarosa. Sin embargo, el uso de geles de agarosa permite la recuperación de la muestra utilizando un kit disponible comercialmente, y no interferir con la extracción. Las muestras recuperadas usando este método con LEDs azules tienen una calidad mejor en comparación con SG utilizando un transiluminador (figura 4).
Figura 1. Esquemática de NBT-SG I ADN tinción y cuantificación análisis. Los pasos son: A. agregando SG NBT soluciones y para el gel. B. exponer el gel a luz solar o luz azul. C. análisis del gel a 1200 dpi. D. Análisis de la imagen del gel por un software para obtener la intensidad de la banda de procesamiento de imágenes. E. trazar los datos en una intensidad versus la trama de la concentración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Esquema de análisis de comparación de recuperación e integridad ADN. A. electroforesis de ADN. B. gel de corte en dos trozos. C. tinción con los dos diferentes métodos de tinción (SG y NBT-SG I). D. reducción de banda de ADN de plásmido. E. procedimiento de extracción de gel de DNA de utilizando el kit de extracción. F el. cuantificación de ADN por medición de Espectrofotometría. G. normalización de concentración de DNA de para comparar los dos métodos. H. transformación bacteriana con las muestras después de normalización Colonia I. recuento y análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Curva de calibración de la DNA en 1500 bp utilizando NBT-SG I: 12.5% de poliacrilamida gel cargado con diferentes concentraciones de escalera del ADN. Los geles se corrieron a 100 V durante 2 h en 1 x TAE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Comparación de la eficiencia de transformación entre ADN visualizado con SG I y un transiluminador y NBT-SG I: el plásmido pDJ100 se cargan en un gel de agarosa al 1% y ejecutar a 100 V durante 1 hora en 1 x TAE. Luego el gel fue cortado en dos mitades. Una mitad fue manchado con SG I y la otra mitad del gel con NBT-SG me. La banda de plásmido fue extraída luego el gel usando un kit de extracción de gel. Finalmente, el plásmido extraído fue normalizado y utilizado para transformar células competentes de e. coli . Las transformaciones se llevaron a cabo n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Una sensible y novela tinción de ADN basado en la reducción de NBT y el uso de SG me presenté en este artículo. El paso crítico en este protocolo es el tiempo de incubación del gel en el NBT-SG solución y la concentración de NBT. El tiempo de tinción de geles de agarosa es más largo que para geles de acrilamida debido al mayor espesor de geles de agarosa. Este método no funciona bien en presencia de SDS como NBT precipita en contacto con ella. Si el gel obtiene un fondo púrpura, recomendamos que se prepare otro gel y para reducir el tiempo de exposición a la luz. Si se tiñe un gel de agarosa y no existe suficiente sensibilidad, se recomienda aumentar el tiempo de exposición a la luz. Si hay una falta de sensibilidad y un precipitado opalescente está presente en el gel, este podría ser el resultado de la contaminación de la SDS. En ese caso, preparar un nuevo gel y enjuague antes de añadir los reactivos de tinción.
La precipitación se produce por iluminación luz azul, ya sea suministrada por la luz de un LED azul o la luz azul presente naturalmente en la luz del sol. Por lo tanto, una limitación de la técnica es la fuente de luz. Si no se necesita ninguna fuente de luz, una fuente de luz azul, y si la fuente de luz no es homogénea, no es posible hacer una comparación, y por la misma razón, no es posible hacer la cuantificación. Sin embargo, los resultados obtenidos serán algo depende de la fuente de luz utilizada. Si la fuente de luz no es constante o uniforme (por ejemplo debido a cambios en la intensidad de la luz solar durante el día o la fuente de luz azul no homogénea), será más difícil dirigir las comparaciones o cuantificación de diferentes muestras en diferentes tiempos.
Este método no necesita instrumental especial para visualizar el ADN, haciéndolo ideal para uso de campo. Para resultados cuantitativos, se puede utilizar una cámara de alta resolución o un escáner de oficina como se demostró en este trabajo.
Esperamos ampliar en el futuro esta técnica combinando posiblemente con la tinción de otras biomoléculas mediante el uso de dos diferentes técnicas de tinción (por ejemplo, NBT-SG con Coomassie) en el mismo gel.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, proyecto 11130263 (a la derecha), proyecto CONICYT, NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (a la derecha) y U-inicia de la Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (a la derecha).
Gracias a Tatiana Naranjo-Palma por la ayuda en la etapa inicial de este proyecto, el Dr. Jorge Babul y Diego Quiroga-Roger de discusión útil, Robert Lesch para revisar el manuscrito y la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Sociedad de la Universidad de Chile. Gracias también a Marcelo Pérez para editar el video y Neil Stevens para corregir el texto y Errol Watson para proporcionar la voz en OFF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
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