Summary
Nye værktøjer til mechanobiology forskning er nødvendig for at forstå hvordan mekanisk stress aktiveres biokemiske veje og fremkalder biologiske svar. Her, fremvise vi en ny metode til selektiv mekaniske stimulation af immobiliserede dyr med en mikrofluid fælde så høj opløsning billeddannelse af cellulære svar.
Abstract
Et centralt mål for mechanobiology er at forstå den gensidige effekt af mekanisk stress på proteiner og celler. Trods dens betydning, er mekanisk stress indflydelse på cellulær funktion stadig dårligt forstået. Delvis eksisterer denne videnskløft fordi par værktøjer aktiverer samtidige deformation af væv og celler, billeddannelse af cellulære aktivitet i levende dyr og effektiv begrænsning af motilitet i ellers meget mobile modelorganismer, såsom nematode Caenorhabditis elegans. Den lille størrelse af C. elegans gør dem en fremragende match til enheder, mikrofluidik-baseret forskning og løsninger for immobilisering har været præsenteret ved hjælp af mikrofluid enheder. Selv om disse enheder giver mulighed for høj opløsning imaging, er dyret helt indkapslet i Polydimethylsiloxan (PDMS) og glas, begrænse fysisk adgang til levering af mekanisk kraft eller elektrofysiologiske optagelser. For nylig har skabt vi en enhed, der integrerer pneumatisk aktuatorer med en diffusering design, der er kompatibel med høj opløsning Fluorescens mikroskopi. Aktivering-kanal er adskilt fra den orm-fældefangst kanal af en tynd PDMS membran. Denne membran er afbøjet i siden af en orm ved at anvende pres fra en ekstern kilde. Enheden kan målrette individuelle mechanosensitive neuroner. Aktivering af disse neuroner er afbildet på høj opløsning med genetisk kodet calcium indikatorer. Denne artikel præsenterer den generelle metode ved hjælp af C. elegans stammer udtryk for calcium-følsomme aktivitet indikator (GCaMP6s) i deres touch receptor neuroner (TRNs). Metoden, men er ikke begrænset til TRNs eller calcium sensorer som en sonde, men kan udvides til andre mekanisk-følsomme celler eller sensorer.
Introduction
Følelse af touch giver dyr med vigtige oplysninger om deres miljø. Afhængigt af den anvendte kraft opfatter touch som harmløst, lystbetonet eller smertefuld. Væv deformation under touch er opdaget af specialiserede mechanoreceptor celler indlejret i huden, der udtrykker receptorproteiner, oftest Ionkanaler. Skridt forbinder kraft opfattelse at ion-kanal aktivering under touch og smerte er ikke fuldt forstået. Endnu mindre er kendt om hvordan hudvæv filtre mekanisk deformation og om mechanoreceptors registrerer ændringer i stamme eller stress1,2,3. Dette hul i forståelse opstår delvis fra en mangel på egnede værktøjer til at anvende præcis mekaniske stimulering til overfladen af huden af en levende dyr under iagttagelse af svarene på cellulært niveau. Mens atomic force mikroskopi er blevet brugt flittigt til at anvende og måle kræfter i isolerede celler4,5 og også aktivere Piezo1 receptorer i levende celler6, lignende forsøg med levende dyr, især C. elegans, har været notorisk udfordrende på grund af den iboende mobilitet af emnet. Denne udfordring er traditionelt omgået ved hjælp af veterinær - eller kirurgisk-grade ren lim til at immobilisere enkelte dyr på agar puder1,7,8,9. Denne tilgang har været produktive, men har begrænsninger vedrører færdigheder kræves for immobilisering af limning og bløde agar overfladen på mekaniske overholdelse. En mikrofluidik strategi er et gratis alternativ, der undgår nogle af de komplikationer knyttet til limning.
Nematode C. elegans er en organisme, genetiske model med en helt kortlagt nervesystem, der på grund af dyrets størrelse, er en god pasform for mikrofluidik teknologi. Mikrofluidik-baserede enheder tilbud den fordel, at de ellers ekstremt mobile dyr kan være tilbageholdende mens de udfører høj opløsning imaging og levering af relevante neuro-modulerende stimuli. Ved hjælp af mikrofluid kan teknologier, levende dyr være immobiliseret uden skade10,11, at aktivere overvågning af adfærdsmæssige aktivitet over hele levetid12,13 og høj opløsning Imaging af neuronal aktivitet14,15,16,17. Yderligere, mange mechanoreceptor neuroner behov for følelsen af touch og smerte kan karakteriseres på deres fysiologiske1,8, mekanisk4,18,19, og molekylære niveau20,21,22.
C. elegans sanser blid mekaniske stimuli til sin krop væg ved hjælp af seks TRNs, hvoraf tre innerverer dyrets forreste (ALML/R og AVM) og tre af innerverer dyrets posterior (PLML/R og PVM). Ion-kanal molekyler til transducing en kraft til en biokemiske signal er blevet grundigt undersøgt i sin TRNs8. Denne artikel præsenterer en mikrofluid platform23 , der gør det muligt for forskere at anvende præcis mekaniske kræfter på huden af en immobiliseret C. elegans spolorm, mens du læser ud af deformation af dens indre væv af optiske billeddannelse. Ud over fremlæggelsen veldefinerede mekaniske stimuli, kan calcium transienter registreres i mechanoreceptor neuroner med subcellulært opløsning og korreleret med anatomiske og morfologiske funktioner. Enheden består af en central fældefangst kanal, der holder et enkelt dyr og præsenterer sin hud ved siden af seks pneumatisk aktivering kanaler (figur 1 og figur 2). Seks kanaler er placeret langs diffusering kanalen til at levere mekaniske stimuli til hver af worm's seks TRNs. Disse kanaler er adskilt fra fældefangst kammer med tynde PDMS membraner, der kan være drevet af en ydre luft tryk source (figur 1). Vi kalibreret fordrejning med hensyn til presset og giver målinger i denne artikel. Hvert aktuator kan behandles individuelt og bruges til at stimulere en mechanoreceptor valg. Trykket leveres ved hjælp af et piezo-drevet tryk pumpe, men eventuelle alternative enhed kan bruges. Vi viser, at pres-protokollen kan bruges til at aktivere TRNs i vivo og demonstrere Transporterende enheder velegnet til levere mekaniske stimuli til voksen C. elegans, indlæse voksne dyr i enheder, udfører calcium imaging eksperimenter, og analysere resultaterne. Enheden fabrikation består af to hovedtrin: 1) fotolitografi at gøre en Skimmelsvamp fra SU-8; og 2) molding PDMS for at gøre en enhed. Kortfattethed og klarhed henvises læsere til tidligere publicerede artikler og protokoller24,25 for instruktioner om, hvordan til at fremstille forme og enheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. enhed fabrikation
- Hent filen vedhæftet maske (supplerende fil 1) og generere en chrome maske ved hjælp af en kommerciel tjeneste eller interne facility. Som den mindste dimension på enheden er 10 µm (aktuator membran tykkelse), sikre, at masken har tilstrækkelig høj opløsning inden for ± 0,25 µm, pålideligt producere funktionerne.
-
Følg SU-8 fotolitografi standardmetoder (f.eks.referencer24,25,26) til at fabrikere støbeform til senere fremstilling af PDMS enheder; en oversigt over trinene er anført nedenfor.
Bemærk: SU-8 er en lysfølsom materiale, som krydsbindinger ved udsættelse for ultraviolet lys (maksimal absorption ~ 365 nm). Brug producentens instruktioner som udgangspunkt til at bestemme parametrene behandling for soft-bage, eksponering (UV), og efterfølgende bages.- Deponere SU-8 2002 på en silicium wafer og spin-coat det til en omtrentlig tykkelse på 2 µm, for bedre vedhæftning af små strukturer. Soft-bages på en varmeplade i 1 min. ved 95 ° C, lidt over-eksponere (UV) hele overfladen (~ 100 mJ/cm2), og efter bages på en varm tallerken for 2 min. ved 95 ° C.
- Spin-coat en 47-µm tykt lag af SU-8 2050 for at definere enhedsfunktioner. Bruge et spin hastighed på 500 rpm for 15 s (130 rpm/s acceleration) og derefter 2.000 omdr. / min. til 90 s (260 rpm/s acceleration). Hvis det er nødvendigt, Gentag og justere spin hastighed for at få den rigtige tykkelse af photoresist.
- Soft-bages på en varm tallerken for 2 min. ved 65 ° C, og derefter 7 min. ved 95 ° C. Udsætte photoresist ifølge producentens anvisninger (~ 160 mJ/cm2) benytter en chrome maske og lange-pass filter hen til sikre lige sidevægge.
- Fjerne wafer og efterfølgende bages på en varm tallerken i 1 min. ved 65 ° C, og i 7 min. ved 95 ° C.
- Opløse ueksponeret SU-8 med udvikleren, og rengør med 2-propanol.
- Bage wafer på en kogeplade ved 180 ° C i 30 min (hard-bage) at stabilisere photoresist funktioner.
-
Gøre en PDMS replika fra SU-8 model ved hjælp af standard replika støbning metoder27.
- Behandle SU-8 mug med trichloromethylsilane (TCMS) damp til at reducere PDMS vedhæftning (silanisering).
Forsigtig: TCMS er giftige og vand-reaktiv.- Placer den mønstrede wafer i en wafer rack i en glasklokke vakuum ekssikkator i en fri for vand og vandopløselige reagenser stinkskab.
- Under hætten, bruge en dråbetæller at anvende 1 dråbe af TCMS til et glasfad og læg inde i ekssikkator.
- Luk ekssikkator låget og tillade TCMS vapor til pels wafer i mindst 20 min.
- Udluftning og derefter åbne ekssikkatoren. Åbn bell jar låg og fjern wafer ved hjælp af plast pincet. Læg i en petriskål eller aluminium folie båd til PDMS replika støbning. Bortskaffe TCMS-belagte materialer i den rigtige farligt affald.
- Mix PDMS (forholdet 10:1) ved hjælp af 40 g af den base polymer og 4 g PDMS hærdning agent.
- Hæld blandingen over SU-8 mug og degas blandingen i mindst 30 min i en vakuumkammer.
- Kur i mindst 6 timer ved 70 ° C i en ovn.
- Behandle SU-8 mug med trichloromethylsilane (TCMS) damp til at reducere PDMS vedhæftning (silanisering).
- Løft PDMS fra wafer ved at indstille wafer vandret på en flad overflade og omhyggeligt skrælning PDMS off. Ikke bøje wafer opad under dette trin, da det kan bryde formen.
Bemærk: Ufuldstændige vedhæftning af SU-8 wafer eller ufuldstændig silanisering kan resultere i ødelæggelse af SU-8 strukturer under dette trin. - Skåret PDMS omkring enhederne i enkelte chips, sådan at enhederne, der vil passe på en 24 mm x 60 mm coverslip.
- Ved hjælp af en 1-mm biopsi gennemhulle, lave huller i fjorden, to udtag og seks aktuatorer ved hjælp af en 1-mm biopsi punch. Målet for de 2 mm-diameter cirkler omkring kanterne af enheden.
-
Bond PDMS chips til glas dækning underkjoler.
- Afdække begge overflader, 80 W ilt plasma (30 s).
- Anbring forsigtigt udsatte PDMS overfladen udsatte overfladen af cover slip for en conformal segl.
- Anneal enheden på en varmeplade (100 ° C, 10 min).
Bemærk: Utilstrækkelig limning kan føre til svigt af anordningen på grund af lækage.
2. forberedelse af mikroskopet
Bemærk: Transgene dyr: udtrykke en calcium indikator GCaMP6s28 eller andre genetisk kodet aktivitet sonde i neuron(s) af interesse (f.eks., TRN); Co udtrykke en aktivitet-uafhængig fluorescerende proteiner udsender på en anden bølgelængde at korrigere for lille lateral og out-of-fokus bevægelse artefakter, der opstår på grund af mekaniske stimulation. Automatiseret analyse software sporer og kompenserer for bevægelse-inducerede ændringer i intensiteten af aktivitet sonden. Den orm stammer GN69223 (eller AQ323629) express GCaMP6s (eller GCaMP6m) og calcium-uafhængig tagRFP under kontrol af mec-7 promotor. GN692 indeholder desuden den mutation lite-1(ce314), som forhindrer aktivering af TRNs på grund af blå lys sensor lite-130 under excitation af GCaMP6s fluorescens23.
-
Oprette et mikroskop system for samtidige excitation af GCaMP og RFP.
- Brug enten en kontinuerlig lyskilde og en dual band excitation filter, der overfører kun cyan og gul lys, eller brug en lyskilde, der udsender kun bølgelængder i en defineret båndbredde som samtidige cyan (0,77 mW) og gule (1,21 mW) LED excitation kilder for samtidige excitation af calcium-afhængige og uafhængige fluorescens, henholdsvis.
- Bruge et digitalt kamera til at aktivere registrering af mikroskopi billeder.
Bemærk: De fleste kameraer kommer med en software til billede erhvervelse. Alternativt, der er frit tilgængelig software, der kan bruges til at kontrollere kameraet og potentielt også andre dele af ordningen med mikroskopi. - Justere excitation intensiteten baseret på fluorescens intensitet for at undgå kamera mætning.
-
Bruge fluorescens kube, der afhængigt af valget af magnetisering kilde skal udstyres med en excitation filter.
Bemærk: En 488 nm normal god landbrugspraksis og 580 nm mCherry excitation filter blev brugt her.- Tilføje en stråledeler at kuben for afspejler cyan og gul lys og overførsel af grønne og røde lys.
- Udstyre mikroskop med en 10 X mål og en høj forstørrelse mål (fx, 63 X / 1.32 NA olie) at fokusere excitations lys på prøven.
- Montere en stråledeler foran kameraet for simultan optagelse af GCaMP og calcium-uafhængig signal. Sikre, at stråledeler har en dichroic spejl (lang pass, afskæring ved 570 nm) til at adskille grønne og røde lys ved hjælp af en emission filter for grøn (passband centreret på 525 nm med 50 nm bredde) og en emission filter for rødt lys (passband centreret på 632 nm med 60 nm bredde).
- Projekt grøn og rød fluorescens på den øvre halvdel (grøn) og nederste halvdel (rød), henholdsvis af kameraet chip (Se figur 3). Denne orientering er en forudsætning for den angivne analyse software.
3. dyrs forberedelse
- Forberede alder-synkroniseret unge voksne eller voksen dag en C. elegans, som tidligere beskrevet af Porta-de-la-Riva et al. 31
- Forberede mikrofluid chip.
- Tilslut tyngdekraften flow reservoir (~ 60 cm over chip niveau) indeholdende filtreret (0,2 µm polyethersulfone sprøjte filter) M9 buffer til en stikkontakt i chippen. Tilsluttes en stikkontakt i en to-outlet spildbakken, dvs, en sugekolbe andre stikkontakten. Tilslut anden outlet af spildbakken til en peristaltisk pumpe.
Bemærk: Bruger polyethylen (PE) rør til alle forbindelser og brug metal rør fittings til PE rør at chippen. På denne måde alle affald løsninger vil være skyllet ud af chippen og indsamlet i spildbakken. Strømmen gennem outlet kanaler skaber en blid sug, der vil holde ormen lunt under den senere fældefangst proces. - Forberede forbinder bestående af 50-mm lang PE rør (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) med metal slanger (gauge størrelse 23TW, 0.635-mm OD) i begge ender. Presse-fit disse forbindelser i hver af seks aktivering fingre og ind i orm inlet (Se figur 1). Forlade disse samkøringslinjer i chippen, som gentagen fjernelse fører til at bære på PDMS huller.
- Tilslut tyngdekraften flow reservoir (~ 60 cm over chip niveau) indeholdende filtreret (0,2 µm polyethersulfone sprøjte filter) M9 buffer til en stikkontakt i chippen. Tilsluttes en stikkontakt i en to-outlet spildbakken, dvs, en sugekolbe andre stikkontakten. Tilslut anden outlet af spildbakken til en peristaltisk pumpe.
- Placere jetonen på mikroskopet. Pick 2 – 5 orme i en dråbe filtreret (0,2 µm sprøjte filter) M9 buffer og bruge en 1 mL sprøjte til at udarbejde dem ind i en PE rør (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) forbundet til en 1-mL sprøjte ved at trække stemplet forsigtigt. Holde dyrene i PE-rør og ikke i sprøjten.
Bemærk: For mange orme eller ufiltreret løsninger i chippen kan føre til tilstopning. - Tilslut PE rør af sprøjten til interconnect på orm inlet (figur 1 og figur 2) chip. Aktivere tyngdekraften flow ved at åbne ventilen og starte den peristaltiske pumpe. Tryk forsigtigt på sprøjten stemplet af sprøjten at flytte dyrene til fældefangst kanal mens observere kanal under et mikroskop med en 10 X linse i brightfield tilstand.
Bemærk: Lejlighedsvis forekommende luftbobler ikke udgør et problem. de er som regel automatisk flyttet til stikkontakten. Flere dyr kan 'parkeret' i salen, venter og benyttes fortløbende.- Efter Ilægning af dyret i fældefangst kanal (Se også figur 2), justere sin holdning ved forsigtigt at skubbe eller trække stemplet i sprøjten for at placere hovedet af dyret i den koniske form af forsiden af kanalen.
- Sørg for orm (voksen dag 1) har den rigtige størrelse til at blive fanget i chippen.
- Hvis ormen fylder ikke hele tværsnittet af kanalen fra næse til nær slutningen af kroppen (ikke herunder spidsen af halen) eller ormen bevæger sig langs aksen af den engelske kanal uden at flytte stemplet af sprøjten , fjerne ormen ved at trykke stemplet i sprøjten, indtil det forsvinder fra fældefangst kanal og indlæse en ny (Se trin 3.8).
- Skifte til fluorescens mikroskop og en højere forstørrelse linsen (40 X eller højere) og tjekke om neurite af neuron interesse kommer til at ligge på tværs af mellemgulvet af en af aktuatorer. Hvis ikke, justere placeringen af dyret ved at trække eller skubbe stemplet. Hvis det ikke hjælper, fjerne ormen og indlæse en ny.
- Fokusere på cellen organ i neuron af interesse og Tilslut forbindelseskablet til aktuatorens niveau tættest på neuron på den forreste side af cellen kroppen til en programmerbar tryk pumpe ved hjælp af PE rør.
- Hvis eksperimentet kræver måling af afstanden mellem aktuator og neuron, flytte synsfeltet, så begge er i synsfeltet og channelwall er parallel til den øvre og nedre kant af billedet.
- Definere et pres protokol bruger programmerbare tryk pumpe.
Bemærk: Denne protokol kan justeres til ønskede eksperimentet.- Start med et konstant tryk på 0 kPa for et tidsrum svarende til mindst 50 billeder af billedsekvens (nødvendigt for normalisering). For en imaging på 10 Hz det svarer til 5 s. Tilføj en ønskede stimulus bølgeform og pres og definere længden af stimulus, som et andet trin.
Bemærk: For at stimulere TRNs, en sinusformet bølgeform (dvs., 75 kPa, 10 Hz) overlejret med en trin (dvs., 275 kPa) anbefales som den genererer en stor neuronal svar. - Hvis eksperimentet kræver yderligere stimuli, omfatte en periode på mindst 10 s ved et konstant tryk på 0 kPa mellem stimuli. Før der tændes tryk pumpe, Sørg for instrument pres er på konstant 0 kPa at undgå utilsigtet stimulation af ormen før den faktiske eksperiment.
- Start med et konstant tryk på 0 kPa for et tidsrum svarende til mindst 50 billeder af billedsekvens (nødvendigt for normalisering). For en imaging på 10 Hz det svarer til 5 s. Tilføj en ønskede stimulus bølgeform og pres og definere længden af stimulus, som et andet trin.
- Køre imaging og pres-protokollen.
- I programmet image erhvervelse af kameraet sat op en billedsekvens på 10 Hz bruger en eksponeringstid på 100 ms for varigheden af pres-protokollen. Justere excitation intensitet, således at maksimal fluorescens stigning ikke mætte kameraet. Gemme billederne som en *.tif med mindst 50 billeder før det første stimulus for normalisering.
- Start imaging-protokollen i image erhvervelse software og software programmerbare pumpens pres protokollen. Under optagelse, observere om neuron af interesse er den klogeste sted i et område på 10 x 10 pixels, ikke bevæger sig længere end 10 pixel i sekventielle billeder og forbliver i synsfelt under optagelsen.
Bemærk: Hvis dette ikke sker, mislykkes analyse software. Lyse pletter (dvs. autofluorescence) i nærheden af neuron gøre ren optagelser af neuroner vanskeligt. At rette dette, fjerne ormen fra fælden og indlæse en ny orm i chippen. Hvis ormen bevæger sig for meget, prøve en ny indspilning af den samme orm og observere orm bevægelse. Hvis problemet fortsætter kan ormen være for lille til at blive fanget. I dette tilfælde fjerne ormen og indlæse en lidt større orm i fælden. - Hvis det ønskes, optage signaler fra flere neuroner i synsfeltet samtidig som neuroner er adskilt af mindst 10 pixels under hele optagelsen.
- For at undersøge tilvænning, udføre eksperimentet gentagne gange på et dyr.
- Fjerne ormen fra fældefangst kanal.
- Hvis det ønskes at holde ormen for efterfølgende undersøgelser, afbryde afsætningsmuligheder for chip mod tyngdekraften flow og spildbakken. Tryk stemplet af sprøjten forsigtigt indtil for hele orm er skubbet gennem fældefangst kanal i flow-kanal.
- Fortsætte med at trykke på sprøjten stemplet, indtil dyret vises i et slipværktøj chip. Afbryde sprøjte herunder PE rør fra orm-fjorden, bruge det til Aspirér orme i slipværktøjet og overføre det til en agar plade.
- Hvis det ikke ønskes at holde ormen, fjerne ormen ved at trykke stemplet i sprøjten, indtil for hele orm er skubbet gennem fældefangst kanal i flow-kanal; tyngdekraften flow og suge af den peristaltiske pumpe vil bære dyret ud af chippen og i spildbakken.
4. analyse
- Hent og Installer den nyeste Fiji version32.
- Hent og Installer den nyeste java SDK version.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, slette eller omdøbe mappen java mappen Fiji for Fiji bruge nyinstallerede java compiler. -
Åbn Fiji software.
- Kontrollere, om softwaren kører den nyinstallerede java compiler ved at åbne ' Plugins | Utilities | ImageJ | Egenskaber.
- Hent filen pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, se supplerende fil 2).
- Træk og slip filen .java i vinduet software til at åbne det som et plugin.
-
Kompiler og Kør filen pokinganalyzer*.java ved at trykke på Ctrl + R nøgler i Fiji; en grafisk brugergrænseflade (stikke Analyzer) åbnes (figur 3).
- Klik på fanen "Hjælpe" og læse om kravene i softwaren og hvordan til at udføre analysen. For at starte, Vælg fanen "Open video" Angiv placeringen for analysatoren for video: Klik på "Åbn en Video"-knappen, navigere til placeringen af videoen, og Åbn den.
Bemærk: Softwaren starter med denne fane åbnes. Hvis det ikke er åbent, når du starter en ny analyse skal du klikke på fanen "Open video". Hvis videoen er i a.tif format, vil programmet internt Åbn video og vise det første billede i den nederste del af grænsefladen. Hvis billedet ikke er af den video, der skal analyseres, skal du klikke på "Åbn en video"-knappen for at åbne en anden video. - For at fortsætte, skal du klikke på fanen "Definere ROIs". Under denne fane, definere placeringen af TRN. Bemærk, at det første billede i den åbnede video vises i den nederste del af dette tab. Klik på knappen "Definere TRN", og klik på neuron i den øverste del af det viste billede, som skal vise GCaMP fluorescens.
- Valgfrit: Hvis aktuatoren er synlige i den øverste halvdel af billedet programmet kan automatisk spore afstanden mellem neuron og aktuatoren hvis det ønskes. For dette, check "Definer aktuatoren?" -boksen, klik på knappen "Definere aktuator" og klik på aktuatoren i den øverste halvdel af billedet.
- Klik på fanen "Analyse" Definer billede erhvervelse sats. Enten indtaste et tal i feltet eller klikke på op eller ned knapperne for at forøge eller formindske antallet. Hvis du er i den forrige fane "Definer aktuatoren?" -feltet er afkrydset, definere cellestørrelsen kamera, forstørrelsen og den binning faktor, så programmet kan beregne afstanden.
- Klik på knappen "Start analyse".
Bemærk: Programmet nu spore neuron ved sin fluorescens i billedsekvens i den øvre halvdel (calcium afhængige) og i den nederste halvdel (calcium uafhængige) af billedsekvens. For at tage hensyn til neuron bevægelse i flyet med at optage programmet vil undersøge et område på 10 x 10 pixels omkring placeringen af neuron i det forrige billede til at finde placeringen af neuron i følgende billede. Det vil beregne fluorescens i begge halvdele af korrigere for baggrunden fluorescens (Fbg) og dividere med fluorescens i de første 50 billeder (F0):
Fluorescens ændringer i den grønne, aktivitet-afhængige kanal (FCa2 +), der er forårsaget af neuron bevægelse ud af flyet i recoding er så korrigeret ved hjælp af fluorescens i den røde, aktivitet-uafhængig kanal (F corr) og før stimulus standardafvigelse af calcium-afhængige (sdCa2 +) og uafhængige fluorescens (sdcorr) af:
- Programmet vil vise sine fremskridt i status advokatstanden i den nederste del af grænsefladen; når statuslinjen når 100%, skal du klikke på fanen "Resultater". Hvis statuslinjen stopper før 100%, vil programmet give en fejlmeddelelse, der angiver grunden til programmet ikke kunne analysere videoen.
- Hvis signal-støj-forholdet er for lav, ikke kan programmet identificere neuron; justere parametrene billedbehandling i efterfølgende optagelser.
- Hvis neuron efterlader synsfelt under optagelsen, programmet kan ikke spore det længere og vil stoppe. Efterfølgende optagelser, læg neuron i midten af synsfeltet i starten af optagelsen.
- Hvis nogle regioner i synsfeltet er overmættet, vil den automatiseret analyse producere ugyldig resultater. Efterfølgende optagelser, skal du kontrollere fluorescens signal ikke mætte kamera sensor.
- I fanen 'resultater' vises resultatet i den øverste del. Gemme en tabulatorsepareret *.txt filer i resultat tabellen ved at klikke på "Gem the resultat tabel".
Bemærk: Denne tabel består af tiden i sekunder og den normaliserede calcium-afhængige fluorescens (korrigeret af calcium-uafhængig fluorescens). Hvis tidligere defineret, det også indeholder den samlede afstand mellem TRN og aktuator i µm og afstanden mellem TRN og aktuatoren vinkelret på kanal væggen i µm. repræsentative resultater af fluorescens-intensiteten stige efter stimulation versus afstand af cellen kroppen til den nærmeste aktuator er afbildet i figur 4. - Hvis der er flere neuroner i en optagelse (adskilt af mere end 10 pixels), skal du klikke på fanen "Definere ROIs" igen og vende tilbage til trin 4.6.2 med den anden neuron.
- Klik på fanen "Hjælpe" og læse om kravene i softwaren og hvordan til at udføre analysen. For at starte, Vælg fanen "Open video" Angiv placeringen for analysatoren for video: Klik på "Åbn en Video"-knappen, navigere til placeringen af videoen, og Åbn den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SU-8 litografi og Chip limning
Litografi protokol og PDMS støbning følge standard procedurer. Detaljer kan findes andetsteds23,24,25,26. PDMS skulle skrælle wafer uden problemer efter hærdning. Hvis SU-8 funktioner rip off under PDMS peeling, var enten SU-8 friktion lag eller silanisering utilstrækkelig. Hvis plasma-aktivering af glas coverslips og PDMS chips ikke er tilstrækkelig, svag limning kan resultere i udsivning af diffusering kanal eller pneumatisk aktuatorer medfører forringet ydeevne og manglende stimulation. Hvis væske lækage er indlysende, er chippen ubrugelig.
Aktuator ydeevne
Alle PDMS aktuatorer og slanger tilsluttes luft reservoir chippen skal være forseglet korrekt for at sikre ordentlig pneumatisk aktivering af membraner. Gentagne indsættelse og fjernelse af PE-rør (VVS) vil skade PDMS huller og føre til et fald i trykket. Sådan et tab af pres vil begrænse aktuator afbøjning og den kraft, huden af immobiliserede dyret. Afbøjning af mellemgulvet kan måles ved hjælp af en tom chip (ingen dyr nuværende) ved at udføre flere aktivering cyklusser med det ønskede tryk og sammenligne de kvantitative værdier med teoretiske forudsigelser. Afbøjning af mellemgulvet blev ikke målt i tilstedeværelsen af et dyr i fældefangst kanal, fordi membran og ormen grænsen er svært at visualisere. Dette gør præcision kalibrering med en fangne dyr ikke muligt. Tabel 1 viser den forventede afbøjning som funktion af trykket. Disse værdier blev beregnet ved hjælp af elastisk plade teori og detaljer kan findes i Nekimken et al. 23 dette forhold forventes at variere med forskelle i membran tykkelse genereret under chip støbning og andre faktorer såsom integriteten af limning mellem chip og glas og sæler tilslutning chippen til tryk kilder. Her, var værdier reproducerbare med mindre variation ikke overstiger 1 µm på 450 kPa af pres. Vi har karakteriseret udførelsen af membraner til alle tre forskellige stimulus profiler og henvise den interesserede læser til Nekimken mfl. 23 i sammendrag, der er flere faktorer at overveje, hvis værdierne afvige fra tabel 1: 1) en læk i slanger eller slange stik, 2) PDMS har en forskellige elasticitet, som kan tilskrives en alternativ forholdet mellem base polymer og hærder, eller 3) PDMS har alderen og fortsatte med at bitmapgenkendelse over tid. Derfor anbefales brug af chips, som er udarbejdet inden for en måned efter deres ansøgning.
Diffusering ydeevne
Efter indsættelse af orme i indløbet af chippen, bør en blide tryk med sprøjten placere et enkelt dyr inde fældefangst kanal og præsentere sin hud sammen med seks aktuatorer (figur 1). Vigtigere, behøver næsen af dyret ikke nødvendigvis at rager ind i bufferen reservoir. I stedet er det mere vigtigt at placere dyret således, at neurite støder op til den nærmeste aktuator og dens cellen kroppen er inden for synsfeltet af mikroskopet. For at opnå optimal neuronal aktivisering, justeres afstanden mellem aktuator og cellen kroppen således at aktuatoren ligger anterior cellen kroppen af interesse. Vores erfaring, for neuroner stimuleret posteriort for cellen kroppen, ikke aktivisering vil tage sted og calcium vil transienter være fraværende. Ordentlig immobilisering kan opnås med unge voksne eller en - dag gamle hermafroditter (enheder optimeret til disse to aldre er tilgængelige på den samme maske). Mindre dyr vil glide ind i samling reservoiret eller bevæge sig sideværts inde fældefangst kanal. Dyr, der er for stor vil presses ind i kanalen, hvilket kan resultere i for tidlig aktivering af sin TRNs og efterfølgende undladelse af at registrere mechanoreceptor transienter. Også, fjernelse af store orme udfordrende, fører til død af dyret og/eller tilstopning af enheden. Med dette design, være PLM neuron normalt ikke immobiliseret helt, så det er gratis at flytte lateralt og vertikalt. Selv om vi har med held aktiveret PLM neuroner, er optage calcium transienter i disse neuroner vanskelig på grund af lodret bevægelse af halen. En anden fældefangst design har været anvendt til at optage fra PLM33.
Billeddannelse af Calcium transienter og analyse
En gang i sted, dyrene kan blive stimuleret ved hjælp af en af seks aktuatorer. Seks aktuatorer er positioneret til at levere mekaniske stimuli til hver af seks TRNs. En mikrofluid flow controller tilsluttet en 450-kPa in-house pres kilde blev brugt til at levere til dyret en stimulus protokol bestående af en 2-s 275 kPa skridt, en 2-s 0 – 275 kPa rampe, og en 2-s buzz (en 75 kPa, 10 Hz sinus overlejret med en 275 kPa trin) , hver adskilt af en 10-s ventetid. Samtidig optaget billedsekvenser af calcium transienter blev analyseret i Fiji, ved hjælp af en brugerdefineret-skrevet software til rådighed på vores GitHub konto (se ovenfor og https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Vi fandt, at pres ramper og pres trin aktiveret TRNs kun hvis stimuli opnåede pres over 400 kPa. Derimod konstateredes en robust aktivering af alle TRNs stimuleres ved hjælp af en sinusformet, 10-Hz buzz på pres < 275 kPa (figur 4). Generelt er TRNs svarede bedre til en kort sinusformet stimulus (kaldet 'buzz'), i samarbejde med tidligere rapporter ved hjælp af forskellige metoder1,9. Stimulation med en buzz er yderst effektiv, fører til ~ 90% af aktivering i alle neuroner og forsøg testet (figur 4). Overraskende, var der ingen stærke korrelation observeres om stimulus blev anvendt til den dorsale eller den ventrale side, og var uafhængig af afstanden mellem cellen kroppen og stimulus holdningen på neurite. Fremtidige undersøgelser vil skulle undersøge om forsinkelsen af den maksimale svar korrelerer med stimulus afstand.
Figur 1: oversigt over chip design. (A) skematisk layout af photomask og den deraf følgende chip med alle stik er angivet. Der er seks aktivering fingre, tre på hver side af den centrale fældefangst kanal. Skalalinjen = 3 mm. (B) fotografi af mikrofluid enheden med PDMS bundet til coverslip og tilsluttet slanger i orm indløb og ormen afsætningsmuligheder. Kun én af aktivering fingre er tilsluttet trykkilden, mens de andre fem ikke er besat. Dele af figuren er blevet gengivet fra reference23 under kreative fælles licenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Næroptagelse af centrale fældefangst kanal og diffusering procedure. (A) skematisk tegning af diffusering kanal. Søjler på indsugningssiden orm hjælpe at orientere ormen og lette læsning af dyrene. Aktivering fingre kan være tryk og led en tynd membran fanget modellen. Skalalinjen = 200 µm. (B) repræsentative videobillede af en orm at være fanget i den vandrette kanalen. Kanalen er designet sådan, at ormen kommer til at lægge på tværs af de seks pneumatisk aktuatorer. Halen er til venstre er hoved til højre. Placering af individuelle touch receptor neuroner (TRNs) er angivet med pile og markeret i figur. Skalalinjen = 100 µm (i alle paneler). Dele af figuren er blevet gengivet fra reference23 under kreative fælles licenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: oversigt over de medfølgende Fiji plugin til at analysere calcium spor erhvervet med denne protokol. Softwaren starter en anskuelighed brugergrænseflade. Den første fane ("Open video") af brugergrænsefladen viser knappen for at åbne en video, det viser sti og det første billede i den åbnede video. Den anden fane ("definere ROIs") indeholder knappen for at definere en touch receptor neuron, et afkrydsningsfelt for at aktivere knappen "Definere aktuator" og for "Definere aktuator". Det første billede af video vises i den nederste del. I den øverste del af den tredje tab ("analyse") vises justerbare parametre til analysen af billedet. Den midterste del viser knappen "Start analyse". I den nederste del viser en statuslinje status for den aktuelle analyse. I den fjerde under fanen "Resultater", vises at resultatet som en graf af relative fluorescens intensitet over tid. I den nederste del er der en knap for at gemme tabellen resultat. I fanen "Hjælp", vises en hjælpetekst viser kravene til analyse software og instruktion om hvordan man bruger den. Figur tilpasset fra reference23 under kreative fælles licenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: individuelle neuroner reagerer på mekaniske stimuli. (A) repræsentative fluorescens Mikrograf af GCamP6s mærket AVM touch receptor neuron før og efter mekanisk stimulation med en brummer. Skalalinjen = 10 µm. farveskala = 1,500-3,500 grå værdier. (B) Stimulus protokol herunder 2 s mellemgulvet excitation repræsenterer et 275 kPa skridt, et 275 kPa rampe, og en sinus (75 kPa, 10 Hz) overlejret med en 275 kPa trin (buzz). (C) normaliseret GCamP6s intensitet trace (mener ± SEM som skraverede område) optaget fra AVM stimuleret med profil vist i B vildtype dyr (grøn, n = 14) og dyr mutant i mechanoreceptor kanal subunit mec-4 (blå, n = 10), der er kendt til at lette svar til mekanisk stress. Dette indikerer, at transienter er fremkaldt af de anvendte mekaniske stimuli. Dele af figuren er blevet gengivet fra reference23 under kreative fælles licenser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tryk (kPa) | Betyde afbøjning (µm) | SD | Forventede afbøjning (µm) |
| 0 | -0.01 | 0,01 | 0 |
| 50 | 0,77 | 0,26 | 0.607143 |
| 100 | 1.57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0,65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3,86 | 0,79 | 3.03571 |
| 300 | 4.61 | 0,79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0,82 | 4.25 |
| 400 | 5.92 | 0,82 | 4.85714 |
| 450 | 6.43 | 0,75 | 5.46429 |
Tabel 1: forventet eksperimentelle afbøjning værdier for anvendt pres lige fra 0-450 kPa og deres teoretiske forudsigelser. Data udledt for en skridt stimulus. Betyde ± SD. Disse data er anskaffet med en tom fældefangst kanal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol viser en metode til at levere præcise mekaniske stimulering til huden af en rundorm, der er fanget i en mikrofluid chip. Det er beregnet til at lette integrationen af fysiske stimuli for at besvare biologiske spørgsmål og sigter mod at strømline mechanobiology forskning i biologiske laboratorier. Denne metode udvider tidligere assays for at vurdere funktionen af mechanosensory neuroner i C. elegans. Tidligere kvantitative og semi-kvantitative teknikker målt styrker1,34 og adfærd35, men var vanskeligt at integrere med høj opløsning billeddannelse af neuronal aktivitet. Vi mener således, at brugen af denne chip udvider aktuelle programmer og ydelsen er optimeret til stimulering af neuroner kræves for blid berøring. Vi optimeret afbøjning af aktuator til reach 5 µm, som er en stærk nok incitament til at nå næsten maksimal neuronal svar. Med små variationer mener vi, at dette design kan bruges til at stimulere barske touch receptorer, såsom PVD nociceptorer, der innerverer krop overflade36.
Ændringer og fejlfinding
Hvis ingen morgenmad er tilgængelig for SU-8 litografi, kan en benchtop ren boks eller SU-8 blød-litografi stationer udstyret med UV-lamper, programmerbare kogeplader og spin coaters bruges. Et billigt alternativ til produktion af mikrofluid enheder, der undgår brug af renrums faciliteter kan også være fulgt26.
I designet gennemført vi en eksisterende teknik, fældefangst, der immobiliseres et enkelt dyr i en mikrofluid kanal. Trap-design er tilpasset fra en enhed, der bruges til at studere olfaktoriske sensation i orm36, men det er ikke den eneste levedygtige mulighed til at undertrykke orm bevægelse. Andre strategier er blevet rapporteret til at holde orme i mikrofluid enheder: CO2, elektroforese, og trykstyrke immobilisering11,37,38 har været brugt, og kunne integreres i en ændret design.
Vi leveret trykket til aktivering-kanaler ved hjælp af en kommercielt tilgængelig, piezoelektriske tryk pumpe, der kan styre og leverer op til 800 kPa fra en ekstern trykkilden. Vi tilsluttet trykluft i forskningen bygning, som er i stand til at levere ~ 450 kPa pumpen. Hvis ingen kilde af komprimeret luft er tilgængelige, kunne en tank af komprimerede, inaktiv gas (f.eks., N2) bruges. Dette ville have den ekstra fordel af levere højere pres og generere store deformationer, men ville også kræve højtryks beslag til at forbinde til pres-controller til chippen. Opdigte chip fra blødere PDMS er alternative måde at øge pres-induceret deformationer.
I dette eksperiment, er outlet af tryk pumpe tilsluttet PDMS chip gennem 1-mm modtagende åbninger (f.eks., punch huller) tilsluttet med lim-fri og reversible samkøringslinjer bestående af en presse-fit 20 G metal-rør indsat i en PE slangen. Disse har vist sig at modstå belastninger op til 700 kPa39. Pleje skal tages under gentagne indsættelse, men, som PDMS omkring hullerne tendens til at rive og dermed begrænse ydeevne eller gøre chippen ubrugelig. Derfor var den metal slanger indsat én gang og venstre tilsluttet chip, uden at fjerne og indsætte det gentagne gange.
Kritiske trin
Stimulation er leveret af en trykisoleret aktivering kanal, som led i huden. Den resulterende deformation og mechanoreceptor neuron aktivering kan være afbildet med høj opløsning på en optisk fluorescens mikroskop og/eller Konfokal set-up. Flere faktorer kan vanskeliggøre påvisning af GCaMP svar. Først, C. elegans udtrykke et blåt-lys receptor30 i mange neuroner, herunder TRNs21,23, som aktiverer cellerne efter belysning med blåt (488 nm) lys. Dermed, imaging C. elegans ved hjælp af genetisk kodet calcium sensor GCaMP6s vil aktivere sin neuroner ved belysning, tilsløre calcium transienter aktiveres af mekaniske stimulation23. Arbejder i lite-1 mutant baggrunden eller ved hjælp af rød-forskudt calcium aktivitet sensorer undgår denne confound. Andet, mekanisk induceret calcium forbigående kan ikke registreres, hvis stimulus profil ikke matcher følsomheden af mechanoreceptors. Vi kunne ikke registrere aktivering for high-amplitude trin og ramper, men fremkaldte ekstremt høje signaler efter stimulation med moderat dynamics stimuli (fx, 200 - kPa buzz). Endelig TRNs vænne til en gentagne stimuli leveres med korte (< 60 s) interstimulus intervaller. Det er således vigtigt at design stimulation sekvenser, der minimerer tilvænning undtagen i tilfælde hvor tilvænning er undersøgt.
Vi anbefaler filtrering alle løsninger, da snavs og støv i bufferne kan let tilstoppe små fældefangst kanalen. Yderligere, dyr skal alder-synkroniseret og størrelse svarer til den chip design; dyr, der er mindre end unge voksne vil glide gennem enheden eller undlader at være tilbageholdende og større dyr ikke angive diffusering kanaler og er i fare for sprængning og/eller tilstopning chippen. I tilfælde af tilstopning, anvendelsen af overdreven pres på orm eller tyngdekraften flow fjorden kan rense kanalerne, men kan også føre til svigt af montering.
Som nævnt i afsnittet resultater, kan flere faktorer føre til en fejl i programmet analyse. Hvis der opstår problemer i den kompilere koden, anbefales kontrollere, at den seneste Fiji softwaren kører og at Fiji ved hjælp af den nyeste Java compiler. Hvis programmet kører, men der er uventede resultater skal du sørge for at den optagede film har en 50-frame buffer, før den faktiske mekaniske stimulation er udført for at sikre en korrekt beregning af baseline og baggrunden fluorescens. Yderligere, synsfeltet i grønne, aktivitet-afhængige (GCaMP6s) og røde, aktivitet-uafhængig (tagRFP) kanal antages at være projiceret op på den øvre og nedre halvdel af kameraet chip, henholdsvis. Hvis den optiske stråledeler projekter billederne på den venstre og højre halvdel af sensoren, skal du tænde kameraet 90° for at opnå den ønskede orientering under optagelsen eller rotere billedstakke i en forbehandling trin. Derudover programmet identificerer neuron ved sin fluorescens og mislykkes, hvis signal / støj-forhold eller kontrast er for lavt. I dette tilfælde, kan ændring af excitation intensitet og/eller eksponering tid løse problemet. Programmet vil også stoppe neuron efterlader synsfelt under optagelse, hvor sagen neuron skal være placeret i midten af synsfeltet før du starter en ny anskaffelse.
Begrænsninger af teknikken
Den nuværende design giver mulighed for stimulering af kroppen væggen mechanoreceptor neuroner som PVD nociceptorer og TRNs, men ikke mechanoreceptors, der innerverer den orm hoved regionen, såsom FLP og aske. Det er begrænset til pres < 700 kPa. For større pres skal forskellige rør fittings være ansat. Da pres levering her ikke overstiger 500 kPa, var maksimalt pres kan anvende begrænset til 450 kPa. Calcium transienter observeret her markerer den øverste grænse af den forventede signal. En anden begrænsning for udformningen af vores aktuatorer er deres skærmformat. Tyndere membraner ville give større deformationer i princippet, men strukturer med høj formatforhold er vanskelige at fremstille pålideligt. Hvis større deformationer er væsentlige, kan bredere aktuatorer eller parallel deformationer fra begge sider være nyttig, som blev forelagt af Cho et al. 29
Selv om vi kan overvåge mellemgulvet deformation, er det vanskeligt at måle de kræfter under pneumatisk stimulation af aktivering kanaler. Princippet begrænsning er, at kontaktområdet på aktuatoren ikke er veldefineret. Dette er fordi aktuatoren selv er elastisk og deformering under aktivering, som ændrer den kontakt radius med stigende afbøjning. Med disse forbehold in mente, kan vi vurdere, at en 5 µm indrykning (omkring 300 kPa aktivering pres i en tom chip) forventes for at gælde omkring 3,8 µN at ormen skønner orm stivhed af Petzold et al. 34 siden kraft afhængighed af den neuronale aktuelle varierer i orme med forskellige stiffnesses1,34, dog overvågning indrykning som en foranstaltning af stimulus intensitet i stedet for kraft er anbefalet.
Vi håber, at udbredelsen af denne protokol vil hjælpe brugerne drage fordel af mikrofluidik for mechanobiology forskning ved hjælp af C. elegans som en modelsystem, og dermed fremskynde udviklingen af videnskab om dette vigtige emne i feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty og Veronica Sanchez for støtte i enhed design og produktion af mutant dyr. Denne forskning blev støttet af NIH tilskud R01EB006745 (til BLP), R01NS092099 (til MBG), K99NS089942 (til MK), F31NS100318 (til ALN) og modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program () tilskudsaftale No. 715243 til MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
