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Biochemistry

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

Published: January 28, 2018 doi: 10.3791/56528

Summary

Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.

Abstract

Métodos de coloração de DNA são muito importantes para a investigação biomédica. Nós projetamos um método simples que permite a visualização de DNA a olho nu, a formação de um precipitado colorido. Ele funciona através da imersão a acrilamida ou gel de agarose DNA em uma solução de 1 x (equivalente a 2,0 µM) SYBR Green eu (SG eu) e 0,20 mM nitro azul tetrazólio que produz um roxo precipitado de formazan quando expostos à luz solar ou especificamente a luz azul. Também, testes de recuperação de DNA foram realizados utilizando um plasmídeo resistente à ampicilina em um gel de agarose corado com nosso método. Obteve-se um maior número de colônias com nosso método do que com a tradicional mancha usando SG eu com iluminação ultravioleta. O método descrito é rápido, específico e não-tóxico para a deteção de DNA, permitindo a visualização de biomoléculas a "olho nu", sem um transiluminador e é barato e apropriado para uso em campo. Por estas razões, o nosso DNA novo método de coloração tem potenciais benefícios para a investigação e a indústria.

Introduction

Com os avanços em bioquímica e biologia molecular, os estudos envolvendo DNA exigiram melhores técnicas para analisar o DNA. O primeiro método para coloração de DNA foi prata coloração, que é muito sensível, mas carece de seletividade e não permite a recuperação de amostra. Mais tarde, o desenvolvimento de coloração fluorescente de DNA permitiu a seletiva quantificação de DNA com a possibilidade de recuperação da amostra. Dentre os corantes fluorescentes primeiros usados para quantificação de DNA foi de brometo de etídio1, que é mutagênico2. No entanto, agora existem corantes fluorescentes melhorados mais seguros e mais sensíveis, tais como GelRed e SYBR Green eu (SG eu)3; Mas todos estes corantes fluorescentes exigem o uso de um transiluminador de (UV) ultravioleta ou fluorímetro.

Existem outras técnicas para coloração visivelmente o DNA, como o azul de metileno4 e violeta cristal5,6,7,8,9, mas todos estes sofrem de sensibilidade reduzida e seletividade. Os sais de tetrazólio são suscetíveis a redução de compostos orgânicos e quando isso acontece eles formam um insolúvel e colorida formazan precipitar10,11. Recentemente, foram mostrados para ligar ao DNA devido seus anéis de tetrazólio positivo12sais de tetrazólio bivalente.

Em uma recente publicação13, foi proposta uma nova técnica visível para manchar e quantificação de DNA em gel de poliacrilamida, usando a redução de um sal de tetrazólio bivalente chamado nitro azul tetrazólio (NBT) e corantes fluorescentes como brometo de etídio, GelRed, SYBR Green I e SYBR Gold. Esta reação funcionou na presença de luz azul ou luz solar e permitiu a recuperação da amostra com qualidade melhorada em comparação com o uso de SG eu com um transiluminador UV. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo detalhado da técnica de coloração usando tetrazólio sais.

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Protocol

1. preparação e execução do Gel

  1. Prepare o desnaturação não 12% gel de polyacrylamide gel usando a receita de sódio Dodecil sulfato de sódio-Polyacrylamide Gel eletroforese (SDS-PAGE) encontrados em Sapeka e Russell14 mas usando água em vez de SDS.
    1. Para preparar a 5 mL de solução de gel, use 1,7 mL de água destilada, 2 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED.
    2. Para preparar 2 mL de gel de empilhamento usar 1,5 mL de água, 0,33 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED. As dimensões do gel são 7,3 x 8,2 cm x 0,075 cm (l x w x d).
      Nota: Use um pente bem 15 de 0,75 mm de espessura para a melhor sensibilidade.
  2. Adicione as quantidades adequadas de 6x carregando buffer e amostra de DNA para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (por exemplo, uso 1 µ l de tampão de carregamento 6 x a 5 µ l de amostra de DNA).
  3. Coloca o gel na câmara de eletroforese vertical.
    1. Encha a câmara com 750 mL de 1 tampão de x TAE para executar 2 géis. Para preparar 1 L de 50 x TAE, usar 442 g da base Tris, 57,1 mL de ácido acético glacial e 100 mL de pH de EDTA 0,5 M 8. Adicionar água destilada até um volume final de 1 L.
    2. Carrega as amostras no gel. Funcione o gel a 100 V por 2 h.
  4. Em alternativa, prepare um gel de agarose 1 x TAE usando a receita encontrada na Sapeka14.
    1. 300 ml de 1 x TAE para a câmara de eletroforese horizontal. Funcione o gel por 45 min a 100 V.

2. NBT-SG eu coloração (Figura 1).

  1. Gel do acrilamido coloração.
    1. Preparar as soluções: 0,1% w/v NBT e 1.2 x SG eu.
      Nota: É possível usar o brometo de etídio, GelRed e SYBR Gold em vez de SG eu, mas eu tive o melhor desempenho de SG.
    2. Despeje 16,75 mL de 1.2 x SYBR verde eu solução em um recipiente de tamanho apropriado.
      Nota: Usamos a tampa de uma caixa de ponta da pipeta como um recipiente, e esses volumes são calculados para cobrir o gel usando este recipiente; suas dimensões são 11,6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d).
    3. Coloque o gel na solução. 3,25 ml de solução de 0,1% w/v NBT dar NBT de 0.2 mM e 1 x (equivalente a 2,0 µM) SG concentrações finais.
    4. Selar o recipiente com filme plástico e enrole completamente o recipiente com papel de alumínio para bloquear qualquer luz ambiente.
      Nota: O filme plástico é usado para evitar salpicos e evitar a reação da película de alumínio com a coloração da solução.
    5. Agitar durante 25 min em um agitador orbital em 60 rpm.
    6. Remova o alumínio e tampa de plástico. Exponha à luz solar por 90 min máximo. Verificar a cada 5 min até que apareça a banda de interesse.
    7. Para usar a luz azul, preparar uma protoboard com 3 diodos emissores de luz (LED) e colocar os LEDs 5 mm da superfície do gel (verifique a coloração continuamente, como o tempo necessário dependerá da intensidade da fonte de luz LED).
  2. A coloração do Gel do agarose.
    1. Depois de preparar e executar um agarose 1% gel conforme descrito nas seções 1.4 (as dimensões são 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x w x d), siga os mesmos passos como em 2.1 com essas modificações:
    2. Despeje 41,9 mL de 1.2 x SG eu solução na tampa de uma caixa de ponta da pipeta; suas dimensões são 11,6 x 7,6 cm x 2.6 cm (l x w x d). Adicione 8,1 mL da solução NBT de 0,1%.
    3. Selar o recipiente com filme plástico e em seguida, enrole completamente o recipiente com papel de alumínio para bloquear qualquer luz ambiente.
    4. Agitar durante 1 h em um agitador orbital em 60 rpm.

3. os dados análise.

  1. NBT-SG que as curvas de calibração.
    1. Obter imagens de gel de digitalização de 1200 dpi.
    2. Software aberto para análise de imagem. Endireite as imagens usando um editor de imagem. Execute uma densitometria de imagem.
    3. Calcule a área sob a curva. Prepare um gráfico do sinal/sinalMax versus concentração de DNA.

4. o DNA recuperação.

  1. Preparar um gel de agarose 1% em 1 x TAE usando a receita encontrada na Sapeka14.
  2. 300 ml de 1 x TAE para a câmara de eletroforese horizontal. Carrega 4 µ l de 100 plasmídeo de15 pDJ100 ng / µ l e escada de DNA, seguindo o esquema na Figura 2. Funcione o gel durante 1 h a 100 V.
  3. Marcar e pesar dois tubos de microcentrifuga de 2 mL.
  4. Corte o gel no meio para ter duas metades idênticas. Cada um deve conter a escada e o plasmídeo de amostra para comparar as diferentes técnicas de coloração. Uma representação esquemática é na Figura 2.
  5. Manchar uma metade com NBT-SG eu como na etapa 2.
    1. Corte a banda do plasmídeo usando um bisturi limpo. Guarde o pedaço de gel em um tubo e pesar.
  6. Manchar a outra parte do gel com SG eu com 50 mL de 1 x SG eu solução e agitar lentamente (60 rpm) o gel por 1h na escuridão.
    1. Coloque o gel em um transiluminador e expor por 2 min. corte a banda do plasmídeo usando um bisturi limpo.
    2. Guarde o pedaço de gel no outro tubo e pesar.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, mantendo os tubos a-20 ° C.
  7. Realize a extração do plasmídeo usando um kit de extração comercial de gel.

5. plasmídeo normalização.

  1. Em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicione 10 µ l de plasmídeo extraído e 60 µ l do tipo que da água. Misturar e transferir para uma cubeta de quartzo de 60 µ l ou usar 2 µ l diretamente em um Nanodrop.
  2. Medir os espectros de absorção entre 230 a 320 nm. Calcule a concentração de plasmídeo da amostra usando a seguinte fórmula:
    Equation 1
    onde D é o factor de diluição aplicado (neste caso é 70/10), Ax é absorção x nm e 50 é o fator de conversão de µ g/mL para dsDNA.
  3. Dilua as amostras para 9,1 ng / µ l.
  4. Transformar células competentes de Escherichia coli (e. coli) (por exemplo, XL10 Gold) seguindo a transformação Inoue do procedimento16 usando 5 µ l de amostra diluída.
  5. Contar o número de colônias sobre os pratos de Petri e observe a diluição. Calcular a colônia formando unidades (CFU) com a seguinte fórmula17:
    Equation 2
    onde D é o factor de diluição, aplicado desde a cultura inicial.
  6. Execute um teste-t não pareado.

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Representative Results

Um precipitado de formazan roxo aparece onde se encontra o DNA (verificado por espectrometria de massa13). No experimento, uma escada de DNA foi carregada para fazer uma curva de calibração (Figura 3). O protocolo funciona para gel de agarose e acrilamida, mas tem uma menor intensidade e leva mais tempo em agarose. No entanto, o uso de géis de agarose permite a recuperação da amostra usando um kit disponível comercialmente, e não interferir com a extração. As amostras recuperadas usando este método com LEDs azuis têm uma melhor qualidade em comparação com SG eu usando um transiluminador (Figura 4).

Figure 1
Figura 1. Análise de coloração e quantificação de DNA esquemático de NBT-SG I. Os passos são: adicionando r. SG eu e soluções NBT ao gel. B. expondo o gel à luz solar ou luz azul. C. digitalização do gel em 1200 dpi. M. analisando a imagem de gel por uma software processamento de imagem para obter a intensidade da banda. E. plotar os dados em uma intensidade contra enredo de concentração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Esquemática de ensaio de comparação de recuperação e integridade DNA. R. eletroforese de DNA. B. gel de corte em dois pedaços. C. coloração com os dois métodos de coloração diferentes (SG eu e NBT-SG eu). M. cortando a banda de DNA do plasmídeo. E. procedimento de extração do gel de ADN usando o kit de extração. F. quantificação de DNA pela medição de espectrofotometria. G. normalização da concentração DNA para comparar os dois métodos. H. transformação bacteriana com as amostras após normalização I. colônia contagem e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Curva de calibração do DNA na bp de 1500 usando NBT-SG i: 12,5% gel de polyacrylamide carregado com concentrações diferentes de escada de DNA. Géis foram executados em 100 V para h 2 em 1 x TAE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Comparação da eficiência de transformação entre DNA visualizado com SG, eu e um transiluminador e NBT-SG i: o plasmídeo pDJ100 foi carregado em um gel de agarose a 1% e executar a 100 V por 1h em 1 x TAE. Em seguida, o gel foi cortado em duas metades. Metade estava manchada com SG, eu e a outra metade do gel com NBT-SG eu. A banda do plasmídeo então foi extraída do gel usando um kit de extração do gel. Finalmente, o plasmídeo extraído foi normalizado e usado para transformar as células competentes de Escherichia coli . As transformações foram realizadas n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Um sensível e romance método de coloração de DNA com base na redução do NBT e o uso do SG, que foi apresentado neste artigo. O passo crítico neste protocolo é o tempo de incubação do gel em NBT-SG eu solução e a concentração de NBT. O tempo de coloração para gel de agarose é maior que para géis de acrilamida por causa da maior espessura de gel de agarose. Esse método não funciona bem na presença de SDS como NBT precipita-se em contacto com ele. Se o gel Obtém um fundo roxo, recomendamos que o gel de outro ser preparado e reduzir o tempo de exposição à luz. Se um gel de agarose é manchado e não há sensibilidade suficiente, recomenda-se aumentar o tempo de exposição à luz. Se há uma falta de sensibilidade e um precipitado opalescent está presente no gel, este pode ser o resultado da contaminação do SDS. Nesse caso, preparar um gel de novo e enxaguá-lo antes de adicionar os reagentes de coloração.

A precipitação ocorre por uma iluminação azul, se fornecido pela luz de um LED azul ou azul luz presentes naturalmente na luz solar. Devido a isto, uma limitação da técnica é a fonte de luz. Se há nenhuma fonte de luz, uma fonte de luz azul é necessária, e se a fonte de luz não é homogênea, não é possível fazer uma comparação, e pela mesma razão, não é possível fazer a quantificação. No entanto, os resultados obtidos será um pouco dependentes da fonte de luz utilizada. Se a fonte de luz não é consistente ou uniforme (por exemplo, devido a mudanças na intensidade da luz solar durante o dia ou a fonte de luz azul não homogéneo), será mais difícil para dirigir as comparações ou quantificação de amostras diferentes em diferentes vezes.

Este método não necessita instrumentação especial para visualizar o DNA, tornando-a ideal para uso em campo. Para resultados quantitativos, pode usar uma câmera de alta resolução ou um scanner de escritório, como foi mostrado neste trabalho.

Esperamos expandir essa técnica no futuro, possivelmente combinando-a com a coloração de outras biomoléculas através da utilização de duas diferentes técnicas de coloração (por exemplo, NBT-SG com Coomassie) no mesmo gel.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, projeto 11130263 (para CW), projeto CONICYT, NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (para CW) e U-inicia a partir do Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (CW).

Para Tatiana Naranjo-Palma, obrigado pela ajuda na fase inicial deste projecto, Dr. Jorge Babul e Diego Quiroga-Roger para discussão útil, Robert Lesch para revisar o manuscrito e Dirección de ramal de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacêuticas da Universidade do Chile. Graças também ao Marcelo Pérez para edição de vídeo e Neil Stevens para corrigir o texto e Errol Watson para fornecer a voz do narrador.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nitro blue tetrazolium Gold Biotechnology 298-83-9 reagent used in the staining
SYBR Green I 10000X Thermo-Fisher S7563 reagent used in the staining
Gel extraction kit QIAGEN 28704 used to extract plasmid from the gel in integrity assay
DNA ladder Thermo-Fisher SM 1331 used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay
Agar Agar Merck used to make LB-ampicillin culture plates 
sodium chloride Merck 1064045000 used to make LB-ampicillin culture plates 
yeast extract Becton, Dickinson and Company 212750 used to make LB-ampicillin culture plates 
peptone Merck 72161000 used to make LB-ampicillin culture plates 
TEMED AMRESCO 761 used to make polyacrylamide gels
ammonium persulfate Calbiochem 2310 used to make polyacrylamide gels
acrylamide invitrogen 15512-023 used to make polyacrylamide gels
bisacrylamide SIGMA 146072 used to make polyacrylamide gels
Tris-base Merck 1083821000 used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
EDTA J.T. Baker 8993-01 used to make TAE buffer
Acetic acid Merck 1,000,632,500 used to make TAE buffer
agarose Merck 16802 used to make TAE buffer
spectrophotometer Tecan infinite 200 pro used to quantify DNA plasmid
water purificatiom unit Merck Elix 100 use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\
distilled water - used in gels, culture medium, stainings and general solutions
HCl J.T. Baker 9535-03 used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
6X DNA loading dye Thermo-Fisher R0610
5 mm Blue LED Jinyuan electronics SP-021 light source used in integrity assay
protoboard KANDH KH102 light source support and circuit 
9 V battery Duracell - used to power the LED's
horizontal electrophoresis chamber Biorad 1704486EDU used to make and run agarose gel in integrity assay
vertical electrophoresis kit Biorad 1658002EDU used to run polyacrylamide gels in calibration curves
power supply Biorad 1645050  used to power the electrophoresis

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References

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Paredes, A. J., Alfaro-Valdés, H. M., Wilson, C. A. M. DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure. J. Vis. Exp. (131), e56528, doi:10.3791/56528 (2018).

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