Summary
Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.
Abstract
Uno degli obiettivi centro di mechanobiology è capire l'effetto reciproco di stress meccanico sulle cellule e proteine. Nonostante la sua importanza, l'influenza dello stress meccanico sulla funzione cellulare è ancora capito male. In parte, questa lacuna di conoscenza esiste perché alcuni strumenti attivare deformazione simultanea di tessuti e cellule, imaging di attività cellulare negli animali vivi ed efficiente limitazione della motilità in organismi modello altrimenti altamente mobile, come il nematode Caenorhabditis elegans. Le piccole dimensioni di c. elegans li rendono un'eccellente corrispondenza ai dispositivi di ricerca basata su microfluidica, e soluzioni per l'immobilizzazione sono stati presentati utilizzando dispositivi microfluidici. Anche se questi dispositivi consentono l'imaging ad alta risoluzione, l'animale è completamente racchiuso in polidimetilsilossano (PDMS) e vetro, limitando l'accesso fisico per la consegna di forza meccanica o registrazioni elettrofisiologiche. Recentemente, abbiamo creato un dispositivo che integra attuatori pneumatici con un disegno di intrappolamento che è compatibile con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione. Il canale di azionamento è separato dal canale di registrazione di vite senza fine da una sottile membrana PDMS. Questa membrana è deviato sul fianco di un verme applicando pressione da un'origine esterna. Il dispositivo può indirizzare mechanosensitive singoli neuroni. L'attivazione di questi neuroni è ripreso in alta risoluzione con indicatori di calcio geneticamente codificato. Questo articolo presenta il metodo generale usando ceppi di c. elegans esprimendo indicatore attività calcio-sensibile (GCaMP6s) nel loro neuroni recettori di tocco (TRNs). Il metodo, tuttavia, non è limitato a TRNs né ai sensori di calcio come una sonda, ma può essere esteso ad altre cellule sensibili meccanicamente o sensori.
Introduction
Il senso del tatto fornisce animali con informazioni cruciali per il loro ambiente. A seconda della forza applicata, tocco è percepito come innocuo, piacevole o doloroso. La deformazione del tessuto durante il tocco viene rilevata da cellule specializzate Meccanocettore incorporate nella pelle che esprimono proteine recettoriali, più comunemente i canali ionici. I passaggi che collegano percezione della forza di attivazione dei canali ionici durante il tocco e il dolore completamente non sono capiti. Ancor meno è conosciuto circa come il tessuto della pelle filtri deformazione meccanica e se meccanorecettori per rilevare le modifiche nel ceppo o stress1,2,3. Questo scarto nella comprensione deriva, in parte, da una mancanza di strumenti adeguati per applicare precise stimolazioni meccaniche sulla superficie della pelle di un animale vivente osservando le risposte a livello cellulare. Considerando che la microscopia a forza atomica è stata usata estesamente per applicare e misurare le forze in cellule isolate4,5 e anche per attivare recettori Piezo1 in vita cellule6, esperimenti simili utilizzando animali viventi, soprattutto C. elegans, sono stati notoriamente impegnativo a causa della mobilità intrinseca del soggetto. Questa sfida è tradizionalmente aggirata utilizzando colla del cianoacrilato veterinaria - o -grado chirurgico per immobilizzare i singoli animali agar pastiglie1,7,8,9. Questo approccio è stato produttivo, ma ha limitazioni legate all'abilità necessaria per immobilizzazione di incollaggio e la superficie di agar molle su fattori meccanici. Una strategia di microfluidica è un'alternativa gratuita che consente di evitare alcune delle complicazioni legate a incollaggio.
Il nematode c. elegans è un organismo modello genetico con un sistema nervoso completamente mappato che, a causa delle dimensioni dell'animale, è una buona misura per la tecnologia microfluidica. Offerta di dispositivi basati su microfluidica il vantaggio che gli animali altrimenti estremamente mobili possono essere trattenuti durante l'esecuzione di imaging ad alta risoluzione e la consegna di stimoli neuro-modulatori rilevanti. Con l'aiuto di microfluidica tecnologie, animali viventi possono essere immobilizzati senza danno10,11, consentendo il monitoraggio di attività comportamentali sopra l'intero ciclo di vita12,13 e ad alta risoluzione Imaging di attività neuronale14,15,16,17. Ulteriormente, molti neuroni Meccanocettore necessari per il senso del tatto e dolore può essere caratterizzato il loro fisiologico1,8, meccanico4,18,19e molecolare livello20,21,22.
C. elegans sensi dolci stimoli meccanici alla sua parete di corpo usando sei TRNs, tre dei quali innervano l'animale anteriore (ALML/R e AVM) e tre delle quali innervano posteriore dell'animale (PLML/R e PVM). Le molecole di canale di ioni necessari per trasdurre una forza applicata in un segnale biochimico sono state studiate estesamente in suoi TRNs8. Questo articolo presenta una piattaforma di microfluidica23 che consente ai ricercatori di applicare forze meccaniche precisione sulla pelle di un immobilizzato c. elegans ascaridi, durante la lettura fuori la deformazione dei suoi tessuti interni di imaging ottico. Oltre a presentare ben definiti stimoli meccanici, transienti di calcio possono essere registrate in neuroni di Meccanocettore con risoluzione subcellulare e correlati con caratteristiche morfologiche e anatomiche. Il dispositivo è costituito da un canale centrale dell'intrappolamento che contiene un singolo animale e presenta la sua pelle accanto a sei canali di azionamento pneumatico (Figura 1 e Figura 2). I sei canali sono posizionati lungo il canale di registrazione dei colori per fornire stimoli meccanici a ciascuna delle sei TRNs del verme. Questi canali sono separati dalla camera di intrappolamento da sottili diaframmi PDMS, che possono essere azionati da una sorgente di pressione dell'aria esterna (Figura 1). Abbiamo calibrato la deviazione rispetto alla pressione e fornire le misure in questo articolo. Ogni attuatore può essere indirizzato singolarmente e usato per stimolare un Meccanocettore di scelta. La pressione viene recapitata tramite una pompa di pressione piezo-driven, ma può essere usato qualunque dispositivo alternativo. Indichiamo che il protocollo di pressione può essere utilizzato per attivare TRNs in vivo e dimostrare dispositivi di azionamento adatta per fornire stimoli meccanici per adulti di c. elegans, caricamento di animali adulti in dispositivi, esecuzione di formazione immagine del calcio esperimenti e analisi dei risultati. Fabbricazione di dispositivi è costituito da due fasi principali: 1) fotolitografia per fare uno stampo da SU-8; e 2) stampaggio PDMS per rendere un dispositivo. Per ragioni di brevità e chiarezza, i lettori sono indicati precedentemente pubblicati articoli e protocolli24,25 per istruzioni su come produrre le muffe e i dispositivi.
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Protocol
1. fabbricazione di dispositivi
- Scaricare il file di maschera (Supplemental File 1) e generare una maschera di chrome utilizzando un servizio commerciale o in-House. Come la dimensione più piccola del dispositivo è di 10 µm (spessore della membrana attuatore), assicurarsi che la maschera sia sufficientemente alta risoluzione, entro ± 0.25 µm, per produrre in modo affidabile le caratteristiche.
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Seguire metodi di fotolitografia SU-8 standard (ad esempio, fa riferimento a24,25,26) per fabbricare lo stampo per la successiva produzione di dispositivi PDMS; un riepilogo dei passaggi è elencato di seguito.
Nota: SU-8 è un materiale fotosensibile, quali legami incrociati sull'esposizione a luce ultravioletta (assorbimento massimo ~ 365 nm). Utilizzare le istruzioni del produttore come punto di partenza per determinare i parametri di elaborazione per il soft-cuoce, esposizione (UV) e post-cuocere.- Depositare SU-8 2002 su un wafer di silicio e spin-cappotto per uno spessore approssimativo di 2 µm, per una migliore adesione delle piccole strutture. Soft-cuoce su una piastra calda per 1 min a 95 ° C, leggermente sovra-esporre (UV) l'intera superficie (~ 100 mJ/cm2) e post-cuocere su una piastra calda per 2 min a 95 ° C.
- Spin-cappotto uno strato spesso di 47-µm di SU-8 2050 per definire le caratteristiche del dispositivo. Utilizzare una velocità di centrifuga di 500 giri/min per 15 s (accelerazione 130 giri/s) e poi 2.000 giri/min per 90 s (accelerazione 260 giri/min/s). Se necessario, ripetere e regolare la velocità di centrifuga per ottenere lo spessore corretto del photoresist.
- Soft-cuocere su una piastra calda per 2 min a 65 ° C e poi per 7 min a 95 ° C. Esporre il photoresist secondo le istruzioni del produttore (~ 160 mJ/cm2) usando un filtro di maschera e long-pass di cromo per assicurare muri laterali diritte.
- Rimuovere la cialda e post-cuocere su una piastra calda per 1 min a 65 ° C e per 7 min a 95 ° C.
- Sciogliere non esposti SU-8 con developer e pulire con 2-propanolo.
- Cuocere in forno la cialda su una piastra riscaldante a 180 ° C per 30 min (duro-cuocia) stabilizzare il photoresist caratteristiche.
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Effettuare una replica PDMS dal modello SU-8 utilizzando standard replica metodi27di stampaggio.
- Trattare la muffa SU-8 con trichloromethylsilane (TCMS) del vapore per ridurre l'adesione PDMS (silanizzazione).
Attenzione: TCMS è acqua-reattivi e tossici.- Posizionare la cialda modellata in una griglia di wafer all'interno di un essiccatore di vuoto di campana di vetro in una cappa priva di acqua o reagenti solubili in acqua.
- Sotto il cofano, utilizzare un contagocce per applicare 1 goccia di TCMS per un piatto di vetro e posto all'interno di un essiccatore.
- Chiudere il coperchio di un essiccatore e consente la TCMS vapore rivestire la cialda per almeno 20 min.
- Sfiato e quindi aprire un essiccatore. Aprire il coperchio campana di vetro e rimuovere la cialda utilizzando pinzette in plastica. Posto in una barca di lamina Petri o alluminio per lo stampaggio di replica PDMS. Smaltire materiali rivestiti TCMS nel corretta dei rifiuti pericolosi.
- PDMS mix (rapporto 10:1) con 40 g di base polimero e 4G PDMS agente indurente.
- Versare il composto sopra lo stampo SU-8 e degassare la miscela per almeno 30 min in una camera a vuoto.
- Cura per almeno 6 ore a 70 ° C in un forno.
- Trattare la muffa SU-8 con trichloromethylsilane (TCMS) del vapore per ridurre l'adesione PDMS (silanizzazione).
- Sollevare la cialda PDMS impostando la cialda orizzontale su una superficie piana e staccando accuratamente il PDMS. Non piegare il wafer verso l'alto durante questo passaggio, perchè si può rompere lo stampo.
Nota: Adesione incompleta di SU-8 per la cialda o silanizzazione incompleta può provocare la distruzione delle strutture SU-8 durante questo passaggio. - Tagliare PDMS intorno i dispositivi su integrati tali che i dispositivi si adattano su un vetrino coprioggetto 24 x 60 mm.
- Usando un punzone per biopsia 1 mm, bucare l'ingresso, le due prese e sei attuatori usando un punzone per biopsia di 1 mm. Obiettivo per i 2 mm di diametro cerchi intorno ai bordi del dispositivo.
-
Bond PDMS chip di vetro vetrini coprioggetto.
- Esporre entrambe le superfici per il plasma ad ossigeno 80 W (30 s).
- Posizionare delicatamente la superficie PDMS esposta sulla superficie esposta di vetrini coprioggetto per una tenuta conformal.
- Tempri la periferica su una piastra calda (100 ° C, 10 min).
Nota: Incollaggio insufficiente può portare al fallimento del dispositivo a causa di perdite.
2. preparazione del microscopio
Nota: Gli animali transgenici: esprimere un indicatore del calcio come GCaMP6s28 o altra sonda attività geneticamente codificato in neuron(s) di interesse (ad es., TRN); co-esprimono una proteina fluorescente di attività indipendente che emette una lunghezza d'onda diverse per correggere la piccola laterale e artefatti di movimento di out-of-focus che sorgono a causa di stimolazione meccanica. Il software di analisi automatizzata canzoni e compensa le variazioni di movimento-indotto nell'intensità della sonda attività. Il worm ceppi GN69223 (o AQ323629) express GCaMP6s (o GCaMP6m) e il tagRFP di calcio-indipendente sotto il controllo del promotore di mec-7. Inoltre, GN692 contiene la mutazione lite-1(ce314), che impedisce l'attivazione di TRNs a causa del sensore di luce blu lite-130 durante l'eccitazione della fluorescenza GCaMP6s23.
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Impostare un sistema di microscopio per eccitazione simultanea di GCaMP e RFP.
- Utilizzare una sorgente di luce continua e un filtro di eccitazione di dual-band che trasmette la luce solo ciano e gialla, o utilizzare una sorgente di luce che emette solo lunghezze d'onda in una larghezza di banda definita come ciano simultanea (0,77 mW) e giallo (1,21 mW) LED sorgenti di eccitazione per simultanea eccitazione della fluorescenza calcio-dipendenti e indipendente, rispettivamente.
- Utilizzare una fotocamera digitale per consentire la registrazione di immagini di microscopia.
Nota: La maggior parte delle fotocamere sono dotate di un software per l'acquisizione di immagini. In alternativa, ci sono software liberamente disponibile che può essere utilizzato per controllare la fotocamera e potenzialmente anche altre parti del sistema di microscopia. - Regolare l'intensità di eccitazione basato sull'intensità di fluorescenza per evitare saturazione fotocamera.
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Utilizzare un cubo di fluorescenza che a seconda della scelta della sorgente di eccitazione deve essere dotato di un filtro di eccitazione.
Nota: Un GFP 488 nm e 580 nm mCherry filtro di eccitazione è stata usata qui.- Aggiungere un beam splitter al cubo per riflettere la luce ciano e gialla e trasmissione della luce verde e rossa.
- Dotare il microscopio con un 10x obiettivo e un obiettivo ad alto ingrandimento (ad es., 63 X / 1,32 olio NA) per concentrare la luce sul campione di eccitazione.
- Montare un divisore di fascio davanti alla telecamera per la registrazione simultanea del GCaMP e il segnale del calcio-indipendente. Garantire che il divisore di fascio ha uno specchio dicroico (passaggio lungo, cut-off a 570 nm) per separare la luce verde e rossa, utilizzando un filtro di emissione per il verde (banda passante centrata a 525 nm con larghezza di 50 nm) e filtro di una emissione di luce rossa (banda passante centrata a 632 nm con 60 nm larghezza).
- Fluorescenza verde e rosso sulla parte superiore del progetto (verde) e metà inferiore (rosso), rispettivamente della fotocamera chip (Vedi Figura 3). Questo orientamento è un prerequisito per il software di analisi fornito.
3. animale preparazione
- Preparare sincronizzati in età giovane adulto o adulto giorno uno di c. elegans, come descritto in precedenza da Porta-de-la-Riva et al. 31
- Preparare il chip microfluidici.
- Collegare il serbatoio di flusso di gravità (~ 60 cm sopra il livello del chip) contenente filtrata (filtro per siringa da 0,2 µm in polietersulfone) M9 buffer per una presa del chip. Collegare l'altra presa a una presa di un contenitore per rifiuti due-presa, vale a dire, una beuta per filtrazione. Collegare l'altra presa del contenitore dei rifiuti ad una pompa peristaltica.
Nota: Utilizzare tubi di polietilene (PE) per tutte le connessioni e metal raccordi tubo per collegare i tubi di PE al chip. In questo modo tutte le soluzioni dei rifiuti saranno lavate fuori il chip e raccolto nel contenitore dei rifiuti. Il flusso attraverso i canali di scarico crea una leggera aspirazione che manterrà il worm aderente durante il successivo processo di intrappolamento. - Preparare interconnessioni che consiste di 50 mm lungo PE tubi (0.9652-mm OD, ID 0.5842 mm) con tubi di metallo (calibro dimensione 23TW, 0,635 mm di diametro) su entrambe le estremità. Press-fit queste interconnessioni in ciascuna delle sei dita di azionamento e nell'ingresso del vite senza fine (Vedi Figura 1). Lasciare queste interconnessioni nel chip, come rimozione ripetuta conduce da indossare sui fori PDMS.
- Collegare il serbatoio di flusso di gravità (~ 60 cm sopra il livello del chip) contenente filtrata (filtro per siringa da 0,2 µm in polietersulfone) M9 buffer per una presa del chip. Collegare l'altra presa a una presa di un contenitore per rifiuti due-presa, vale a dire, una beuta per filtrazione. Collegare l'altra presa del contenitore dei rifiuti ad una pompa peristaltica.
- Posizionare il chip sul microscopio. Pick 2 – 5 vermi in una goccia di filtrato buffer M9 (filtro per siringa da 0,2 µm) e utilizzano una siringa da 1 mL per aspirare la loro in un tubo di PE (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) collegato ad una siringa 1 mL tirando delicatamente lo stantuffo. Tenere gli animali nel tubo PE e non nella siringa.
Nota: Troppi vermi o soluzioni non filtrati nel chip possono portare all'occlusione. - Collegare i tubi di PE della siringa per l'interconnessione all'ingresso della vite senza fine (Figura 1 e Figura 2) del chip. Attivare il flusso di gravità aprendo la valvola e avviare la pompa peristaltica. Quindi premere delicatamente lo stantuffo della siringa per spostare gli animali nel canale di intrappolamento osservando il canale sotto un microscopio con un obiettivo 10x in modalità campo chiaro.
Nota: Occasionalmente-comparenti bolle d'aria non pongono un problema; vengono automaticamente spostati nella presa. Molti animali possono essere 'parcheggiati' nella camera di attesa e utilizzati in sequenza.- Dopo aver caricato l'animale nel canale di intrappolamento (Vedi anche Figura 2), regolare la sua posizione delicatamente spingendo o tirando lo stantuffo della siringa per posizionare la testa dell'animale in forma affusolata della parte anteriore del canale.
- Assicurarsi che la vite senza fine (1 giorno adulto) ha le dimensioni giuste per essere intrappolati nel chip.
- Se il worm non riempie l'intera sezione trasversale del canale dal naso alla vicino alla fine del corpo (non compresa la punta della coda) o il worm si muove lungo l'asse del canale senza muovere lo stantuffo della siringa , rimuovere il worm premendo lo stantuffo della siringa fino a scomparire dal canale dell'intrappolamento e caricare una nuova (Vedi punto 3.8).
- Passare alla modalità di fluorescenza del microscopio e una lente di ingrandimento maggiore (40 X o superiore) e verifica se la neurite del neurone di interesse arriva a mentire attraverso il diaframma di uno degli attuatori. In caso contrario, regolare la posizione dell'animale tirando o spingendo lo stantuffo. Se questo non risolve il problema, rimuovere il worm e caricarne uno nuovo.
- Concentrarsi sul corpo cellulare del neurone di interesse e collegare l'interconnessione dell'attuatore più vicino al neurone sul lato anteriore del corpo cellulare a una pompa di pressione programmabile utilizzando tubi di PE.
- Se l'esperimento richiede che misura la distanza tra l'attuatore e il neurone, spostare il campo di vista, quindi sono entrambe nel campo visivo e la channelwall è parallela al bordo superiore e inferiore dell'immagine.
- Definire un protocollo di pressione con la pompa di pressione programmabile.
Nota: Questo protocollo può essere regolato per l'esperimento desiderata.- Iniziare con una pressione costante di 0 kPa per il tempo corrispondente ad almeno 50 immagini della sequenza di immagini (necessaria per la normalizzazione). Per un tasso di formazione immagine di 10 Hz questo corrisponde a 5 s. Aggiungi una forma d'onda desiderata stimolo e pressione e definire la lunghezza dello stimolo in una seconda fase.
Nota: Per stimolare la TRNs, forma d'onda sinusoidale (cioè, 75 kPa, 10 Hz) sovrapposto con un passo (cioè, 275 kPa) è consigliabile che genera una grande risposta neuronale. - Se l'esperimento richiede ulteriori stimoli, comprendono un periodo di almeno 10 s a pressione costante di 0 kPa tra stimoli. Prima di accendere la pompa di pressione, assicurarsi che la pressione dello strumento è a costante 0 kPa per evitare la stimolazione accidentale del worm prima l'esperimento vero e proprio.
- Iniziare con una pressione costante di 0 kPa per il tempo corrispondente ad almeno 50 immagini della sequenza di immagini (necessaria per la normalizzazione). Per un tasso di formazione immagine di 10 Hz questo corrisponde a 5 s. Aggiungi una forma d'onda desiderata stimolo e pressione e definire la lunghezza dello stimolo in una seconda fase.
- Eseguire il protocollo di imaging e pressione.
- Nel software di acquisizione di immagine della fotocamera, è possibile impostare una sequenza di immagini a 10 Hz, utilizzando un tempo di esposizione di 100 ms per tutta la durata del protocollo pressione. Regolare l'intensità di eccitazione tale che l'aumento di fluorescenza massima non saturare la fotocamera. Salvare le immagini come file *. TIF con almeno 50 immagini prima il primo stimolo per la normalizzazione.
- Avviare il protocollo di formazione immagine nel software di acquisizione immagini e il protocollo di pressione nel software della pompa programmabile. Durante la registrazione, osservare se il neurone di interesse è il punto più chiaro in un'area di 10x10 pixel, non si sposta più lontano di 10 pixel in immagini sequenziali e rimane nel campo visivo durante la registrazione.
Nota: Se ciò non avviene, il software di analisi avrà esito negativo. Punti luminosi (cioè, autofluorescence) intorno il neurone fare pulire registrazioni dei neuroni difficile. Per risolvere il problema, rimuovere il worm dalla trappola e caricare un nuovo worm nel chip. Se il worm si muove troppo, provare una nuova registrazione del worm stesso e osservare il movimento della vite senza fine. Se il problema persiste il worm potrebbe essere troppo piccolo per essere intrappolati. In questo caso, rimuovere questo worm e caricare un verme leggermente più grande nella trappola. - Se lo si desidera, registrare segnali da più neuroni nel campo di vista contemporaneamente fino a quando i neuroni sono separati da almeno 10 pixel durante l'intera registrazione.
- Per studiare l'assuefazione, eseguire ripetutamente l'esperimento su un animale.
- Rimuovere il worm dal canale dell'intrappolamento.
- Se si desidera mantenere il worm per studi successivi, scollegare le prese del chip verso il flusso di gravità ed il contenitore dei rifiuti. Premere delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando il verme intero viene spinto attraverso il canale di intrappolamento nella scanalatura del flusso.
- Continuare a premere lo stantuffo della siringa fino a che l'animale appare una goccia fuori del circuito integrato. Staccare la siringa tra cui i tubi di PE dall'ingresso di verme, usarlo per aspirare i vermi nella goccia e trasferirlo su una piastra di agar.
- Se non si desidera mantenere il verme, rimuovere il worm premendo lo stantuffo della siringa fino a quando il verme intero viene spinto attraverso il canale di intrappolamento nella scanalatura del flusso; il flusso di gravità e l'aspirazione della pompa peristaltica porterà l'animale fuori il chip e nel contenitore per rifiuti.
4. analisi
- Scaricare e installare la più recente versione di Fiji32.
- Scaricare e installare la versione SDK più recente di java.
Nota: Se necessario, eliminare o rinominare la cartella di java all'interno della cartella di Fiji per Fiji utilizzare il compilatore java appena installato. -
Software Open di Fiji.
- Verificare se il software è in esecuzione il compilatore java appena installato aprendo ' plugin | Programmi di utilità | ImageJ | Proprieta.
- Scaricare il file pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, vedere complementare File 2).
- Trascinare e rilasciare i file. Java nella finestra del software per aprirlo come un plugin.
-
Compilare ed eseguire il file pokinganalyzer*.java premendo i tasti Ctrl + R nelle Isole Figi; un'interfaccia utente grafica (frugando Analyzer) si aprirà (Figura 3).
- Fare clic sulla scheda "Help" e leggi i requisiti del software e come eseguire l'analisi. Per iniziare, selezionare la scheda "Open video" specificare il percorso del file video per l'analizzatore: fare clic sul pulsante "Aprire un Video", passare alla posizione del video e aprirlo.
Nota: Il software viene avviato con questa scheda aperta. Se non è aperto quando si avvia una nuova analisi fare clic sulla scheda "Open video". Se il video è in formato a.tif, il programma internamente aprire il video e visualizzare la prima immagine nella parte inferiore dell'interfaccia. Se l'immagine non è del video che deve essere analizzato, fare clic sul pulsante "Apri un video" per aprire un altro video. - Per continuare, fare clic sulla scheda "Definire ROIs". In questa scheda, definire la posizione della TRN. Si noti che la prima immagine del video aperto viene visualizzata nella parte inferiore di questa scheda, fare clic sul pulsante "Definire TRN" e scegliere il neurone nella parte superiore dell'immagine che dovrebbe mostrare la fluorescenza di GCaMP.
- Facoltativo: Se l'attuatore è visibile nella parte superiore dell'immagine il programma può automaticamente traccia la distanza tra il neurone e l'attuatore se lo si desidera. Per questo, controllare la "Definisci l'attuatore?" -casella, fare clic sul pulsante "Definire attuatore" e fare clic sull'attuatore nella metà superiore dell'immagine.
- Fare clic sulla scheda "Analisi" Definisci la frequenza di acquisizione immagine. Immettere un numero nel campo o fa clic sull'alto o verso il basso per aumentare o diminuire il numero. Se nella scheda precedente la "Definisci l'attuatore?" -casella è spuntata, definire le dimensioni della cella di fotocamera, l'ingrandimento e il fattore di binning, così il programma può calcolare la distanza.
- Fare clic sul pulsante "Avvia analisi".
Nota: Il programma ora terrà traccia il neurone dalla relativa fluorescenza nella sequenza di immagine nella metà superiore (calcio-dipendente) e nella metà inferiore (calcio indipendente) della sequenza di immagini. Per compensare il movimento del neurone nel piano della registrazione del programma indagherà un'area di 10x10 pixel intorno alla posizione del neurone nell'immagine precedente per individuare la posizione del neurone nell'immagine seguente. Calcolerà la fluorescenza in entrambi i tempi di correzione per la fluorescenza di fondo (Fbg) e dividendo per la fluorescenza nelle prime 50 immagini (F0):
Modifiche di fluorescenza nel canale verde, attività-dipendente (FCa2 +) che sono causate dal neurone di moto fuori dall'aereo di ricodifica sono poi corretto usando la fluorescenza nel canale rosso, attività indipendente (F corr) e la deviazione standard di pre-stimolo di calcio-dipendente (sdCa2 +) e fluorescenza indipendente (sdcorr) da:
- Il programma mostrerà lo stato di avanzamento nella barra di stato nella parte inferiore dell'interfaccia; Quando la barra di stato raggiunge il 100%, fare clic sulla scheda "Risultati". Se la barra di stato si interrompe prima 100%, il programma darà un messaggio di errore che indica il motivo che il programma non è stato in grado di analizzare il video.
- Se il rapporto segnale-rumore è troppo basso, il programma non è possibile identificare il neurone; regolare i parametri di imaging nelle registrazioni successive.
- Se il neurone lascia il campo di vista durante la registrazione, il programma non può tenere traccia piu ' e si fermerà. Per registrazioni successive, posizionare il neurone nel mezzo del campo di vista all'inizio della registrazione.
- Se alcune regioni nel campo visivo sono troppo saturi, l'analisi automatizzata produrrà risultati non validi. Per registrazioni successive, assicurarsi che il segnale di fluorescenza non saturare il sensore della fotocamera.
- Nella scheda 'risultati', il risultato viene visualizzato nella parte superiore. Salvare un file *. txt separato da tabulazione della tabella risultato cliccando su "Salva la tabella di risultato".
Nota: Questa tabella è costituito dal tempo in secondi e la fluorescenza normalizzata di calcio-dipendente (rettificato dalla fluorescenza di calcio-indipendente). Se precedentemente definiti, contiene anche la distanza totale tra il TRN e l'attuatore in µm e la distanza tra il TRN e l'attuatore perpendicolare alla parete del canale in µm. risultati rappresentativi dell'intensità di fluorescenza aumentano dopo stimolazione in funzione della distanza del corpo cellulare all'attuatore più tracciati in Figura 4. - Se esistono più neuroni in una registrazione (separata da più di 10 pixel), fare clic sulla scheda "Definire ROIs" nuovamente e tornare al punto 4.6.2 con il secondo neurone.
- Fare clic sulla scheda "Help" e leggi i requisiti del software e come eseguire l'analisi. Per iniziare, selezionare la scheda "Open video" specificare il percorso del file video per l'analizzatore: fare clic sul pulsante "Aprire un Video", passare alla posizione del video e aprirlo.
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Representative Results
Litografia SU-8 e Chip Bonding
Il protocollo di litografia e stampaggio PDMS seguire le procedure standard. Dettagli possono essere trovati altrove23,24,25,26. Il PDMS dovrebbe staccare la cialda senza problemi dopo l'indurimento. Se le caratteristiche di SU-8 strappare durante il peeling PDMS, o lo strato di adesione SU-8 o la silanizzazione era insufficiente. Se l'attivazione in plasma di vetrini coprioggetti e i chip PDMS non è sufficiente, legame debole può provocare perdite fuori dal canale di intrappolamento o attuatori pneumatici con conseguente degrado delle prestazioni e assenza di stimolazione. Se la perdita di liquido è evidente, il chip è inutilizzabile.
Prestazione dell'azionatore
Tutti gli attuatori PDMS e il tubo che collega il chip per il serbatoio di aria deve essere opportunamente sigillati per garantire il corretto azionamento pneumatico dei diaframmi. Ripetuto inserimento e la rimozione del tubo di PE (idraulica) danneggerà fori PDMS e portare ad una diminuzione nella pressione. Tale perdita di pressione limiterà la deflessione dell'attuatore e la forza applicata sulla pelle dell'animale immobilizzato. Deflessione del diaframma può essere misurata usando un chip vuoto (nessun animale presente) eseguire diversi cicli di azionamento con la pressione desiderata e confrontando i valori quantitativi con predizioni teoriche. La deflessione del diaframma non è stata misurata in presenza di un animale nel canale di registrazione dei colori, perché il limite della membrana e vite senza fine sono difficili da visualizzare. In questo modo non possibile calibrazione di precisione con un animale intrappolato. La tabella 1 elenca la deflessione prevista in funzione della pressione. Questi valori sono stati calcolati utilizzando la teoria della piastra elastica e dettagli possono essere trovati in Nekimken et al. 23 questa relazione dovrebbe variare con differenze di spessore del diaframma generati durante il casting di chip e altri fattori, quali l'integrità del legame tra il chip e il vetro e guarnizioni collegare il chip per le fonti di pressione. Qui, i valori erano riproducibili con leggera variazione non superiore a 1 µm a 450 kPa di pressione. Che hanno caratterizzato le prestazioni dei diaframmi per tutti i tre profili di stimoli diversi e rimandiamo il lettore interessato a Nekimken et al. 23 in sintesi, ci sono diversi fattori da considerare se i valori si discostano dalla tabella 1: 1) una perdita nei tubi o i tubi connettori, 2) il PDMS ha una diversa elasticità, che può derivare da un rapporto alternativo del polimero di base e dell'agente indurente, o 3) il PDMS ha invecchiato e continuato a reticolare nel corso del tempo. Pertanto, l'uso di chip che sono stati preparati entro un mese della loro applicazione è consigliato.
Prestazioni di intrappolamento
Dopo aver inserito i vermi nell'ingresso del chip, una leggera pressione con la siringa dovrebbe inserire un singolo animale all'interno del canale di intrappolamento e presentare la sua pelle a fianco gli sei attuatori (Figura 1). D'importanza, il naso dell'animale non ha necessariamente bisogno di sporgere nel serbatoio tampone. Invece, è più importante posizionare l'animale in modo tale che la neurite è adiacente all'attuatore più vicina e il suo corpo cellulare è entro il campo visivo del microscopio. Per ottenere l'attivazione di un neurone ottima, la distanza tra l'attuatore e il corpo cellulare dovrebbe essere regolata tale che l'attuatore si trova anteriore al corpo cellulare di interesse. Nella nostra esperienza, per i neuroni stimolati che posteriormente al corpo cellulare, nessuna attivazione avrà luogo e calcio transitori sarà assente. Immobilizzazione adeguata può essere realizzato con giovane adulti o 1 giorno di vita ermafroditi (dispositivi ottimizzati per queste due epoche sono disponibili sulla stessa maschera). Animali più piccoli saranno scivolare verso il serbatoio di raccolta o spostare lateralmente all'interno del canale di intrappolamento. Gli animali che sono troppo grandi saranno schiacciati nel canale, che potrebbe provocare l'attivazione prematura di sua TRNs e il successivo fallimento per rilevare transitori di Meccanocettore. Inoltre, rimozione di vermi di grandi dimensioni è impegnativo, che conduce alla morte dell'animale e/o intasamento del dispositivo. Con questo disegno, il neurone PLM solitamente non può essere immobilizzato completamente, quindi è libero di muoversi lateralmente e verticalmente. Anche se abbiamo attivato con successo i neuroni PLM, registrazione di transitori di calcio in questi neuroni è difficile a causa del movimento verticale della coda. Un altro disegno di cattura è stato utilizzato per registrare da PLM33.
Formazione immagine del calcio transitori e analisi
Una volta in atto, gli animali possono essere stimolati utilizzando uno degli sei attuatori. Gli sei attuatori sono posizionati per fornire stimoli meccanici a ciascuno la sei TRNs. Un controllore di flusso di microfluidica collegato a una fonte di pressione interna di 450 kPa è stato utilizzato per fornire all'animale un protocollo di stimolo costituito da un passo di 275 kPa 2-s, una rampa di 2-s 0-275 kPa e un brusio di 2-s (75 kPa, 10 Hz sinusoidale sovrapposti con un passo di 275 kPa) , ciascuno separato da un periodo di attesa di 10-s. Le sequenze di immagine contemporaneamente registrata dei transitori del calcio sono state analizzate in Figi, utilizzando un software personalizzato disponibile sul nostro account GitHub (Vedi sopra e https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Abbiamo trovato che la pressione rampe e gradini di pressione attivato TRNs solo se gli stimoli raggiunto pressioni superiori a 400 kPa. Al contrario, un robusto attivazione di tutti i TRNs stimolata mediante un buzz sinusoidale, 10-Hz a pressioni < 275 kPa è stata osservata (Figura 4). In generale, TRNs risposto meglio ad un breve stimolo sinusoidale (chiamato 'buzz'), in accordo con i rapporti precedenti utilizzando metodologie diverse1,9. La stimolazione con un ronzio è altamente efficiente, che conduce a ~ 90% di attivazione in tutti i neuroni e prove testato (Figura 4). Sorprendentemente, non c'era correlazione forte osservata su se lo stimolo è stato applicato per la dorsale o ventrale ed era indipendente della distanza tra il corpo cellulare e la posizione di stimolo sulla neurite. Gli studi futuri dovranno indagare se il ritardo della risposta massima correla con la distanza di stimolo.
Figura 1: Panoramica del design chip. (A) layout schematico di strato di fotoresist e il chip che ne risulta con tutti i connettori indicati. Ci sono sei dita di azionamento, tre su ogni lato del canale centrale dell'intrappolamento. Barra della scala = 3 mm (B) fotografia del dispositivo microfluidico con PDMS legato al vetrino coprioggetto e collegato alla tubazione in ingresso il verme e le prese di vite senza fine. Unica fra le dita di azionamento è collegato alla fonte di pressione, mentre gli altri cinque non sono occupati. Parti della figura sono state riprodotte dal riferimento23 sotto licenze creative common. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: primo piano del canale centrale dell'intrappolamento e procedura di intrappolamento. (A) lo schema di massima del canale dell'intrappolamento. I pilastri sul lato di ingresso verme aiutano a orientare il worm e facilitare il caricamento degli animali. Le dita di azionamento possono essere pressurizzate e rientro un diaframma sottile nel campione di intrappolati. Barra della scala = 200 µm. (B) rappresentante fotogramma video di un verme essere intrappolato nel canale orizzontale. Il canale è progettato tali che il worm viene a posare attraverso sei attuatori pneumatici. Coda è a sinistra, testa a destra. Posizione dei neuroni tocco individuale (TRNs) sono indicati dalle frecce e classificati nella figura. Barra della scala = 100 µm (in tutti i pannelli). Parti della figura sono state riprodotte dal riferimento23 sotto licenze creative common. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Panoramica del plugin fornito Figi per analizzare le tracce di calcio acquisite con questo protocollo. Il software si avvia un'interfaccia utente grafica. La prima scheda ("Open video") dell'interfaccia utente Mostra il pulsante per aprire un video, Visualizza il percorso e il primo fotogramma del video aperto. La seconda scheda ("ROIs di definire") include il pulsante per definire un neurone del ricevitore di tocco, una casella di controllo per attivare il pulsante "Definire attuatore" e il pulsante "Definire attuatore". Nella parte inferiore, viene visualizzato il primo fotogramma del video. Nella parte superiore della terza scheda ("analisi"), vengono visualizzati i parametri registrabili per l'analisi di immagine. La parte centrale mostra il pulsante "Avvia analisi". Nella parte inferiore, barra di avanzamento indica lo stato di avanzamento dell'analisi corrente. Nella quarta scheda, "Risultati", il risultato viene visualizzato come un grafico dell'intensità di fluorescenza relativa nel tempo. Nella parte inferiore, c'è un pulsante per salvare la tabella dei risultati. Nella scheda Quinta, "Aiuto", un testo di aiuto viene visualizzato mostrando i requisiti per il software di analisi e istruzioni su come usarlo. Figura adattata da riferimento23 sotto licenze creative common. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: singoli neuroni rispondono agli stimoli meccanici. Micrografo di fluorescenza rappresentante (A) di GCamP6s con l'etichetta del neurone del ricevitore di AVM tocco prima e dopo stimolazione meccanica con un ronzio. Barra della scala = 10 µm. scala colore = 1.500-3.500 valori di grigio. (B) protocollo di stimolo tra cui 2 eccitazione di diaframma s che rappresenta un passo di 275 kPa, una rampa di 275 kPa e un seno (75 kPa; 10 Hz) sovrapposto con un passo di 275 kPa (ronzio). (C) traccia di intensità normalizzata GCamP6s (media ± SEM come area ombreggiata) registrato da AVM stimolati con il profilo indicato nella B di tipo selvaggio animali (verde, n = 14) e animali mutanti in Meccanocettore canale subunità mec-4 (blu, n = 10), vale a dire noto per facilitare le risposte allo stress meccanico. Questo indica che i transienti sono indotti dagli stimoli meccanici applicati. Parti della figura sono state riprodotte dal riferimento23 sotto licenze creative common. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Pressione (kPa) | Significa deflessione (µm) | SD | Deflessione prevista (µm) |
| 0 | -0.01 | 0,01 | 0 |
| 50 | 0,77 | 0,26 | 0.607143 |
| 100 | 1.57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0.65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3,86 | 0.79 | 3.03571 |
| 300 | 4,61 | 0.79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0,82 | 4,25 |
| 400 | 5.92 | 0,82 | 4.85714 |
| 450 | 6,43 | 0,75 | 5.46429 |
Tabella 1: valori di deflessione sperimentale per applicate pressioni che vanno da 0 – 450 attesi kPa e loro predizioni teoriche. Dati derivati per uno stimolo di passo. Media ± SD. Questi dati sono stati acquisiti con un canale vuoto intrappolamento.
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Discussion
Questo protocollo viene illustrato un metodo per la consegna precisa stimolazione meccanica per la pelle di un verme intrappolato in un chip microfluidico. Esso è destinato a facilitare l'integrazione di stimoli fisici per rispondere alle domande biologiche e mira a snellire mechanobiology ricerca nei laboratori biologici. Questo metodo estende precedenti saggi per valutare la funzione dei neuroni che mechanosensory in c. elegans. Tecniche quantitative e semi-quantitativa precedenti misurato le forze1,34 e comportamento35, ma erano difficili da integrare con imaging ad alta risoluzione dell'attività neuronale. Crediamo quindi che l'uso di questo chip estende le applicazioni attuali e le prestazioni sono ottimizzata per la stimolazione dei neuroni necessari per tocco delicato. Abbiamo ottimizzato la deflessione dell'attuatore per raggiungere 5 µm, che è uno stimolo abbastanza forte per raggiungere quasi massimale risposte neuronali. Con lievi variazioni, noi crediamo che questo disegno potrebbe essere usato per stimolare i recettori tattili duro, come nocicettori PVD che innervano la superficie del corpo36.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi
Se nessuna camera pulita è disponibile per la litografia SU-8, un box pulito da banco o SU-8 soft-Litografia stazioni dotate di lampade UV, piastre di cottura programmabile e spin coaters possono essere utilizzate. Un'alternativa a basso costo per la produzione di microfluidic dispositivi che evita l'uso di strutture di camera pulita possono anche essere seguita26.
Nella progettazione, abbiamo implementato una tecnica esistente di intrappolamento, che immobilizza un singolo animale in un canale di microfluidica. Il design di trappola è adattato da un dispositivo che viene utilizzato per studiare la sensazione olfattiva nel verme36, ma non è l'unica opzione praticabile per sopprimere il movimento del verme. Altre strategie sono state segnalate per contenere worm in dispositivi microfluidici: CO2, elettroforetica, immobilizzazione compressiva11,37,38 sono stati usati e potrebbero essere integrate in una versione modificata progettazione.
Abbiamo consegnato la pressione per i canali di azionamento utilizzando una pompa di pressione piezoelettrico, disponibili in commercio che possono controllare e consegnare fino a 800 kPa da una sorgente di pressione esterna. Abbiamo collegato la pompa ad aria compressa nella ricerca edificio, che è in grado di erogare ~ 450 kPa. Se è disponibile alcuna sorgente di aria compressa, un serbatoio di gas compresso, inerte (ad es., N2) può essere utilizzato. Questo avrebbe il vantaggio di fornire pressioni più elevate e generando grandi deformazioni, ma richiederebbe anche raccordi ad alta pressione per connettersi al controller di pressione per il chip. Fabbricare il chip da PDMS più morbida è un modo alternativo per aumentare la pressione indotta deformazioni.
In questo esperimento, la presa della pompa di pressione è collegato al chip PDMS attraverso aperture ricevente 1 mm (ad es., fori di perforazione) collegato con interconnettori privo di adesivo e reversibile che consiste di un press-fit 20 G metallo-tubo inserito in un PE della tubazione. Questi hanno dimostrati di resistere a pressioni fino a 700 kPa39. Cura deve essere presa durante l'inserimento ripetuto, tuttavia, come il PDMS intorno ai fori tende a strappare e quindi limitare le prestazioni o rendere inutilizzabile il chip. Per questo motivo, il tubolare metallico è stato inserito una volta e sinistra inserito il chip, senza rimozione e inserimento di ripetutamente.
Fasi critiche
La stimolazione è trasmessa da un canale di azionamento pressurizzata, che fa rientrare la pelle. La deformazione risultante e l'attivazione di neuroni di Meccanocettore può essere imaged con alta risoluzione su un microscopio a fluorescenza ottica e/o confocale set-up. Diversi fattori possono ostacolare la rilevazione delle risposte GCaMP. In primo luogo, c. elegans esprimere un recettore luce blu30 in molti neuroni, tra cui TRNs21,23, che attiva le cellule dopo illuminazione con blu (488 nm) luce. Così, c. elegans di imaging utilizzando il sensore codificato geneticamente calcio GCaMP6s attiverà suoi neuroni all'illuminazione, oscurando i transienti di calcio attivati dalla stimolazione meccanica23. Lavorando in background mutante lite-1 o utilizzando sensori di movimento calcio rosso-spostato evita questo confonda. In secondo luogo, meccanicamente indotta calcio transitoria potrebbe non essere rilevato se il profilo di stimolo non corrisponde alla sensibilità dei meccanorecettori. Abbiamo Impossibile rilevare l'attivazione per rampe e passaggi di alto-ampiezza, ma evocato segnali estremamente elevati dopo stimolazione con stimoli moderata dinamica (ad es., 200 - kPa buzz). Infine, TRNs abituare a un stimoli ripetuti consegnato con breve (< 60 s) intervalli di interstimulus. Pertanto, è importante per sequenze di stimolazione di design che minimizzano assuefazione tranne in casi dove l'assuefazione è in fase di studio.
Si consiglia di filtrare tutte le soluzioni, come detriti e polvere nei buffer può facilmente ostruire il canale piccolo intrappolamento. Ulteriormente, gli animali devono essere età-sincronizzato e dimensione-abbinati al design del chip; animali più piccoli rispetto agli adulti giovani saranno far scorrere attraverso il dispositivo o non riescono a essere trattenuto e animali più grandi non possono entrare i canali di registrazione e sono in pericolo di scoppio e/o intasamento il chip. In caso di intasamento, applicazione di una pressione eccessiva all'entrata del flusso worm o gravità può pulire i canali, ma potrebbe anche portare al fallimento del raccordo.
Come accennato nella sezione risultati, diversi fattori possono portare a un errore nel programma di analisi. Se si verificano problemi nella compilazione del codice, verificando che il più recente software di Fiji è in esecuzione e che Fiji è utilizzando il compilatore Java più recente è consigliato. Se il programma è in esecuzione, ma non ci sono imprevisti risultati si prega di assicurarsi che il film registrato ha un 50-frame buffer prima la reale stimolazione meccanica viene eseguita per garantire una corretta stima della fluorescenza della linea di base e lo sfondo. Ulteriormente, il campo di vista di attività-dipendente (GCaMP6s), il rosso e il verde, canale attività indipendente (tagRFP) si suppone essere proiettata la metà superiore e inferiore del chip della fotocamera, rispettivamente. Se il divisore di fascio ottico proietta le immagini sulla metà sinistra e destra del sensore, spegnere la fotocamera 90° per ottenere l'orientamento desiderato durante la registrazione o ruotare la serie di immagini in una fase di pre-elaborazione. Inoltre, il programma identifica il neurone dalla relativa fluorescenza e avrà esito negativo se il rapporto di segnale-rumore o il contrasto è troppo basso. In questo caso, cambiare il tempo di esposizione e/o di intensità di eccitazione può risolvere il problema. Il programma si arresta anche se il neurone lascia il campo di vista durante la registrazione, nel quale caso il neurone deve essere posizionato al centro del campo visivo prima di iniziare una nuova acquisizione.
Limiti della tecnica
Il design attuale consente la stimolazione dei neuroni Meccanocettore parete del corpo come i nocicettori PVD e il TRNs, ma non i meccanorecettori che innervano la regione testa del verme, come FLP e cenere. Si è limitato a pressioni < 700 kPa. Per pressioni più grandi, raccordi tubo diversi devono essere impiegati. Poiché la pressione di alimentazione qui non supera 500 kPa, la pressione massima possibile applicare era limitata a 450 kPa. Il calcio transitori osservati qui segnano il confine superiore del segnale previsto. Un'altra limitazione per la progettazione dei nostri attuatori è loro proporzioni. In linea di principio, più sottili diaframmi consentirebbe più grandi deformazioni, ma strutture con elevato rapporto di aspetto sono difficili da fabbricare in modo affidabile. Se più grandi deformazioni sono essenziali, più ampia attuatori o deformazioni parallele da entrambi i lati potrebbero essere utile, così come presentato da Cho et al. 29
Anche se possiamo monitorare deformazione del diaframma, è difficile misurare la forza applicata durante la stimolazione pneumatica dei canali di comando. La limitazione di principio è che l'area di contatto dell'attuatore non è ben definito. Infatti, l'attuatore stesso è elastico e deformante durante l'azionamento, che cambia il raggio di contatto con l'aumento di deflessione. Con questi avvertimenti in mente, possiamo stimare che un rientro di 5 µm (circa 300 kPa pressione di azionamento in un chip vuoto) è previsto per applicare circa 3,8 µN al worm secondo le stime di rigidità di verme di Petzold et al. 34 poiché la dipendenza della forza della corrente un neurone varia a worms con differenti rigidezze1,34, tuttavia, monitoraggio rientro come una misura dell'intensità dello stimolo anziché forza è raccomandata.
Speriamo che la diffusione del presente protocollo consentirà agli utenti approfittare della microfluidica per mechanobiology ricerca utilizzando c. elegans come sistema modello e quindi accelerare il progresso della scienza su questo importante argomento nel campo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli di Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez per supporto nella progettazione del dispositivo e della generazione di animali mutanti. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH R01EB006745 (di BLP), R01NS092099 (di MBG), K99NS089942 (per MK), F31NS100318 (per ALN) e ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito dell'Unione europea Horizon 2020 ricerca e innovazione programma ( Convenzione n. 715243 di sovvenzione MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
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