Summary
Neue Werkzeuge für die Mechanobiology Forschung sind erforderlich, um verstehen, wie mechanischen Beanspruchung biochemische Stoffwechselwege aktiviert und biologische Reaktionen hervorruft. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur selektiven mechanischen Stimulation der immobilisierten Tiere mit einem mikrofluidischen Trap ermöglicht hochauflösende Bildgebung der zellulären Antworten.
Abstract
Ein zentrales Ziel des Mechanobiology ist die Wechselwirkung von mechanischem Stress auf Proteine und Zellen zu verstehen. Trotz seiner Bedeutung ist der Einfluss von mechanischem Stress auf zelluläre Funktion immer noch schlecht verstanden. Unter anderem existiert diese Wissenslücke, weil einige Tools gleichzeitige Verformung von Gewebe und Zellen, Bildgebung der Zellaktivität in lebenden Tieren und effiziente Einschränkung der Beweglichkeit in ansonsten hochmobile Modellorganismen wie die Nematoden ermöglichen Caenorhabditis Elegans. Die geringe Größe von C. Elegans stellt sie eine ausgezeichnete Übereinstimmung Mikrofluidik-Forschung Geräte und Lösungen für Immobilisierung wurden mit mikrofluidischen Geräten vorgestellt. Obwohl diese Geräte hochauflösende Bildgebung zu ermöglichen, ist das Tier vollständig eingehüllt in Polydimethylsiloxan (PDMS) und Glas, physischen Zugriff für die Lieferung der mechanischen Kraft oder elektrophysiologische Aufnahmen zu begrenzen. Vor kurzem haben wir ein Gerät, das pneumatische Antriebe mit einem Trapping-Design integriert, die mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie kompatibel ist. Die Betätigung-Kanal trennt sich von den Wurm-Trapping-Kanal durch eine dünne Membran PDMS. Diese Membran ist in die Seite eines Wurms abgelenkt durch Druck aus einer externen Quelle. Das Gerät kann individuelle Mechanosensitive Neuronen ausrichten. Die Aktivierung dieser Neuronen ist abgebildet bei hochauflösenden mit genetisch codierte Kalzium Indikatoren. Dieser Artikel stellt die allgemeine Methode mit C. Elegans Stämme Calcium-Sensitive Aktivitätsanzeige (GCaMP6s) in ihrer Touch-Rezeptor-Neuronen (TRNs) zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist nicht beschränkt auf TRNs noch auf Kalzium-Sensoren als Sonde jedoch, auf andere mechanisch empfindlichen Zellen oder Sensoren erweitert werden kann.
Introduction
Der Tastsinn bietet Tiere mit wichtigen Informationen über ihre Umgebung. Je nach der angewendeten Kraft wird Touch so harmlos, angenehm oder schmerzhaft empfunden. Die Gewebe-Verformung bei Berührung erkannt wird durch spezialisierte Mechanoreceptor Zellen in der Haut eingebettet, die Rezeptor-Proteine, die am häufigsten Ionenkanäle ausdrücken. Die Schritte verknüpfen Kraft Wahrnehmung mit Ionen-Kanal Aktivierung bei Berührung und Schmerz sind nicht vollständig geklärt. Noch weniger ist bekannt über das Hautgewebe filtert mechanische Verformung und ob Mechanorezeptoren erkennen von Änderungen im Stamm oder betonen,1,2,3. Diese Lücke im Verständnis ergibt sich einerseits aus einem Mangel an geeigneten Werkzeugen, präzise mechanische Reize an die Oberfläche der Haut ein lebendes Tier anzuwenden, unter Beachtung der Reaktionen auf zellulärer Ebene. Während Rasterkraftmikroskopie weitgehend verwendet worden ist, anzuwenden und messen Kräfte in isolierten Zellen4,5 und Piezo1 Rezeptoren im Leben aktivieren Zellen6, ähnliche Experimente mit lebenden Tieren, vor allem C. Elegans, wurden notorisch schwierig wegen der inhärenten Mobilität des Subjekts. Diese Herausforderung wird traditionell durch Veterinär- oder chirurgischen Klasse Cyanacrylat Klebstoff, um einzelne Tiere auf Agar-Pads1,7,8,9zu immobilisieren umgangen. Dieser Ansatz ist produktiv gewesen, aber hat Beschränkungen in Bezug auf das Geschick erforderlich für Immobilisierung durch Kleben und die weiche Agar-Oberfläche auf mechanische Compliance. Eine Mikrofluidik-Strategie ist eine kostenlose Alternative, die den Komplikationen verbunden zu kleben vermeidet.
Der Fadenwurm C. Elegans ist ein genetisches Modellorganismus mit einer völlig zugeordneten Nervensystem, das aufgrund der Größe des Tieres, eine gute Passform für Mikrofluidik-Technologie. Mikrofluidik-basierte Geräte bieten den Vorteil, dass die sonst äußerst mobilen Tiere zurückgehalten werden können, während der Durchführung hochauflösende Bildgebung und Lieferung von relevanten Neuro-modulierende reizen. Mit Hilfe von mikrofluidischen können Technologien, lebende Tiere ohne Schaden10,11, ermöglicht Überwachung des Verhaltens Aktivität über die gesamte Lebensdauer12,13 und hochauflösende immobilisiert werden Imaging von neuronaler Aktivität14,15,16,17. Weiter, viele Mechanoreceptor Neuronen benötigt für das Gefühl der Berührung und Schmerz auf ihre physiologischen1,8, mechanische4,18,19, gekennzeichnet werden kann und molekulare Level20,21,22.
C. Elegans spürt sanfte mechanische Reize an seinen Körper Wand mit sechs TRNs, von denen drei innervieren des Tieres anterior (ALML/R und AVM) und drei davon innervieren des Tieres Posterior (PLML/R und PVM). Die Ionen-Kanal Moleküle benötigt für eine ausgeübte Kraft in eine biochemische Signal transducing haben ausgiebig in seiner TRNs8untersucht. Dieser Artikel stellt eine mikrofluidischen Plattform23 , mit dem Forscher präzise mechanische Kräfte auf die Haut von einem immobilisierten C. Elegans anwenden können Fadenwurm, beim Auslesen der Verformung von seiner inneren Geweben durch optische Bildgebung. Neben der Präsentation klar definierte mechanische Reize, können Kalzium Transienten in Mechanoreceptor Neuronen mit subzellulären Auflösung aufgezeichnet und korreliert mit morphologischen und anatomischen Merkmale. Das Gerät besteht aus eine zentrale Trapping-Kanal, der hält ein einziges Tier und präsentiert seine Haut neben sechs pneumatische Betätigung-Kanälen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die sechs Kanäle befinden sich entlang der Trapping-Kanal, mechanische Reize zu jedem der sechs TRNs der Wurm zu liefern. Diese Kanäle sind aus der Trapping-Kammer durch dünne PDMS Membranen, getrennt durch eine externe Luftversorgung der Druck (Abbildung 1) gefahren werden kann. Wir kalibriert die Durchbiegung in Bezug auf Druck und liefern die Messungen in diesem Artikel. Jeder Antrieb kann individuell angesprochen und verwendet, um eine Mechanoreceptor Wahl zu stimulieren. Der Druck wird geliefert mit einem Piezo-gesteuerte Druckpumpe aber alternative Gerät verwendet werden kann. Wir zeigen, dass die Druck-Protokoll verwendet werden kann, TRNs in Vivo aktivieren und demonstrieren Betriebsgeräte geeignet für Erwachsene C. Elegansmechanische Stimuli bereitzustellen, ausgewachsene Tiere in Geräte laden, Kalzium Bildgebung durchführen Experimente und Analyse der Ergebnisse. Gerät Herstellung besteht aus zwei wesentlichen Schritten: 1) Photolithographie zu einer Form von SU-8; und 2) Guß PDMS um ein Gerät zu machen. Aus Gründen der Kürze und Klarheit gekennzeichnet Leser zuvor veröffentlichten Artikel und Protokolle24,25 für Anweisungen, wie man die Werkzeuge und Geräte zu produzieren.
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Protocol
1. Gerät Fertigung
- Download der angehängten Maskendatei (ergänzende Datei 1) und erzeugen eine Chrom-Maske mit einem kommerziellen Dienst oder Inhouse-Anlage. Wie die kleinste Abmessung auf dem Gerät 10 µm (Aktor Membrandicke), sichergestellt, dass die Maske ausreichend hohen Auflösung innerhalb ± 0,25 µm, für die Funktionen zuverlässig zu produzieren.
-
SU-8 Photolithographie Standardmethoden zu folgen (z. B.verweist auf24,25,26) fabrizieren die Form für die spätere Produktion von PDMS Vorrichtungen; eine Übersicht über die Schritte unten aufgeführten ist.
Hinweis: SU-8 ist ein lichtempfindliches Material, welche Querverbindungen bei Exposition gegenüber UV-Licht (maximale Absorption ~ 365 nm). Verwenden Sie die Anweisungen des Herstellers als Ausgangspunkt zu bestimmen die Verarbeitungsparameter für die Soft-backen, Exposition (UV), und nach dem Backen.- SU-8 2002 auf einem Silizium-Wafer und Spin-Mantel zu hinterlegen um eine ungefähre Dicke von 2 µm, für bessere Haftung von kleinen Strukturen. Soft-Backen auf einer heißen Platte für 1 min bei 95 ° C, leicht überbelichtet (UV) die gesamte Oberfläche (~ 100 mJ/cm2), und nach dem Backen auf einer heißen Platte für 2 min bei 95 ° C.
- Spin-Mantel eine 47-µm dicke Schicht von SU-8 2050 für die Definition der Gerätefunktionen. Verwenden Sie eine Schleuderdrehzahl von 500 u/min für 15 s (130 u/min/s Beschleunigung) und dann 2.000 u/min für 90 s (260 u/min/s Beschleunigung). Falls erforderlich, wiederholen Sie und passen Sie die Schleuderdrehzahl um die richtige Dicke von Fotolack zu erhalten.
- Backen Sie Soft-auf einer heißen Platte für 2 min bei 65 ° C, und dann für 7 min bei 95 ° C. Setzen Sie den Fotolack nach Anweisungen des Herstellers (~ 160 mJ/cm2) einen Chrom-Maske und lang-Pass-Filter mit um geraden Seitenwänden zu gewährleisten.
- Den Wafer zu entfernen und nach dem Backen auf einer heißen Platte für 1 min bei 65 ° C und 7 min bei 95 ° C.
- Unbelichtete SU-8 mit dem Entwickler zu lösen, und mit 2-Propanol reinigen.
- Backen Sie die Wafer auf eine Herdplatte bei 180 ° C für 30 min (hart-Backen), Fotolack Funktionen zu stabilisieren.
-
Machen Sie eine PDMS-Replik aus dem SU-8-Modell mit standard Replik Methoden27Guß.
- Behandeln Sie die SU-8-Form mit Trichloromethylsilane (TCMS) Dampf um PDMS Haftung (Silanisierung) zu reduzieren.
Achtung: TCMS ist giftig und Wasser reagierend.- Ort der gemusterten Wafer in einem Wafer-Rack innerhalb einer Glasglocke Vakuum Exsikkator unter einem Abzug frei von Wasser und wasserlösliche Reagenzien.
- Verwenden Sie unter der Haube eine Pipette 1 Tropfen TCMS zuweisen einer Glasschale und platzieren Sie in den Exsikkator.
- Schließen Sie den Deckel der Exsikkator und ermöglichen Sie TCMS Dampf den Wafer für mindestens 20 Minuten zu beschichten.
- Entlüften Sie und öffnen Sie dann den Exsikkator. Öffnen Sie den Deckel des Bohnenbehälters und entfernen Sie den Wafer Kunststoff Pinzette zu. Legen Sie in eine Petrischale oder Aluminium Folie Boot für PDMS-Replikat-Spritzgießen. TCMS-beschichtete Materialien in der richtigen Sondermüll entsorgen.
- Mix PDMS (Verhältnis 10:1) verwenden die Basis Polymer und 4 g PDMS Härtemittel 40 g.
- Gießen Sie die Mischung über die SU-8-Form und entgasen Sie die Mischung für mindestens 30 min in einer Vakuumkammer.
- Heilung für mindestens 6 h bei 70 ° C in einem Ofen.
- Behandeln Sie die SU-8-Form mit Trichloromethylsilane (TCMS) Dampf um PDMS Haftung (Silanisierung) zu reduzieren.
- Heben Sie PDMS durch Einstellung des Wafers horizontal auf einer ebenen Fläche und sorgfältig die PDMS Ablösen des Wafers ab. Nicht Knicken des Wafers nach oben während dieses Schrittes, da es die Form zu brechen.
Hinweis: Unvollständige Adhäsion von SU-8 auf den Wafer oder unvollständige Silanisierung führt zu Zerstörung der SU-8 Strukturen während dieses Schritts. - Schneiden Sie PDMS in einzelnen Chips um die Geräte, so dass die Geräte auf einem Deckgläschen 24 x 60 mm passt.
- Mit einem 1-mm-Biopsie-Punch, machen Sie Löcher in den Einlass, zwei Filialen und sechs Antriebe mit einem 1-mm-Biopsie-Punch. Ziel für die 2 mm Durchmesser Kreise um die Kanten des Geräts.
-
Bond PDMS-Chips Glas Deckel rutscht.
- Setzen Sie beide Oberflächen, 80 W Sauerstoffplasma (30 s).
- Legen Sie vorsichtig die freiliegende PDMS Oberfläche auf die herausgestellte Oberfläche des Deckglases für eine konforme Abdichtung.
- Tempern Sie das Gerät auf einer heißen Platte (100 ° C, 10 min).
Hinweis: Unzureichende Bindung kann zum Ausfall des Gerätes durch Leckage führen.
2. Vorbereitung des Mikroskops
Hinweis: Transgene Tiere: express einen Kalzium-Indikator wie GCaMP6s28 oder andere genetisch codierte Aktivität-Taster auf der Neuron(s) des Interesses (z.B.TRN); Co drücken Sie ein Aktivitäten-unabhängige fluoreszierenden Proteins emittierende auf einer anderen Wellenlänge, für kleine seitliche und Out-of-Focus Bewegungsartefakte durch mechanische Stimulation entstehen zu korrigieren aus. Die automatisierte Analyse-Software verfolgt und Bewegung verursachten Veränderungen in der Intensität der Aktivität Sonde kompensiert. Der Wurm Stämme GN69223 (oder AQ323629) GCaMP6s (oder GCaMP6m) ausdrücken und die Kalzium-unabhängige TagRFP unter der Kontrolle der Mec-7 Promotor. Darüber hinaus enthält GN692 die Mutation lite-1(ce314), die Aktivierung des TRNs durch das blaue Licht-Sensor lite-130 während der Erregung der GCaMP6s Fluoreszenz23verhindert.
-
Ein Mikroskopsystem für gleichzeitige Erregung GCaMP und RFP einrichten.
- Verwenden Sie entweder eine kontinuierliche Lichtquelle und ein dual-Band-Erregung-Filter, der nur Cyan und gelb Licht überträgt, oder verwenden Sie eine Lichtquelle, die nur Wellenlängen in einer definierten Bandbreite wie gleichzeitige Cyan emittiert (0,77 mW) und gelb (1.21 mW) LED Anregungsquellen für gleichzeitiger Anregung der Kalzium-abhängige und unabhängige Fluoreszenz, beziehungsweise.
- Verwenden Sie eine digitale Kamera zur Aufnahme von Mikroskopie-Bildern zu ermöglichen.
Hinweis: Die meisten Kameras verfügen über eine Software für die Bildaufnahme. Alternativ gibt es frei verfügbare Software, der verwendet werden kann, um die Kamera und möglicherweise auch andere Teile des Systems der Mikroskopie zu steuern. - Passen Sie Anregung Intensität anhand der Fluoreszenzintensität Kamera Sättigung zu vermeiden.
-
Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Würfel, den abhängig von der Wahl der die Anregungsquelle muss mit einem Erregung-Filter ausgestattet werden.
Hinweis: Eine 488 nm GFP und 580 nm mCherry Erregung Filter wurde hier verwendet.- Fügen Sie einen Strahlteiler auf den Cube für Cyan und gelb Licht reflektiert und Übermittlung von grünem und rotem Licht.
- Statten Sie das Mikroskop mit einem 10-fach und einer hohen Vergrößerung Ziel (z.B.63 X / 1,32 NA Öl) das Anregungslicht auf die Probe zu konzentrieren.
- Montieren Sie einen Strahlteiler für gleichzeitige Aufnahme von der GCaMP und das Kalzium-unabhängige Signal vor der Kamera. Sicherzustellen, dass der Strahlteiler einen dichroitischen Spiegel hat (lange übergeben, Cut-off bei 570 nm), grünes und rotes Licht mit einer Emission Filter für Grün zu trennen (Durchlassbereich zentriert auf 525 nm mit 50 nm Breite) und eine Emission Filter für rotes Licht (Durchlassbereich zentriert auf 632 nm mit 60 nm Breite).
- Projekt-grüne und rote Fluoreszenz auf der oberen Hälfte (grün) und die untere Hälfte (rot), bzw. der Kamera chip (siehe Abbildung 3). Diese Ausrichtung ist Voraussetzung für die mitgelieferte Analysesoftware.
3. tierische Vorbereitung
- Bereiten Sie Alter-synchronisierte jungen Erwachsenen oder Erwachsenen Tag eins C. Elegans, vor, wie zuvor beschrieben von Porta-de-la-Riva Et al. 31
- Vorbereiten des Mikrofluidik-Chips.
- Schließen Sie die Schwerkraft fließen Reservoir (~ 60 cm über dem Chip) mit gefiltert (0,2 µm Polyethersulfone Spritze Filter) M9 Puffer an einer Steckdose des Chips. Schließen Sie die andere Steckdose an eine Steckdose von einem zwei-Ventil-Abfallbehälter, d. h., ein Filter-Fläschchen. Den andere Ausgang des Abfallbehälters an einer peristaltischen Pumpe anschließen.
Hinweis: Verwenden Sie Polyethylen (PE) Schläuche für alle Verbindungen und metallische Verschraubungen, um das PE-Rohr auf dem Chip zu verbinden. Auf diese Weise werden alle Lösungen aus dem Chip gespült und in den Abfallbehälter gesammelt. Der Durchfluss durch den Auslass Kanäle erzeugt eine sanfte Saugwirkung, die den Wurm bei der späteren Trapping gemütlich halten. - Bereiten Sie Verbindungen, bestehend aus 50 mm langen PE Rohre (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) mit Metallmantel (Gauge Größe 23TW, 0,635 mm OD) an beiden Enden. Einpress-verbindet diese in jedem der sechs Betätigung Finger und in die Wurm-Inlet (siehe Abbildung 1). Lassen Sie diese Verbindungsleitungen in der Chip, wie wiederholte Entfernung führt auf die PDMS-Löcher zu tragen.
- Schließen Sie die Schwerkraft fließen Reservoir (~ 60 cm über dem Chip) mit gefiltert (0,2 µm Polyethersulfone Spritze Filter) M9 Puffer an einer Steckdose des Chips. Schließen Sie die andere Steckdose an eine Steckdose von einem zwei-Ventil-Abfallbehälter, d. h., ein Filter-Fläschchen. Den andere Ausgang des Abfallbehälters an einer peristaltischen Pumpe anschließen.
- Platzieren Sie den Chip am Mikroskop. Pick 2 – 5 Würmer in einem Tropfen gefiltert (0,2-µm-Spritze-Filter) M9 Puffer und eine 1-mL-Spritze verwenden, um sie in eine PE-Schlauch (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) verbunden zu einer 1-mL-Spritze durch leichtes Ziehen des Kolbens aufstellen. Halten Sie die Tiere in das PE-Rohr und nicht in die Spritze.
Hinweis: Zu viele Würmer oder ungefilterte Lösungen im Chip können zu Verstopfung führen. - Verbinden Sie das PE-Rohr der Spritze die Leiterbahn an der Wurm (Abbildung 1 und Abbildung 2) des Chips. Aktivieren Sie der Schwerkraft fließen durch Öffnen des Ventils und starten Sie die peristaltische Pumpe. Drücken Sie dann sanft den Spritzenkolben der Spritze, die Tiere in der Trapping-Kanal zu bewegen, unter Beachtung des Kanals unter dem Mikroskop mit einem 10 X-Objektiv im Hellfeld-Modus.
Hinweis: Gelegentlich erscheinen Luftblasen kein Problem dar; Sie sind in der Regel automatisch in die Steckdose verschoben. Mehrere Tiere können "geparkt", in der Kammer warten und nacheinander verwendet werden.- Nach dem Laden des Tieres in der Trapping-Kanal (siehe auch Abbildung 2), stellen Sie seine Position durch sanft schieben oder ziehen den Kolben der Spritze um den Kopf des Tieres in der konischen Form der Front des Kanals zu positionieren.
- Stellen Sie sicher, dass der Wurm (Erwachsene Tag 1) hat die richtige Größe im Chip gefangen zu sein.
- Wenn der Wurm nicht den gesamten Querschnitt des Kanals aus der Nase füllt zu nahe das Ende des Körpers (nicht einschließlich die Schwanzspitze) oder der Wurm bewegt sich entlang der Achse des Kanals ohne Bewegung des Kolbens der Spritze , den Wurm durch den Kolben der Spritze drücken, bis es aus der Trapping-Kanal verschwindet zu entfernen und ein neues zu laden (siehe Punkt 3.8).
- Fluoreszenz-Mikroskop und eine höhere Vergrößerung Objektiv (40 X oder höher) Modus wechseln Sie und prüfen Sie, ob die Neuriten des Neurons von Interesse über die Membran einer der Antriebe zu liegen kommt. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die Position des Tieres durch ziehen oder schieben den Kolben. Wenn das nicht hilft, den Wurm zu entfernen und ein neues zu laden.
- Konzentrieren Sie sich auf den Zellkörper eines Neurons von Interesse und schließen Sie die Leiterbahn des Antriebs am nächsten an das Neuron auf der vorderen Seite der Zellkörper an eine programmierbare Druckpumpe mit PE-Schlauch an.
- Wenn das Experiment Messen des Abstands zwischen Antrieb und das Neuron erfordert, das Sichtfeld zu bewegen, so sind beide in das Sichtfeld und die Channelwall ist parallel zu den oberen und unteren Rand des Bildes.
- Definieren Sie eine Druck-Protokoll unter Verwendung der programmierbaren Druckpumpe.
Hinweis: Dieses Protokoll ist auf das gewünschte Experiment einstellbar.- Beginnen Sie mit einem konstanten Druck von 0 kPa eine Zeitlang mindestens 50 Bilder von der Bildsequenz (notwendig für die Normalisierung) entspricht. Für eine bildgebende Rate von 10 Hz dies entspricht 5 s. hinzufügen eine gewünschte Reiz-Wellenform und Druck und definieren die Länge der Impulse in einem zweiten Schritt.
Hinweis: Für die Stimulierung der TRNs, wird eine sinusförmige Wellenform (d.h.75 kPa, 10 Hz) überlagert mit einem Schritt (d.h. 275 kPa) empfohlen da es eine große neuronale Antwort erzeugt. - Wenn das Experiment zusätzliche Reize erfordert, umfassen einen Zeitraum von mindestens 10 s mit einem konstanten Druck von 0 kPa zwischen Reize. Vor dem Einschalten der Pumpe achten Sie Instrument Druck auf konstante 0 kPa, zufällige Stimulierung des Wurms vor dem eigentlichen Experiment zu vermeiden.
- Beginnen Sie mit einem konstanten Druck von 0 kPa eine Zeitlang mindestens 50 Bilder von der Bildsequenz (notwendig für die Normalisierung) entspricht. Für eine bildgebende Rate von 10 Hz dies entspricht 5 s. hinzufügen eine gewünschte Reiz-Wellenform und Druck und definieren die Länge der Impulse in einem zweiten Schritt.
- Die Bildgebung und Druck-Protokoll ausführen.
- Richten Sie in der Bild-Datenerfassungs-Software der Kamera eine Bildsequenz bei 10 Hz mit einer Belichtungszeit von 100 ms für die Dauer des Druck-Protokolls. Passen Sie die Anregung Intensität, so dass die Erhöhung der maximalen Fluoreszenz die Kamera nicht sättigen. Speichern Sie die Bilder als *.tif-Datei mit mindestens 50 Bilder vor den ersten Impuls für die Normalisierung.
- Starten Sie die Image-Protokoll in der Bild-Datenerfassungs-Software und dem Druck-Protokoll in der Software der programmierbaren Pumpe. Während der Aufnahme, beobachten Sie, ob das Neuron von Interesse die hellste Stelle auf einer Fläche von 10 x 10 Pixel ist, sich nicht weiter als 10 Pixel in aufeinander folgenden Bildern bewegt und während der Aufnahme in das Blickfeld bleibt.
Hinweis: Wenn dies nicht geschieht, wird die Analyse-Software nicht. Lichtblicke (d. h. Autofluoreszenz) rund um das Neuron machen Aufnahmen von den Neuronen schwierig zu reinigen. Um dieses Problem zu beheben, entfernen Sie den Wurm aus der Falle und laden Sie einen neuen Wurm in den Chip zu. Wenn der Wurm zu viel bewegt, versuchen Sie eine neue Aufnahme von den gleichen Wurm und beobachten Sie Wurm-Bewegung zu. Wenn das Problem weiterhin besteht möglicherweise der Wurm zu klein, um gefangen zu sein. In diesem Fall entfernen Sie diesen Wurm zu und laden Sie einen etwas größeren Wurm in die Falle. - Falls gewünscht, nehmen Sie Signale von mehreren Neuronen in das Sichtfeld gleichzeitig auf, solange die Neuronen während der gesamten Aufnahme von mindestens 10 Pixel getrennt sind.
- Um Gewöhnung zu untersuchen, führen Sie das Experiment wiederholt auf ein Tier.
- Entfernen Sie den Wurm aus der Trapping-Kanal.
- Wenn es gewünscht wird, um den Wurm für nachfolgende Untersuchungen zu halten, trennen Sie die Ausgänge des Chips in Richtung der Schwerkraft fließen und Abfallbehälter. Drücken Sie den Kolben der Spritze sanft, bis der ganze Wurm durch die Trapping-Kanal in den Strömungskanal geschoben wird.
- Drücken Sie den Spritzenkolben, bis das Tier in ein Tröpfchen außerhalb der Chip angezeigt wird. Trennen Sie die Spritze, einschließlich das PE-Rohr vom Wurm Einlass, aspirieren Sie die Würmer in den Tropfen und übertragen es auf einer Nährbodenplatte verwenden.
- Wenn es nicht gewünscht ist, den Wurm zu halten, entfernen Sie den Wurm durch den Kolben der Spritze drücken, bis der ganze Wurm durch die Trapping-Kanal in den Strömungskanal geschoben wird; die Schwerkraft fließen und die Absaugung der peristaltischen Pumpe tragen das Tier aus dem Chip und in den Abfallbehälter.
4. Analyse
- Downloaden Sie und installieren Sie der neuesten Fidschi Version32.
- Downloaden Sie und installieren Sie die neueste Java-SDK-Version.
Hinweis: Wenn nötig, löschen Sie oder benennen Sie den Java-Ordner im Ordner "Fidschi" Fidschi, die neu installierte Java-Compiler zu verwenden. -
Fidschi-Software zu öffnen.
- Überprüfen Sie, ob die Software durch die Eröffnung der neu installierten Java-Compiler ausgeführt wird "Plugins | Dienstprogramme | ImageJ | Eigenschaften.
- Laden Sie die Datei pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, siehe ergänzende Datei 2).
- Drag & drop die Java-Datei in das Softwarefenster zu öffnen als ein Plugin.
-
Kompilieren Sie und führen Sie die Datei pokinganalyzer*.java durch Drücken der Tasten STRG + R in Fidschi; eine grafische Benutzeroberfläche (stossen Analyzer) öffnet sich (Abbildung 3).
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Hilfe" und lesen Sie mehr über die Anforderungen der Software und wie Sie die Analyse durchführen. Um zu beginnen, wählen Sie die Registerkarte "Open Video" und geben Sie den Speicherort der video Datei für den Analyzer: Navigieren Sie zum Speicherort des Videos klicken Sie auf "Video öffnen" und öffnen Sie es.
Hinweis: Die Software startet mit dieser Registerkarte geöffnet. Wenn es nicht geöffnet ist, beim Starten eine neue Analyse klicken Sie auf "Open Video". Wenn das Video im a.tif-Format ist, wird das Programm intern öffnen Sie das Video und das erste Bild im unteren Teil der Benutzeroberfläche angezeigt. Wenn das Bild nicht des Videos, der analysiert werden soll, klicken Sie auf die Taste "Öffnen Sie ein Video", um ein weiteres Video zu öffnen. - Um fortzufahren, klicken Sie auf der Registerkarte "Definieren ROIs". Legen Sie in dieser Registerkarte die Position von der TRN. Beachten Sie, dass das erste Bild des geöffneten Videos im unteren Teil der Registerkarte klicken Sie auf die Schaltfläche "Definieren TRN" angezeigt wird, und klicken Sie auf das Neuron im oberen Teil des angezeigten Bildes, die die GCaMP Fluoreszenz angezeigt werden sollen.
- Optional: Wenn der Antrieb in der oberen Hälfte des Bildes sichtbar ist kann das Programm automatisch den Abstand zwischen der Nervenzelle und den Antrieb verfolgen, wenn gewünscht. Überprüfen Sie hierzu "Definieren der Antrieb?" -Feld, klicken Sie auf die Schaltfläche "Definieren Antrieb" und klicken Sie auf den Antrieb in der oberen Hälfte des Bildes.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Analyse" und definieren die Erfassungsrate Bild. Geben Sie eine Zahl im Feld oder klicken Sie auf die oben oder unten Sie Schaltflächen zu erhöhen oder verringern Sie die Anzahl. Bei der vorherigen Registerkarte "Definieren der Antrieb?" -Kontrollkästchen ist aktiviert, die Größe der Kamera-Zellen, die Vergrößerung und den binning Faktor zu definieren, damit das Programm den Abstand berechnen kann.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Analyse starten".
Hinweis: Das Programm wird nun das Neuron durch seine Fluoreszenz in der Bildsequenz in der oberen Hälfte verfolgen (Kalzium angewiesen) und in der unteren Hälfte (Kalzium unabhängige) die Bildsequenz. Eine Fläche von 10 x 10 Pixel rund um den Standort des Neurons in der vorherigen Abbildung die Position des Neurons in der folgenden Abbildung finden werden untersuchen, um Neuron Bewegung in der Ebene der Aufzeichnung des Programms zu berücksichtigen. Es wird die Fluoreszenz in beiden Hälften durch Korrektur für die Hintergrundfluoreszenz (Fbg) und dividiert durch die Fluoreszenz in den ersten 50 Bildern (F0) berechnen:
Fluoreszenz-Änderungen im grünen, aktivitätsabhängige Kanal (FCa2 +), die durch Neuronen entstehen Bewegung aus dem Flugzeug der Recodierung sind dann korrigiert mit Hilfe der Fluoreszenz in den roten, Aktivität-unabhängige Kanal (F Corr) und die Standardabweichung der Pre-Reiz der Kalzium-abhängige (sdCa2 +) und unabhängige Fluoreszenz (sdCorr) durch:
- Das Programm zeigt den Fortschritt in der Statusleiste im unteren Teil der Schnittstelle; Wenn die Statusleiste 100 % erreicht, klicken Sie auf die Registerkarte "Ergebnisse". Wenn der Fortschrittsbalken vor 100 % erteilt das Programm eine Fehlermeldung angezeigt, die den Grund, dass das Programm das Video nicht analysieren konnte.
- Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis zu niedrig ist, kann das Programm nicht das Neuron identifizieren; passen Sie die bildgebenden Parameter im nachfolgenden Aufnahmen.
- Verlässt das Neuron das Sichtfeld während der Aufnahme, das Programm kann nicht mehr verfolgen und stoppt. Das Neuron in der Mitte das Sichtfeld Platz für spätere Aufnahmen zu Beginn der Aufnahme.
- Wenn einige Regionen in das Sichtfeld übersättigt sind, wird die automatisierte Analyse ungültige Ergebnisse produzieren. Sicherzustellen Sie für die nachfolgenden Aufnahmen, dass das Fluoreszenzsignal den Kamerasensor nicht sättigen.
- Das Ergebnis wird im Register "Ergebnisse" im oberen Teil angezeigt. Speichern Sie eine tabulatorgetrennte *.txt-Datei der Ergebnistabelle durch Klicken auf "Speichern der Tabelle".
Hinweis: Diese Tabelle besteht aus der Zeit in Sekunden und die normalisierte Kalzium-abhängige Fluoreszenz (korrigiert durch die Kalzium-unabhängige Fluoreszenz). Wenn zuvor definiert, es enthält auch der Gesamtabstand zwischen den TRN und des Antriebs in µm und der Abstand zwischen den TRN und der Betätiger senkrecht auf die Kanalwandung in µm. repräsentative Ergebnisse der Fluoreszenzintensität nach erhöhen Stimulation im Vergleich zu den Abstand der Zellkörper am nächsten Antrieb werden in Abbildung 4dargestellt. - Wenn mehrere Neuronen in einer Aufnahme (getrennt durch mehr als 10 Pixel) vorhanden sind, klicken Sie erneut auf die Registerkarte "Definieren ROIs" "und zurück zu Schritt 4.6.2 mit der zweiten Neuron.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Hilfe" und lesen Sie mehr über die Anforderungen der Software und wie Sie die Analyse durchführen. Um zu beginnen, wählen Sie die Registerkarte "Open Video" und geben Sie den Speicherort der video Datei für den Analyzer: Navigieren Sie zum Speicherort des Videos klicken Sie auf "Video öffnen" und öffnen Sie es.
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Representative Results
SU-8 Lithographie und Chip Bonding
Die Lithographie Protokoll und PDMS-Spritzgießen folgen Standardverfahren. Details finden an anderer Stelle23,24,25,26. Die PDMS sollte nach dem Aushärten der Wafer ohne Probleme abziehen. Wenn die SU-8-Features während PDMS Peelings Abzocke, reichten die SU-8 Adhäsion Schicht oder der Silanisierung. Wenn Plasmaaktivierung von der Glasdeckgläser und der PDMS-chips ist nicht ausreichend, schwache Verklebung austreten aus der Trapping-Kanal oder pneumatische Antriebe, was zu Leistungseinbußen und fehlender Stimulation führen kann. Wenn Flüssigkeit auslaufen ersichtlich ist, ist der Chip unbrauchbar.
Stellgliedleistung
Alle PDMS-Aktoren und der Schlauch verbinden die Chips, die Luftbehälter sind richtig abzudichten, um richtige pneumatische Betätigung der Membranen zu gewährleisten. Wiederholte einlegen und entnehmen von der PE-Schlauch (Sanitär) PDMS Löcher beschädigt und führen zu einem Rückgang der Druck. Solch ein Druckverlust schränkt Antrieb Durchbiegung und die Krafteinwirkung auf die Haut des Tieres immobilisiert. Auslenkung der Membran kann mit einer leeren Chip (kein Tier vorhanden) durch mehrere Zyklen der Betätigung mit dem gewünschten Druck und Vergleich der quantitativen Werte mit theoretischen Vorhersagen gemessen werden. Die Auslenkung der Membran wurde in Anwesenheit eines Tieres in der Trapping-Kanal nicht gemessen, weil die Membran und Wurm Grenze sind schwierig zu visualisieren. Dies ermöglicht präzise Kalibrierung mit einem gefangenen Tiere nicht. Tabelle 1 zeigt die erwarteten Auslenkung als Funktion des Drucks. Diese Werte wurden mit elastischen Platte Theorie berechnet und Details finden in Nekimken Et al. 23 diese Beziehung wird voraussichtlich mit Unterschiede in der Dicke der Membran erzeugt beim Chip-Casting und andere Faktoren wie die Integrität der Bindung zwischen dem Chip und das Glas und Dichtungen verbinden die Chips zu den Druckquellen variieren. Hier lagen die Werte mit leichten Variation nicht mehr als 1 µm bei 450 kPa Druck reproduzierbar. Wir haben die Leistung der Membrane für alle drei verschiedenen Stimulusprofilen gekennzeichnet und den interessierten Leser auf Nekimken Et al.verweisen. 23 in Zusammenfassung, dort sind mehrere Faktoren zu berücksichtigen, wenn die Werte von Tabelle 1abweichen: 1) ein Leck im Rohr oder Schlauch-Anschlüsse (2) die PDMS hat eine unterschiedliche Elastizität, die eine alternative Verhältnis von Basispolymer und Härtemittel entstehen kann, oder 3) die PDMS im Alter hat und weiterhin Crosslink im Laufe der Zeit. Daher empfiehlt sich die Verwendung von Chips, die innerhalb eines Monats nach ihrer Anwendung vorbereitet worden sind.
Trapping-Leistung
Nach dem Einlegen der Würmer in den Einlass des Chips, sollte ein sanfter Druck mit der Spritze ein einziges Tier im Inneren der Trapping-Kanal zu platzieren und seine Haut neben den sechs Aktuatoren (Abbildung 1). Wichtig ist, muss die Nase des Tieres nicht unbedingt in den Puffer-Behälter hineinragen. Stattdessen ist es wichtiger, das Tier zu positionieren, so dass die Neuriten grenzt direkt an den nächstgelegenen Antrieb und seine Zellkörper das Sichtfeld des Mikroskops liegt. Um optimale neuronale Aktivierung zu erreichen, sollte der Abstand zwischen dem Antrieb und dem Zellkörper angepasst werden, so dass der Antrieb anterior der Zellkörper von Interesse liegt. Nach unserer Erfahrung werden Transienten für Neuronen stimuliert posterior zum Zellkörper, keine Aktivierung und Kalzium stattfinden wird abwesend sein. Richtige Ruhigstellung kann mit jungen Erwachsenen oder 1 - Tage alten Hermaphroditen erreicht werden (Geräte optimiert für diese beiden Altersgruppen gibt es auf der gleichen Maske). Kleinere Tiere werden schlüpfen Sie in den Sammelbehälter oder seitlich bewegen innerhalb der Trapping-Kanal. Tiere, die zu groß sind werden in den Kanal gequetscht werden, was zu vorzeitigen Aktivierung der TRNs und Scheitern zu erkennen Mechanoreceptor Transienten führen könnte. Auch, Entfernung von großen Würmer ist eine Herausforderung, zum Tod des Tieres führt und/oder verstopfen des Geräts. Mit diesem Design kann nicht die PLM-Neuron in der Regel vollständig immobilisiert werden, so ist es frei, seitlich und vertikal zu bewegen. Obwohl wir PLM Neuronen erfolgreich aktiviert haben, wird die Aufnahme von Kalzium Transienten in diesen Neuronen durch vertikale Bewegung der Rute erschwert. Ein weiteres Trapping Design wurde zur von PLM33aufnehmen.
Bildgebung des Kalzium Transienten und Analyse
Einmal im Ort, können die Tiere angeregt mit einem der sechs Antriebe sein. Die sechs Antriebe sind positioniert, um mechanische Reize zu jedem der sechs TRNs. Ein mikrofluidischen Flow Controller verbunden mit einer 450 kPa Druck Inhouse Quelle wurde verwendet, um dem Tier ein Stimulus-Protokoll bestehend aus einen 2-s 275 kPa Schritt, eine 2-s 0-275-kPa-Rampe und ein 2-s-Summen (75 kPa, 10Hz Sinus überlagert mit einem Schritt 275 kPa) liefern , jeweils getrennt durch eine Wartezeit von 10 s. Analysiert wurden die gleichzeitig aufgenommenen Bildsequenzen der Kalzium-Transienten in Fidschi, mit einem individuell geschriebenen Software verfügbar auf unserem GitHub-Konto (siehe oben und https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Wir fanden, dass Druck Rampen und Druck Schritte TRNs nur aktiviert, wenn die Reize Druck über 400 kPa erreicht. Im Gegensatz dazu verzeichneten eine robuste Aktivierung alle TRNs angeregt mit einer sinusförmigen, 10Hz Buzz auf Druck < 275 kPa (Abbildung 4). Im allgemeinen TRNs reagiert besser auf einen kurzen sinusförmigen Reiz (genannt 'buzz'), in Übereinstimmung mit früheren Berichten, die mit verschiedenen Methoden1,9. Die Stimulation mit einem Summen ist hoch effizient, was zu ~ 90 % der Aktivierung in allen Neuronen und Studien getestet (Abbildung 4). Überraschenderweise gab es keine starke Korrelation auf ob der Reiz auf die dorsale oder der Bauchseite angewendet wurde, und wurde unabhängig von der Entfernung zwischen den Zellkörper und der Reiz Position auf den Neuriten beobachtet. Zukünftige Studien haben zu untersuchen, ob die Verzögerung die maximale Reaktion mit dem Reiz Abstand korreliert.
Abbildung 1: Überblick über das Chipdesign. (A) Schematischer Aufbau der Fotomaske und den daraus resultierenden Chip mit allen Anschlüssen angegeben. Es gibt sechs Betätigung Finger, drei auf jeder Seite des zentralen Trapping-Kanals. Maßstabsleiste = 3 mm. (B) Foto von mikrofluidischen Gerät mit PDMS auf das Deckglas gebunden und angeschlossenen Schlauch in den Wurm Einlass und die Wurm-Outlets. Die Druckquelle ist nur einer der Betätigung Finger verbunden, während die anderen fünf nicht belegt sind. Teile der Figur wurden von Referenz23 unter creative common Lizenzen reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Nahaufnahme des zentralen Trapping Kanal und Trapping Verfahren. (A) schematische Zeichnung der Trapping-Kanals. Die Säulen auf der Einlassseite Wurm dazu beitragen, den Wurm zu orientieren und Verladung der Tiere zu erleichtern. Die Betätigung Finger können unter Druck gesetzt und Gedankenstrich eine dünne Membran in das eingeschlossene Exemplar. Maßstabsleiste = 200 µm. (B) repräsentative video-Frame ein Wurm in den horizontalen Kanal gefangen. Der Kanal ist so ausgelegt, dass der Wurm kommt über die sechs pneumatische Antriebe zu legen. Rute ist auf der linken Seite, Kopf ist auf der rechten Seite. Lage der individuelle Note Rezeptor Neuronen (TRNs) sind durch Pfeile angedeutet und in der Abbildung gekennzeichnet. Maßstabsleiste = 100 µm (in alle Panels). Teile der Figur wurden von Referenz23 unter creative common Lizenzen reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Übersicht über die zur Verfügung gestellten Fidschi-Plugin Kalzium Spuren erworben mit diesem Protokoll analysieren. Die Software startet eine grafische Benutzeroberfläche. Der erste Reiter ("Open Video") der Benutzeroberfläche zeigt die Schaltfläche, um ein Video zu öffnen, es zeigt den Weg und das erste Bild des geöffneten Videos. Die zweite Registerkarte ("definieren ROIs") enthält die Schaltfläche, um ein Touch-Rezeptor Neuron, eine Checkbox zum Aktivieren der "Definieren Antrieb" und die Taste "Definieren Antrieb" zu definieren. Im unteren Teil wird der erste Frame des Videos angezeigt. Im oberen Teil der dritten Registerkarte ("Analysis") sind einstellbare Parameter für die Bildanalyse angezeigt. Der mittlere Teil zeigt die Schaltfläche "Analyse starten". Im unteren Teil zeigt ein Fortschrittsbalken den Fortschritt der aktuellen Analyse. In der vierten Registerkarte "Ergebnisse", erscheint das Ergebnis als eine grafische Darstellung der relativen Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit. Im unteren Teil gibt es einen Button zum Speichern der Ergebnistabelle. Auf der fünften Registerkarte "Hilfe", ist ein Hilfetext angezeigt, zeigt die Anforderungen an die Analyse-Software und Anleitung auf, wie man es benutzt. Abbildung von Referenz23 unter creative common Lizenzen angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: einzelne Neuronen reagieren auf mechanische Reize. (A) repräsentative Fluoreszenz Schliffbild des GCamP6s mit der Bezeichnung AVM Touch Rezeptor Neuron vor und nach der mechanischen Stimulation mit einem Summen. Maßstabsleiste = 10 µm. Farbskala = 1.500-3.500 Grauwerte. (B) Stimulus-Protokoll inklusive 2 s Membran Erregung repräsentieren ein 275 kPa Schritt, eine 275 kPa-Rampe und einen Sinus (75 kPa; 10 Hz) mit einem 275 kPa Schritt (Buzz) überlagert. (C) normalisiert GCamP6s Intensität Spur (Mittelwert ± SEM als schraffierte Fläche) aufgezeichnet von AVM angeregt mit dem Profil b Wildtyp Tiere gezeigt (grün, n = 14) und Tiere Mutante im Mechanoreceptor Kanal Untereinheit Mec-4 (blau, n = 10), das heißt bekannten Antworten gegen mechanische Beanspruchung zu erleichtern. Dies bedeutet, dass die Transienten durch die angewandten mechanischen Reize induziert werden. Teile der Figur wurden von Referenz23 unter creative common Lizenzen reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Druck (kPa) | Meine Ablenkung (µm) | SD | Erwartenden Durchbiegung (µm) |
| 0 | -0,01 | 0,01 | 0 |
| 50 | 0,77 | 0.26 | 0.607143 |
| 100 | 1,57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0,65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3.86 | 0.79 | 3.03571 |
| 300 | 4.61 | 0.79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0,82 | 4.25 |
| 400 | 5.92 | 0,82 | 4.85714 |
| 450 | 6.43 | 0,75 | 5.46429 |
Tabelle 1: erwartet experimentelle Durchbiegung Werte für angewandte Drücke von 0-450 kPa und ihre theoretischen Vorhersagen. Für ein Schritt-Impulse abgeleitet. Meine ± SD. Diese Daten wurden mit einem leeren Trapping-Kanal erworben.
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Discussion
Dieses Protokoll veranschaulicht eine Methode für die Bereitstellung von präzisen mechanischen Stimulation der Haut ein Fadenwurm, gefangen in einem Mikrofluidik-Chip. Es soll die Integration der physikalischen Reize für biologische Fragen erleichtern und Mechanobiology Forschung im biologischen Labor optimieren soll. Diese Methode erweitert vorherigen Tests zur Beurteilung der Funktion der Mechanosensory Neuronen in C. Elegans. Vorherigen quantitative und semi-quantitativen Techniken gemessen Kräfte1,34 und Verhalten35, sondern waren schwierig, mit hochauflösenden Bildgebung neuronaler Aktivität zu integrieren. Wir glauben daher, dass die Nutzung von diesem Chip aktuelle Anwendungen erweitert und seine Leistung für die Stimulation der Nervenzellen, die für sanfte Berührung erforderlich optimiert ist. Wir optimiert die Durchbiegung des Antriebs zu erreichen 5 µm, was einen stark genug Anreiz, fast maximale neuronale Antworten zu erreichen. Mit leichten Variationen glauben wir, dass dieser Entwurf verwendet werden könnten, um rauen Touch-Rezeptoren, wie z. B. PVD Nozizeptoren stimulieren, die der Körper-Oberfläche-36innervieren.
Modifikationen und Fehlerbehebung
Wenn kein Reinraum für SU-8 Lithographie verfügbar ist, können ein Benchtop-sauber-Box oder SU-8 Soft-Lithographie Stationen mit UV Lampen, programmierbare Kochplatten und Spin Coater verwendet werden. Eine kostengünstige Alternative für die Produktion von mikrofluidischen können Geräte, die die Verwendung von Reinraumanlagen vermeidet auch sein folgten26.
Bei der Gestaltung haben wir eine vorhandene Trapping-Technik, die ein einziges Tier in einem mikrofluidischen Kanal bewegungsunfähig macht. Das Trap-Design ist von einem Gerät, das verwendet wird, um die Geruchsempfindung der Wurm36zu studieren, aber es ist nicht die einzige praktikable Möglichkeit, Wurm-Bewegung zu unterdrücken. Andere Strategien gemeldet wurden, um Würmer in mikrofluidischen Geräten zu halten: CO2, Elektrophorese, Druckfestigkeit Immobilisierung11,37,38 verwendet worden und könnte integriert werden eine modifizierte Design.
Druck aufs wir Betätigung-Kanäle mit einem handelsüblichen, Piezo Druck-Pumpe, die Steuern und bis zu 800 kPa aus einer äußeren Druckquelle liefern können. Wir verbunden die Pumpe mit Druckluft in den Forschungsbau, der in der Lage, ~ 450 kPa ist. Wenn keine Druckluft zur Verfügung steht, könnte ein Tank von komprimierten, Inertgas (z.B. N2) verwendet werden. Dies hätte den Vorteil liefert höhere Drücke und große Deformationen zu generieren, sondern müssten auch Hochdruck Armaturen zum Herstellen der Druckregler auf den Chip. Herstellung des Chips aus weicher PDMS ist alternative Möglichkeit, Druck-induzierten Verformungen zu erhöhen.
In diesem Experiment ist der Auslass der Druckpumpe mit der PDMS-Chip durch 1 mm empfangenden Öffnungen (z.B. Lochung) angeschlossen mit Klebstoff-frei und reversible Verbindungsleitungen, bestehend aus einem Einpress-20 G Metall-Rohr in eine PE-Datei eingefügt verbunden. Schläuche. Diese haben gezeigt, Druck von bis zu 700 kPa39zu widerstehen. Muss darauf geachtet werden beim wiederholten einsetzen, jedoch, wie die PDMS um die Löcher neigt zu reißen und somit die Leistung zu begrenzen oder den Chip unbrauchbar machen. Aus diesem Grund wurde die Metall-Röhre einmal eingefügt und links eingesteckt in den Chip ohne entfernen und wieder einsetzen.
Wichtige Schritte
Stimulation wird durch einen unter Druck stehenden Betätigung Kanal geliefert, die Haut wird eingerückt. Die daraus resultierende Verformung und Mechanoreceptor Neuron Aktivierung können mit hoher Auflösung auf eine optische Fluoreszenzmikroskop und/oder konfokalen Einrichtung abgebildet werden. Mehrere Faktoren können die Erkennung der GCaMP Antworten behindern. C. Elegans express zunächst ein Blaulicht-Rezeptor30 in vielen Neuronen, einschließlich TRNs21,23, die Zellen nach Beleuchtung mit blauen aktiviert (488 nm) Licht. So aktiviert C. Elegans imaging mit der genetisch codierten Kalzium-Sensor GCaMP6s seine Neuronen auf Beleuchtung, verdeckt Kalzium Transienten durch mechanische Stimulation23aktiviert. Arbeiten in der lite-1 mutant Hintergrund oder mit rot-verschoben Kalzium Bewegungssensoren vermeidet diese beschämen. Zweiter, mechanisch induzierte Kalzium transiente könnte nicht erkannt werden, wenn das Reiz-Profil nicht die Empfindlichkeit der Mechanorezeptoren übereinstimmt. Wir konnte nicht ermittelt werden-Aktivierung für hoher Amplitude Treppen und Rampen, aber extrem hohe Signale nach Stimulation mit moderaten Dynamik Reize (z.B. 200 kPa - Summen) hervorgerufen. Zu guter Letzt TRNs gewöhnen auf eine wiederholte Reize geliefert mit kurzen (< 60 s) interstimulus-Intervallen. Daher ist es wichtig, Design-Stimulationssequenzen, die Gewöhnung außer in Fällen zu minimieren, Gewöhnung studierte.
Wir empfehlen allen Filterlösungen, da Schmutz und Staub in den Puffern den kleinen Trapping-Kanal leicht verstopfen können. Darüber hinaus müssen Tiere Alter synchronisiert und Größe abgestimmt auf die Chip-Design; kleiner als junge Erwachsene Tiere werden durch das Gerät schieben oder nicht zurückgehalten werden und größere Tiere können nicht die Trapping-Kanäle geben und sind in Gefahr, platzen und/oder Verstopfung des Chips. Bei Verstopfung, Anwendung von Überdruck auf den Wurm oder Schwerkraft fließen Einlass kann die Kanäle reinigen, sondern könnte auch zum Ausfall der Armatur führen.
Wie im Abschnitt "Ergebnisse" erwähnt, können mehrere Faktoren zu einem Fehler in der Analyse-Programm führen. Wenn Probleme in das Kompilieren des Codes wird überprüfen, ob die jüngsten Fidschi-Software ausgeführt wird und die Fidschi-Inseln ist die Verwendung des neuesten Java-Compilers empfohlen. Wenn das Programm ausgeführt wird, aber es unerwartete gibt machen Ergebnisse bitte sicher, dass die aufgezeichnete Film eine 50-Frame-Buffer hat, bevor die eigentliche mechanische Stimulation durchgeführt wird, um eine korrekte Schätzung der Basislinie und Hintergrund Fluoreszenz zu gewährleisten. Weiter, das Sichtfeld der grünen, aktivitätsabhängige (GCaMP6s) und die roten, Aktivität-unabhängige (TagRFP) Kanal vermutet bzw. der obere und untere Hälfte des Kamerachip projiziert werden. Wenn der optische Strahlteiler die Bilder auf der linken und rechten Hälfte des Sensors projiziert, schalten Sie die Kamera 90° um die gewünschte Orientierung während der Aufnahme oder die Bild-Stacks in eine Vorverarbeitung Schritt drehen. Darüber hinaus ist das Programm identifiziert die Nervenzelle durch seine Fluoreszenz und schlägt fehl, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis oder der Kontrast zu niedrig ist. In diesem Fall kann die Änderung der Erregung Intensität und/oder Belichtung Zeit das Problem lösen. Das Programm wird auch beendet, verlässt das Neuron das Sichtfeld während der Aufnahme, in dem Fall das Neuron in der Mitte des Sichtfeldes positioniert werden soll, vor dem Start einer Neuanschaffung.
Grenzen der Technik
Der vorliegende Entwurf ermöglicht Stimulation der Körperwand Mechanoreceptor Neuronen wie PVD Nozizeptoren und die TRNs aber nicht Mechanorezeptoren, die der Wurm Kopfes, wie FLP und Asche innervieren. Es beschränkt sich auf Druck < 700 kPa. Für größere Drücke müssen verschiedene Verschraubungen eingesetzt werden. Da die Druckversorgung hier nicht mehr 500 kPa als, beschränkte sich der maximale Druck möglich auf 450 kPa. Das Kalzium Transienten beobachteten hier Mark obere Grenze das erwartete Signal. Eine weitere Einschränkung für die Gestaltung unserer Antriebe ist ihre Seitenverhältnis. In der Regel dünnere Membranen würde es ermöglichen, größere Verformungen Strukturen mit hoher Streckung sind jedoch schwierig zuverlässig herzustellen. Wenn größere Verformungen unerlässlich sind, könnten breiter Aktoren oder parallel Verformungen von beiden Seiten nützlich sein, da von Cho Et Al. vorgestellt 29
Obwohl wir Membran Verformung überwachen können, ist es schwierig, die Kräfte während der pneumatischen Stimulation der Betätigung Kanäle zu messen. Die Prinzip-Einschränkung ist, dass die Kontaktfläche des Antriebs nicht gut definiert ist. Und zwar deshalb, weil der Antrieb selbst elastisch und verformenden während der Betätigung, die der Kontaktradius ist mit zunehmender Verformung ändert. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen beachten können wir schätzen, dass eine 5 µm Einbuchtung (rund 300 kPa Betätigung Druck in einem leeren Chip) vorhergesagt wird der Wurm den Wurm Steifigkeit Schätzungen von Petzold Et Al. etwa 3,8 µN zuweisen 34 seit die Kraft Abhängigkeit der neuronalen Strom variiert in Worms mit verschiedenen Steifigkeiten1,34, allerdings Überwachung Einzug, wie, ein Maß für die Reizstärke statt Kraft empfohlen.
Wir hoffen, dass die Verbreitung dieses Protokolls hilft Benutzern nutzen Mikrofluidik für Mechanobiology Forschung unter Verwendung von C. Elegans als Modellsystem und beschleunigen so den Fortschritt der Wissenschaft zu diesem wichtigen Thema im Bereich.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty und Veronica Sanchez für Unterstützung im Gerätedesign und Generierung von mutierten Tieren. Diese Forschung wurde unterstützt durch NIH-Stipendien R01EB006745 (zur BLP), R01NS092099 (zu MBG), K99NS089942 (für MK), F31NS100318 (zu ALN) und empfangene Finanzierung vom European Research Council (ERC) unter Horizont 2020 Forschung und Innovation der Europäischen Union Programm () Finanzhilfevereinbarung Nr. 715243 MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
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