Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

С помощью микрофлюидика устройства для механической стимуляции и высокой резолюции визуализация C. elegans

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56530
* These authors contributed equally

Summary

Новые инструменты для исследований mechanobiology нужно, чтобы понять как механическому активизирует биохимические пути и вызывает биологических реакций. Здесь мы представляем новый метод для селективного механической стимуляции подвижности животных с microfluidic ловушку, позволяя с высоким разрешением изображений клеточных реакций.

Abstract

Одна центральная цель mechanobiology — понять взаимное влияние механических напряжений на белки и клетки. Несмотря на свою важность влияние механических напряжений на клеточную функцию еще плохо поняты. В частности этот пробел в знаниях существует потому, что некоторые инструменты позволяют одновременное деформации ткани и клетки, визуализации клеточной активности в живых животных, а также эффективное ограничение подвижности в противном случае мобильных модель организмов, таких как нематода Caenorhabditis elegans. Небольшой размер C. elegans делает их отличный матч для устройств на базе микрофлюидика исследований, и были представлены решения для иммобилизации, используя microfluidic приборы. Хотя эти устройства позволяют для изображений с высоким разрешением, животное полностью помещены в полидиметилсилоксан (PDMS) и стекла, ограничение физического доступа для доставки механической силы или электрофизиологических записей. Недавно мы создали устройство, которое интегрирует пневматические приводы с треппинга дизайн, который совместим с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии. Срабатывание канал отделяется от червя треппинга канала Тонкая диафрагма PDMS. Эта диафрагма отклоняются в сторону червя, применяя давление от внешнего источника. Устройство можно ориентировать отдельных mechanosensitive нейронов. Активация этих нейронов образы в с высоким разрешением с показателями генетически закодированный кальция. Эта статья содержит общий метод с использованием штаммов C. elegans , выражая индикатор активности кальция чувствительных (GCaMP6s) в их сенсорный рецепторных нейронов (TRNs). Метод, однако, не ограничено TRNs, ни кальция датчики для тестирования, но может быть расширена до других механически чувствительные клетки или датчиков.

Introduction

Осязание обеспечивает животных с важной информации об окружающей их среде. В зависимости от силы touch воспринимается как безобидные, приятным или болезненным. Ткани деформации во время касания определяется специализированных механорецептора клетки, встроенные в коже, которые Экспресс рецептор белков, наиболее часто иона каналы. Шаги, связывание силы восприятие ионного канала активации во время касания и боль полностью не поняты. Еще меньше известно о как ткани кожи фильтры механической деформации и ли механорецепторов обнаруживать изменения напряжения или подчеркнуть1,2,3. Этот разрыв в понимании возникает, в частности, из-за отсутствия подходящих инструментов для применения точной механической стимуляции к поверхности кожи живых животных соблюдая ответы на клеточном уровне. В то время как широко используется атомно-силовой микроскопии применяются и измерения силы в изолированных клеток4,5 , а также для того чтобы активировать Piezo1 рецепторов в живых клетках6, подобные эксперименты с использованием живых животных, особенно C. elegans, были крайне сложной из-за внутренней мобильности субъекта. Эта проблема традиционно обойти с помощью ветеринарной или хирургические класса Цианакрилатный клей для иммобилизации отдельных животных агар прокладки1,,78,9. Этот подход был продуктивным, но имеет ограничения, связанные с навыки, необходимые для иммобилизации, склеивания и поверхности мягкой агар механического соблюдения. Микрофлюидика стратегия является бесплатная альтернатива, которая позволяет избежать некоторых осложнений, связанных с склеивания.

Нематоду C. elegans является генетическим модельный организм с полностью сопоставленных нервной системы, которая, из-за размера животного, является подходящим для микрофлюидика технологии. Устройства на базе микрофлюидика предлагают преимущество, что в противном случае чрезвычайно мобильный животных может удерживаться во время выполнения с высоким разрешением изображения и доставки соответствующих нейро модулирующее раздражителей. С помощью microfluidic технологий, живущих животных может быть иммобилизованным без вреда10,11, включение мониторинга поведенческой активности за весь срок12,13 и с высоким разрешением Визуализация активности нейронов14,,1516,17. Кроме того, многие механорецептора нейронов, необходимые для чувство касания и боль можно охарактеризовать их физиологических1,8, Механическая4,18,19и молекулярных уровень20,21,22.

C. elegans чувства нежный механических раздражителей для ее стенки тела с помощью шести TRNs, три из которых иннервируют переднюю животного (ALML/R и АВМ) и три из которых иннервируют животного кзади (PLML/R и PVM). Ионного канала молекулы, необходимые для преобразователя усилие в биохимических сигнал были широко изучены в своем TRNs8. Эта статья представляет microfluidic платформа23 , что позволяет исследователям для применения точных механических сил к коже иммобилизованных C. elegans аскариды, при чтении из деформации ее внутренних тканей, оптических изображений. Помимо представления четкой механических раздражителей, кальция переходные процессы можно записан в механорецептора нейронов с субцеллюлярные резолюции и коррелирует с морфологической и анатомические особенности. Устройство состоит из центрального треппинга канала, который держит одиночного животного и представляет ее кожи рядом с шести каналов пневматического привода (рис. 1 и рис. 2). Шесть каналов расположены вдоль канала треппинга для доставки механических раздражителей для каждого из шести TRNs червя. Эти каналы отделены от камеры треппинга тонкой PDMS мембраны, которые могут управляться источника давления наружного воздуха (рис. 1). Мы калиброванные прогиб относительно давления и проведения измерений в этой статье. Каждый привода могут быть рассмотрены индивидуально и используется для стимулирования механорецептора выбора. Давление доставляется с помощью пьезо driven давление насоса, но любое альтернативное устройство может быть использовано. Мы покажем, что протокол давления может использоваться для активации TRNs в естественных условиях и продемонстрировать эксплуатации устройства, пригодные для доставки механических раздражителей для взрослых C. elegans, Загрузка взрослых животных в устройств, выполняющих кальция изображений эксперименты и анализа результатов. Изготовление устройство состоит из двух основных этапов: 1) Фотолитография сделать плесень от Су-8; и 2) формования PDMS сделать устройство. Ради краткости и ясности читатели упоминаются ранее опубликованные статьи и протоколы24,25 для получения инструкций о том, как для создания плесени и устройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. устройство изготовление

  1. Загрузите файл прилагаемый маски (дополнительный файл 1) и создания хром маски с помощью службы коммерческой или собственного объекта. Как наименьший размер на устройстве составляет 10 мкм (толщина мембраны привода), убедитесь, что маска имеет достаточно высоким разрешением, в пределах ± 0,25 мкм, надежно производить функции.
  2. Выполните стандартные методы фотолитографии Су-8 (например, ссылается на24,25,26) для изготовления пресс-формы для последующего производства PDMS устройств; Ниже приводится краткое изложение шагов.
    Примечание: Су-8 представляет собой светочувствительный материал, который сшивки при воздействии ультрафиолетового света (максимальное поглощение ~ 365 Нм). Инструкции производителя можно используйте в качестве отправной точки для определения параметров обработки для софт выпекать, воздействия (УФ) и после выпечки.
    1. Депозит Су-8 2002 на кремниевой пластины и спин пальто его приблизительный толщина 2 мкм, для улучшения адгезии мелких структур. Софт Выпекать на горячей плите за 1 мин на 95 ° C, слегка чрезмерно разоблачить (УФ) всю поверхность (~ 100 МДж/см2) и после выпечки на горячей плите 2 мин на 95 ° C.
    2. Спин шерсть 47-мкм толстый слой Су-8 2050 для определения функций устройства. Использовать скорость вращения 500 об/мин для 15 s (130 ускорение об/мин/сек) и затем 2000 об/мин 90 s (260 об/мин/с ускорение). При необходимости, повторить и отрегулировать скорость отжима для получения надлежащей толщины фоторезиста.
    3. Софт Выпекать на горячей плите 2 мин при температуре 65 ° C, а затем 7 мин на 95 ° C. Разоблачить фоторезиста согласно инструкции производителя (~ 160 МДж/см2) с использованием Хром маски и Лонг pass фильтр для обеспечения прямой боковые стенки.
    4. Извлеките пластины и после выпечки на горячей плите для 1 мин при температуре 65 ° C и 7 минут при 95 ° C.
    5. Растворите неэкспонированные Су-8 с разработчиком и чистый с 2-пропанол.
    6. Выпекать пластин на конфорку на 180 ° C в течение 30 мин (жесткий испеките) для стабилизации фоторезиста функции.
  3. Делать PDMS реплики из Су-8 модели, используя стандартный реплики, литье методы27.
    1. Лечения Су-8 формы с trichloromethylsilane (ВТК) паров для PDMS адгезию (silanization).
      Предупреждение: ВТК токсичных и реагирующие с водой.
      1. Место узорной пластин в стойку пластин в пределах колпаком вакуумного эксикатора в Зонта свободной воды или водорастворимый реагентов.
      2. Под капотом используйте капельницы применять 1 капля ВТК стеклянную посуду и поместите в эксикаторе.
      3. Закройте крышку эксикаторе и позволяют ВТК пара для смазывания пластин для по крайней мере 20 мин.
      4. Выход, а затем открыть эксикаторе. Открыть крышку колпаком и удалить пластин, с помощью пластиковых пинцета. Поместите в Петри или алюминиевая фольга лодку для PDMS реплики литья. Распоряжаться ВТК покрытием материалов в надлежащей опасных отходов.
    2. Mix PDMS (в соотношении 10:1) с использованием 40 g базового полимера и 4 g PDMS полимеризации агента.
    3. Смесь залить Су-8 плесени и Дега смесь для по крайней мере 30 минут в вакуумной камере.
    4. Cure для по крайней мере 6 ч при 70 ° C в духовке.
  4. Поднимите PDMS вафля, установив горизонтальные пластины на плоской поверхности и тщательно отшелушивающим PDMS. Не сгибайте Вафля вверх во время этого шага, как он может разорвать плесень.
    Примечание: Неполные адгезии Су-8 пластин или неполной silanization может привести к разрушению Су-8 структур во время этого шага.
  5. Нарежьте PDMS вокруг устройства отдельных чипов таким образом, что устройства поместится на coverslip 24 x 60 мм.
  6. С помощью 1-мм биопсии удар, сделайте отверстия в входе, две розетки и шесть приводов с использованием 1-мм биопсии удар. Цель 2 мм Диаметр кругов по краям устройства.
  7. Бонд PDMS чипов стекла Крышка скользит.
    1. Разоблачить обе поверхности до 80 W кислорода плазмы (30 s).
    2. Осторожно поместите подвергается поверхности PDMS на внешней поверхности скольжения обложки для конформных печати.
    3. Отжиг устройства на горячей плите (100 ° C, 10 мин).
      Примечание: Недостаточная связь может привести к провалу устройства из-за утечки.

2. Подготовка микроскопа

Примечание: Трансгенных животных: Экспресс кальция индикатор, например GCaMP6s28 или других генетически закодированный деятельности зонд в neuron(s) интереса (например, РНН); Совместное Экспресс деятельность независимые флуоресцентный белок, излучающих в другой волны исправить для небольших боковых и вне фокуса движение артефакты, которые возникают из-за механической стимуляции. Программное обеспечение для автоматизированного анализа отслеживает и компенсирует движение индуцированные изменения в интенсивности деятельности зонда. Червь штаммов GN69223 (или AQ323629) Экспресс GCaMP6s (или GCaMP6m) и кальция независимые tagRFP под контролем promotor mec-7. Кроме того GN692 содержит мутации lite-1(ce314), который предотвращает активацию TRNs благодаря голубой световой датчик lite-130 во время возбуждения флуоресценции GCaMP6s23.

  1. Создать систему микроскоп для одновременного возбуждения GCaMP и ППП.
    1. Использовать постоянный источник света и двухдиапазонный возбуждения фильтр, который пропускает только голубой и желтый свет, или источник света, который излучает только длин волн в определенной пропускной способности таких одновременных голубой (0,77 МВт) и желтого (1.21 МВт) светодиодные источники возбуждения для одновременного возбуждения флуоресценции кальций зависимых и независимых, соответственно.
    2. Использование цифровой камеры для включения записи микроскопии изображений.
      Примечание: Большинство камер поставляются с программным обеспечением для захвата изображений. Кроме того есть свободно доступного программного обеспечения, который может использоваться для управления камерой и, возможно, другие части системы микроскопии.
    3. Отрегулируйте интенсивность возбуждения, основанный на интенсивности флуоресценции чтобы избежать насыщения камеры.
  2. Используете, в зависимости от выбора источника возбуждения должен быть оснащен фильтром возбуждения флуоресценции куб.
    Примечание: 488 нм GFP и 580 Нм mCherry возбуждения фильтр был использован здесь.
    1. Добавление splitter луча в куб для отражения голубой и желтый свет и препровождающее зеленый и красный свет.
    2. Оборудовать микроскоп с 10 X цель и цель высокого увеличения (например, 63 X / 1.32 NA нефти) сосредоточиться возбуждения света на образце.
  3. Смонтируйте splitter луча перед камерой для одновременной записи GCaMP и кальция независимые сигнала. Убедитесь, что splitter луча дихроичное зеркало (длинный пас, отсечение по 570 Нм) отделить красный и зеленый свет, с использованием одного фильтра выбросов для зеленого (пропускания центрированного 525 Нм с шириной 50 Нм) и один выбросов фильтр на красный свет (пропускания центрированного 632 нанометр с 60 Нм ширина).
  4. Проект зеленой и красной флуоресценцией на верхней половине (зеленый) и нижней половины (красный), соответственно из камеры чип (см. рис. 3). Эта ориентация является необходимым условием для предоставленного анализа программного обеспечения.

3. животных подготовка

  1. Подготовить синхронизированы возраст молодых взрослых или взрослый день один C. elegans, как описано ранее, порта де ла Рива и др. 31
  2. Подготовьте microfluidic чип.
    1. Подключение потока водохранилище гравитации (~ 60 см выше уровня чип) содержит отфильтрованные буфера M9 (0,2 мкм Полиэфирсульфон шприц фильтр) к одной розетке чипа. Подключите другой выход к одной розетке контейнер для отходов двух розетки, то есть, в колбу фильтра. Подключение на выходе из отходов контейнер к перистальтического насоса.
      Примечание: Используйте полиэтилен (ПЭ) труб для всех подключений и металлические трубы для подключения труб PE на чип. Таким образом все отходы решения будет вспыхнул из чипа и собираются в контейнер для отходов. Поток, проходящий через каналы выход создает нежный всасывания, который будет держать червя плотно во время процесса более поздних треппинга.
    2. Подготовить приближающую состоящий из 50-мм длиной ПЭ трубы (0.9652-мм OD, ID 0.5842-мм) с металлической трубки (манометрическое размер 23TW, 0.635-мм OD) на обоих концах. Пресс подходят эти соединения в каждой из шести пальцев срабатывания и входе червь (см. Рисунок 1). Оставьте эти Энергообъединение в чип, как неоднократные удаления приводит к носить на PDMS отверстия.
  3. Установите фишку на микроскопе. Получить 2 – 5 червей в каплю отфильтрованных буфера M9 (0,2 мкм шприц фильтр) и использовать 1 мл шприц, чтобы втянуть их в ПЭ трубы (0.9652-мм OD, ID 0.5842-мм), подключен к 1 мл шприц, осторожно потянув поршень. Держите животных в PE трубки, а не в шприц.
    Примечание: Слишком много червей или нефильтрованную решения в чип может привести к засорению.
  4. ПЭ трубы шприца для соединения на входе червь (рис. 1 и рис. 2) Подключите чипа. Активировать самотечный поток, открыв клапан и начать Перистальтический насос. Затем осторожно нажмите шприце поршень шприца для перемещения животных в канал треппинга соблюдая канал под микроскопом с объективом 10 X в brightfield режиме.
    Примечание: Иногда появляются пузырьки воздуха не представляют собой проблему; они обычно автоматически перемещаются в розетку. Некоторые животные могут быть «стоянке» в зале ожидания и используются последовательно.
    1. После загрузки животное в канал треппинга (см. также рис. 2), отрегулируйте его положение, осторожно нажимать или вытягивать поршень шприца, чтобы положение головы животного в конической формы передней части канала.
    2. Убедитесь в том, что червь (взрослый день 1) имеет правильный размер, чтобы быть в ловушке в чипе.
      1. Если червь не заполняют весь сечение канала от носа до ближе к концу тела (не включая кончик хвоста) или червь движется вдоль оси канала без перемещения на поршень шприца , удаления червя, нажимая на поршень шприца, до тех пор, пока она исчезает из канала треппинга и загрузить новый (см. шаг 3,8).
    3. Переключиться в режим флуоресцентным микроскопом и выше увеличение объектива (40 X или выше) и проверить ли neurite нейрона интереса приходит лежать через диафрагму одного из приводов. Если нет, то отрегулировать положение животного, потянув или толкает поршень. Если это не помогает, удалите червь и загрузить новую.
  5. Сосредоточиться на клеток тело нейрона интерес и Подключите соединительный кабель привода ближе к нейрон на передней стороне тела клетки к программируемой давление насоса с помощью трубы PE.
    1. Если эксперимент требует, измерение расстояния между приводом и нейрон, переместить поле зрения, так как находятся в поле зрения и channelwall параллельно верхнего и нижнего края изображения.
  6. Определите давление протокол, с помощью программируемых давления насоса.
    Примечание: Этот протокол можно подобрать нужный эксперимент.
    1. Начните с постоянным давлением 0 кПа для времени, соответствующий по крайней мере 50 изображений последовательности изображений (необходимых для нормализации). Для изображений частота 10 Гц это соответствует 5 s. добавить требуемый стимул сигнала и давление и определить длину стимул в качестве второго шага.
      Примечание: Для стимулирования TRNs, синусоидального сигнала (т.е., 75 кПа, 10 Гц) накладывается с шагом (т.е., 275 kPa) рекомендуется как он создает большой ответ нейронов.
    2. Если эксперимент требует дополнительных стимулов, включают в течение по крайней мере 10 s при постоянном давлении 0 кПа между раздражителей. Перед включением давление насоса, убедитесь, что инструмент давления находится в постоянном 0 кПа во избежание случайного стимуляции червя до фактической эксперимент.
  7. Запустите протокол изображений и давления.
    1. В программное обеспечение приобретения изображения камеры настроить последовательность изображений на 10 Гц, с использованием Выдержка 100 мс для продолжительности давление протокола. Отрегулируйте интенсивность возбуждения, таким образом, что увеличение максимальной флуоресценции не насыщают камеры. Сохранение изображений в формате *.tif с по крайней мере 50 изображений перед первым стимулом для нормализации.
    2. Начало изображений протокол в приобретение изображений программное обеспечение и давление протокол в программном обеспечении программируемый насоса. Во время записи, соблюдайте ли нейрон интерес яркое пятно в районе 10 x 10 точек, не двигаться дальше, чем 10 пикселей в последовательных изображений и остается в поле зрения во время записи.
      Примечание: Если это не сделано, программное обеспечение для анализа завершится неудачей. Яркие пятна (то есть, Аутофлюоресценция) вокруг нейрон сделать чистой записи трудно нейронов. Чтобы это исправить, удалите червь из ловушки и загрузить новый червь в чипе. Если червь движется слишком много, попробуйте новую запись же червя и наблюдать движение червя. Если проблема не устранена червь может быть слишком мал, чтобы быть в ловушке. В этом случае удалить этот вирус и загрузки немного больше червя в ловушку.
    3. При желании, запись сигналы от нескольких нейронов в поле зрения одновременно до тех пор, как нейроны разделены по крайней мере 10 пикселей во время всей записи.
    4. Расследовать привыкания, выполните эксперимент многократно на животных.
  8. Удаление червя из канала треппинга.
    1. Если желательно сохранить червь для последующего исследования, отсоедините точек чип к самотечный поток и контейнер для отходов. Аккуратно нажмите поршень шприца до тех пор, пока весь червь выталкивается через треппинга канал в канал потока.
    2. Нажимайте на поршень шприца до тех пор, пока животное появляется в капельку вне чип. Отсоедините шприц, включая ПЭ трубы на входе в систему червь, использовать его для аспирационная червей в капли и передаче его на тарелку агар.
    3. Если это нежелательно держать червя, удаления червя, нажимая на поршень шприца, до тех пор, пока весь червь выталкивается через треппинга канал в канал потока; Самотечный поток и всасывания Перистальтический насос будет нести животное из чипа и в контейнер для отходов.

4. анализ

  1. Скачать и установить новые версии Фиджи32.
  2. Загрузите и установите последнюю версию java SDK.
    Примечание: В случае необходимости, удалить или переименовать папку java внутри папки Фиджи для Фиджи использовать недавно установленной java-компилятор.
  3. Программное обеспечение с открытым Фиджи.
    1. Проверить, работает ли программное обеспечение недавно установленной java-компилятор, открыв ' плагины | Утилиты | ImageJ | Свойства.
  4. Скачать файл pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, см. Дополнительные 2 файла).
  5. Перетащите и drop .java-файл в окне программного обеспечения, чтобы открыть его как плагин.
  6. Скомпилируйте и запустите файл pokinganalyzer*.java, нажав клавиши Ctrl + R в Фиджи; графический интерфейс пользователя (тыкать анализатор) откроет (рис. 3).
    1. Нажмите на вкладку «Справка» и читать о требованиях программного обеспечения и как для выполнения анализа. Чтобы начать, выберите вкладку «Open video» укажите расположение видео файлов для анализатора: нажмите кнопку «Открыть видео», перейдите к местоположению видео и открыть его.
      Примечание: Программное обеспечение начинается с этой вкладкой открыт. Если он не открыт, при запуске нового анализа перейдите на вкладку «Open video». Если видео имеет формат a.tif, программа будет внутренне открыть видео и отображать первое изображение в нижней части интерфейса. Если изображение не видео, которое необходимо проанализировать, нажмите на кнопку «Открыть видео», чтобы открыть еще один видео.
    2. Чтобы продолжить, нажмите на вкладке «Определить ROIs». В этой вкладке определяют позицию TRN. Обратите внимание, что первое изображение открыл видео отображается в нижней части этой tab. Нажмите на кнопку «Определить TRN» и нажмите на нейрон в верхней части изображения, которая должна отображать GCaMP флуоресценции.
    3. Необязательно: Если привод виден в верхней половине изображения программа может автоматически отслеживать расстояние между нейрон и привода при желании. Для этого проверьте «Определить привода»? -коробки, нажмите на кнопку «Определить привода» и нажмите на привод в верхней части изображения.
    4. Нажмите на вкладку «Анализ» определить стоимость приобретения изображения. Введите число в поле или нажмите кнопку вверх или вниз для увеличения или уменьшения числа. Если в предыдущей вкладке «Определить привода»? -установлен флажок, определить размер ячейки камеры, масштаб и биннинга фактор, поэтому программа может рассчитать расстояние.
    5. Нажмите на кнопку «Начать анализ».
      Примечание: Программа теперь будет отслеживать нейрон, его флуоресценции в последовательности изображений в верхней половине (кальций-зависимых) и в нижней половине (кальция независимых) из последовательности изображений. Для учета движения нейрон в плоскости запись программы будет расследовать площадью 10 x 10 точек вокруг расположение нейрон в предыдущем изображении найти положение нейрона на следующем рисунке. Он будет вычислить флуоресценции в обеих половинах, исправляя для флуоресценции фон (Fbg) и деления на флуоресценции в первых 50 изображений (0F):
      Equation 1
      Флуоресценции изменения в зеленый, зависит от активности канала (FCa2 +), которые вызваны нейрон движения из плоскости по перекодирования являются затем корректируются с помощью флуоресценции в красный, деятельность независимый канал (F Корр) и предварительно стимул стандартное отклонение кальций зависимые (sdCa2 +) и независимых флуоресцирования (sdКорр):
      Equation 2
    6. Программа покажет ход его выполнения в строке состояния в нижней части интерфейса; когда в строке состояния достигает 100%, нажмите на вкладке «Результаты». Если в строке состояния останавливается до 100%, программа даст сообщение об ошибке, указывающее причину, по которой программа не может анализировать видео.
      1. Если соотношение сигнал-шум является слишком низким, программа не может идентифицировать нейрона; Параметры обработки изображений в последующих записях.
      2. Если нейрон покидает поле зрения во время записи, программа не может отслеживать его больше и остановится. Для последующих записей место нейрон в середине поля зрения в начале записи.
      3. Если некоторые регионы в поле зрения перенасыщен, автоматизированный анализ будет производить неправильные результаты. Для последующих записей убедитесь, что флуоресценции сигнал не насыщают сенсора камеры.
    7. На вкладке «Результаты» результат отображается в верхней части. Сохраните файл *.txt, табуляцией таблицы результатов, нажав на «Сохранить таблицы результатов».
      Примечание: Эта таблица состоит из времени в секундах и нормализованных кальций зависимых флюоресценция (исправлены флуоресценции кальция независимых). Если определен ранее, он также содержит общее расстояние между РНН и привода в мкм и расстояние между РНН и привода, перпендикулярно стене канала в мкм. Представитель результаты интенсивности флуоресценции увеличение после стимуляция против расстояние клетки тела к ближайшим привода строятся на рисунке 4.
    8. Если есть несколько нейронов в одной записи (разделенных более чем 10 пикселей), снова нажмите на вкладке «Определить ROIs» и вернуться к шагу 4.6.2 с второй нейрон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Су-8 литографии и склеивание стружки
Литография протокол и формования PDMS следуют стандартные процедуры. Подробности можно найти в других23,24,25,26. PDMS следует очистить от пластин без проблем после отверждения. Если во время пилинга PDMS сдирать особенности Су-8, Су-8 адгезионный слой или silanization было недостаточно. Если плазма активация coverslips стекла и PDMS чипов не является достаточным, слабого связывания может привести к утечки из каналов треппинга или пневматическими приводами, что приводит к снижению производительности и отсутствие стимуляции. Если утечки жидкости является очевидным, чип является непригодным для использования.

Производительности привода
Все приводы PDMS и трубы, соединения чип резервуар воздуха должны быть должным образом опечатаны для обеспечения надлежащего пневматические срабатывания мембраны. Повторяющиеся вставки и удаления труб PE (сантехника) повреждения PDMS отверстия и приведет к снижению давления. Такая потеря давления будет ограничивать привода отклонение и нагрузка на кожу иммобилизованных животного. Отклонение диафрагмы могут быть измерены с помощью пустой чип (животное настоящее), выполняя несколько циклов срабатывания с требуемого давления и сравнения количественных значений с теоретическими предсказаниями. Измеряется не отклонение диафрагмы в присутствии животного в канале треппинга, потому что трудно визуализировать границы мембраны и червя. Это делает точность калибровки с захваченных животное не представляется возможным. В таблице 1 перечислены ожидаемые отклонения как функция давления. Эти значения были рассчитаны с использованием теории эластичнаѬ прокладка и детали можно найти в Nekimken и др. 23 ожидается, что это отношения различаются с отличиями в Диафрагма толщины, созданные во время чип литья и другие факторы, например целостности связей между чипа и стекла и уплотнения соединения чип источники давления. Здесь значения были воспроизводимы с небольшие различия, не превышающей 1 мкм при 450 кПа давление. Мы характеризуют производительность диафрагмы для всех трех профилей различных стимулов и передать заинтересовавшийся читатель Nekimken и др. 23 в резюме, там находятся несколько факторов, чтобы рассмотреть, если значения отклоняются от Таблица 1: 1) утечки в НКТ или трубки разъемы, 2 PDMS имеет различных эластичность, которая может быть результатом альтернативного соотношение базового полимера и отвердителя, или 3) PDMS возрасте и продолжал crosslink с течением времени. Поэтому рекомендуется использовать чипы, которые были подготовлены в течение месяца их применения.

Треппинг производительности
После вставки червей в входе микросхемы, мягкое давление с шприц следует поместить один одного животного внутри канала треппинга и представит свою кожу вместе с шестью приводы (рис. 1). Важно отметить, что нос животного не обязательно выступают в буфер водохранилище. Вместо этого это более важно для позиции животного, что neurite примыкает к ближайшей привода и его тело клетки находится в поле зрения микроскопа. Для достижения оптимального активации нейронов, расстояние между приводом и клетки тела должна быть скорректирована таким образом, что привод находится впереди тела клетки интереса. По нашему опыту для нейронов стимулировали кзади клетки тела, активация не займет место и кальция транзиентов будет отсутствовать. Надлежащего иммобилизации может быть достигнуто с молодой взрослый или один - день-старый гермафродитки (на ту же маску доступны устройства, оптимизированные для этих двух возрастов). Мелкие животные будут скольжения в накопительном резервуаре или переместить боково внутри канала треппинга. Животных, которые являются слишком большими будут втиснулся в канал, который может привести к преждевременной активации его TRNs и последующий отказ для обнаружения механорецептора транзиентов. Кроме того удаление больших червей сложной, приводит к смерти животного и/или закупорку устройства. С этой конструкции PLM нейрон обычно не могут быть иммобилизованным полностью, так что это свободно передвигаться по горизонтали и по вертикали. Хотя мы успешно активировали PLM нейронов, запись кальция переходные процессы в этих нейронов затруднено из-за вертикальное движение хвоста. Для записи с PLM33был использован другой дизайн треппинга.

Визуализация кальция переходных процессов и анализа
Однажды в месте, животные могут быть стимулируется с помощью одного из шести приводов. Шесть приводы расположены доставить каждому из шести TRNs механических раздражителей. Microfluidic потока контроллер подключен к источнику доме давление 450 кПа использовался для доставки к животному стимул протокол, состоящий из 2-х 275 kPa шаг, 2-s 0 – 275 kPa пандус и шум 2-s (75 кПа, 10 Гц синус накладывается с шагом 275 kPa) , разделенные период ожидания 10-s. Одновременно записанные изображения последовательности кальция транзиентов были проанализированы в Фиджи, используя заказ программное обеспечение, доступное на нашем счету GitHub (см. выше и https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Мы обнаружили, что рампы давления и давления шаги активации TRNs, только если раздражители давление выше 400 кПа. Напротив надежные активации всех TRNs стимулируется с помощью синусоидального, 10 Гц buzz < 275 кПа давление было отмечено (рис. 4). В общем, TRNs ответил лучше краткий синусоидального раздражитель (называется «шум»), по согласованию с предыдущих докладах с использованием различных методологий1,9. Стимуляция с buzz является высокоэффективным, ведущих к ~ 90% активации во всех нейронов и испытания испытания (рис. 4). Удивительно там был не сильная корреляция наблюдается на ли стимул был применен к дорсальной и вентральной стороне и независимо от расстояния между тела клетки и стимул позицию по neurite. Будущие исследования должны расследовать ли задержка максимальной реакции коррелирует с расстоянием стимул.

Figure 1
Рисунок 1: обзор дизайн чипа. (A) принципиальная схема photomask и результате чип с всеми разъемами указано. Есть шесть пальцев срабатывания, три на каждой стороне канала центрального треппинга. Шкалы бар = 3 mm. (B) фотография microfluidic устройства с PDMS приклеенная к coverslip и подключен к труб в входе червя и червь точек. Только один из пальцев срабатывания подключен к источнику давления, в то время как остальные пять не заняты. Части фигуры были воспроизведены из23 ссылку под creative Общие лицензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: макро треппинга центрального канала и треппинг процедуры. (A) схема, чертеж треппинга канала. Столбов на входе червь помогают ориентировать червь и облегчения загрузки животных. Срабатывание пальцы могут находиться под давлением и отступ Тонкая диафрагма в ловушке образца. Шкалы бар = 200 µm. (B) представитель видеокадра червя застревания в горизонтальном канале. Канал рассчитан таким образом, что червь заходит лежал через шесть пневматические приводы. Хвост слева, руководитель находится справа. Расположение отдельных касания рецепторных нейронов (TRNs) обозначается стрелками и обозначены на рисунке. Шкалы бар = 100 мкм (в всех панелей). Части фигуры были воспроизведены из23 ссылку под creative Общие лицензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: обзор предоставляемых Фиджи плагин для анализа следы кальция, приобретенных с настоящим Протоколом. Программное обеспечение запускается графический интерфейс пользователя. Первая вкладка («Open video») из интерфейса пользователя показывает кнопку, чтобы открыть видео, он показывает путь и первый кадр открытые видео. Вторая вкладка («определить трансформирования») включает в себя кнопку, чтобы определить касание нейрон рецептор, флажок для активации кнопку «Определить привода» и кнопку «Определить привода». В нижней части отображается первый кадр видео. В верхней части вкладки третья («анализ») отображаются настраиваемые параметры для анализа изображения. Средняя часть показывает кнопку «Начать анализ». В нижней части индикатор показывает прогресс текущего анализа. В четвертом вкладка «Результаты», результат отображается как граф относительной флуоресценции интенсивности с течением времени. В нижней части есть кнопка для сохранения таблицы результатов. В пятой вкладке «Help», текст справки отображается показаны требования программного обеспечения для анализа и инструкции на как использовать его. Рисунок из23 ссылку под creative Общие лицензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: отдельных нейронов реагировать механических раздражителей. (A) представитель флуоресценции Микрофотография GCamP6s помечены нейрон рецептор ПТрМ касания до и после механической стимуляции с buzz. Шкалы бар = 10 мкм. Цветовая гамма = 1500-3500 серые значения. (B) протокола стимул, включая 2 s диафрагмы возбуждения, представляющий шаг 275 kPa, 275 kPa пандус и синус (75 кПа; 10 Гц) накладывается с шагом 275 kPa (шум). (C) нормированный GCamP6s интенсивности трассировки (средний ± SEM в затененной области) записанные с АВМ стимулируется с профилем, показано в B дикого типа животных (зеленый, n = 14) и мутанта животных в механорецептора канала Субблок mec-4 (синий, n = 10), то есть известные для облегчения ответов к механическим воздействиям. Это означает, что переходные процессы индуцированные прикладной механических раздражителей. Части фигуры были воспроизведены из23 ссылку под creative Общие лицензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Давление (кПа) Значит, прогиб (мкм) SD Ожидаемые прогиб (мкм)
0 -0.01 0.01 0
50 0,77 0.26 0.607143
100 1,57 0,58 1.21429
150 2.32 0,65 1.82143
200 3.13 0.74 2.42857
250 3.86 0,79 3.03571
300 4.61 0,79 3.64286
350 5.3 0,82 4.25
400 5.92 0,82 4.85714
450 6.43 0.75 5.46429

Таблица 1: ожидаемые значения экспериментальной прогиб для прикладной давлениях от 0-450 кПа и их Теоретические предсказания. Данные, полученные для ступенчатого. Означать ± SD. Эти данные были приобретены с каналом пустой треппинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол демонстрирует метод для доставки точной механической стимуляции кожи аскариды, захваченных в microfluidic чип. Он предназначен для облегчения интеграции физических стимулов для ответов на вопросы биологического и стремится рационализировать mechanobiology исследований в области биологических лабораториях. Этот метод расширяет предыдущие анализы для оценки функции mechanosensory нейронов в C. elegans. Предыдущие методы количественного и полуколичественного измеряется силы1,34 и поведение35, но было трудно интегрировать с высоким разрешением изображений активности нейронов. Поэтому мы считаем, что использование этого чипа расширяет текущие приложения и его производительность оптимизирована для стимуляции нейронов, необходимых для нежное прикосновение. Мы оптимизировали прогиб привода до достижения 5 мкм, которая является достаточно мощным стимулом для достижения почти максимальной нейронных ответов. С небольшими вариациями мы считаем, что этот проект может использоваться для стимулирования суровых сенсорный таких рецепторов, как PVD ноцицепторами, которые иннервируют поверхности тела36.

Модификации и устранение неполадок
Если не чистой комнате доступен для литографии Су-8, может использоваться benchtop чистые коробки или Су-8 софт литография станций, оснащенных УФ-лампы, программируемые плитой и спин Коатеры. Дешевая альтернатива для производства microfluidic, также могут быть устройства, которые избегает использования чистых помещений за26.

В конструкции мы внедрили треппинга технике, в результате которой обездвиживает одного животного в канале microfluidic. Ловушка дизайн приспособлен от устройства, которое используется для изучения обонятельные ощущения в червь36, но он не является единственным жизнеспособным вариантом для подавления червь движения. Другие стратегии, как сообщается, держать червей в microfluidic приборы: CO2, электрофореза, сжимающие иммобилизации11,,3738 были использованы и могут быть интегрированы в модифицированных дизайн.

Мы поставили давление срабатывания каналы с помощью коммерчески доступных, пьезоэлектрический давление насоса, которые можно контролировать и доставить до 800 кПа от источника внешнего давления. Мы соединили насос для сжатого воздуха в исследовании потенциала, который способен доставлять ~ 450 кПа. Если доступен не источник сжатого воздуха, могут использоваться танк сжатых, инертного газа (например, N2). Это будет иметь дополнительное преимущество, обеспечивая более высокого давления и создания больших деформаций, но также потребует высокого давления фитинги для подключения к контроллеру давления на чип. Изготовление чип от мягкого PDMS является альтернативным способом для увеличения давления индуцированной деформаций.

В этом эксперименте на выходе из насоса давление подключен к PDMS чип через получение отверстия 1-мм (например, удар отверстий) подключены с клей свободно и реверсивные Энергообъединение, состоящий из пресс fit 20 G метал трубки вставляется в PE трубки. Они показали противостоять давлению до 700 кПа39. Необходимо соблюдать осторожность во время неоднократных вставки, однако, как PDMS вокруг отверстия, как правило, рвать и таким образом ограничить производительность или сделать чип непригодным для использования. По этой причине металлические трубы был вставлен один раз и осталось подключен чип, без удаления и вставки неоднократно.

Важнейшие шаги
Стимулирование осуществляется под давлением срабатывания канал, который смещает кожу. Результирующие деформации и механорецептора нейронах Активация может быть imaged с высоким разрешением на микроскоп оптический флуоресценции или конфокальный set-up. Ряд факторов может затруднить обнаружение ответов GCaMP. Во-первых, C. elegans Экспресс голубой свет рецептор30 многих нейронов, в том числе TRNs21,23, который активирует клетки после освещения с синим (488 нм) свет. Таким образом визуализации C. elegans с использованием генетически закодированный кальция датчик GCaMP6s будет активировать свои нейроны после освещения, заслоняя кальция транзиентов активированную механической стимуляции23. Работа в фоновом режиме мутант lite-1 или используя датчики активности смещается красный кальция избегает этой confound. Во-вторых, механически индуцированной кальция переходных могут не обнаруживаться, если профиль стимул не соответствует чувствительности механорецепторов. Мы удалось обнаружить активации для высокоамплитудных шаги и пандусы, но вызвала крайне высокие сигналы после стимуляции с умеренной динамика стимулы (например, 200 кПа - шум). Наконец, TRNs приучать неоднократные раздражители выступил с коротким (< 60 s) interstimulus интервалы. Таким образом важно, чтобы дизайн стимуляции последовательностей, которые сводят к минимуму привыкания, за исключением, в тех случаях, где изучается привыкания.

Мы рекомендуем, фильтрация всех решений, как мусор и пыль в буферах легко может засорить небольшой треппинга канала. Кроме того животные должны быть синхронизированы возраст и размер соответствует дизайн чипа; меньше, чем у молодых взрослых животных будет скользить через устройство или не быть сдержанными и более крупных животных нельзя вводить треппинга каналы и находятся в опасности разрыва и/или закупорку чип. В случае засорения, применение избыточного давления на входе потока червя или тяжести может очистить каналы, но также может привести к сбою установки.

Как уже упоминалось в разделе результаты, ряд факторов может привести к сбоя в программе анализа. Если проблемы возникают в компиляции кода, проверка, что самые последние Фиджи программа выполняется и что Фиджи использует новейшие Java-компилятор рекомендуется. Если программа работает, но есть неожиданные результаты пожалуйста убедитесь, что записанный фильм имеет 50-кадрового буфера перед фактической механической стимуляции осуществляется для обеспечения надлежащей оценки базовых и фон флуоресценции. Кроме того поле зрения зеленый, зависящих от деятельности (GCaMP6s) и красного, деятельность независимый (tagRFP) канал предполагается быть проецируется в верхней и нижней половине камеры чип, соответственно. Если splitter луча оптической проектирует изображения на левой и правой половины датчика, поверните камеру на 90° для получения желаемой ориентации во время записи или повернуть стеки изображений на этапе предварительной обработки. Кроме того Программа идентифицирует нейрон, его флуоресценции и завершится ошибкой, если отношение сигнал шум или контраст слишком низка. В этом случае изменение интенсивности и/или воздействия времени возбуждения может решить эту проблему. Программа также остановится, если нейрон покидает поле зрения во время записи, в котором случае нейрон должен располагаться в центре поля зрения перед началом нового приобретения.

Ограничения метода
Настоящий дизайн позволяет стимуляции нейронов механорецептора стенки тела как ноцицепторами PVD и TRNs, но не механорецепторов, которые иннервируют червя глава региона, таких как ФЛП и ПЕПЛА. Она ограничена до давления < 700 кПа. Для больших давлений различные трубы необходимо применять. Так как подача давления здесь не превышает 500 кПа, максимальное давление, можно применять был ограничен до 450 кПа. Кальция переходные процессы наблюдаемые здесь Марк верхнюю границу ожидаемого сигнала. Еще одним ограничением для разработки наших электроприводов является их пропорции. В принципе тонкие мембраны позволит большей деформации, но структур с высоким соотношением сторон трудно изготовить надежно. Если необходимы большие деформации, шире приводы или параллельных деформации с обеих сторон может быть полезным, представленный Чо et al. 29

Хотя мы можем контролировать деформацию диафрагмы, трудно измерить силы, действующие во время пневматического стимуляции срабатывания каналов. Принцип ограничения является площадь контакта привода не четко. Это потому, что сам привод упругих и деформирующий во время срабатывания, который изменяет контактный радиус с увеличением прогиб. С этими оговорками в виду мы можем оценить, что 5 мкм отступ (около 300 кПа срабатывание давление в пустой чип) предсказал применять около 3,8 µN червя по оценкам жесткость червь Петцольд et al. 34 с зависимость силы нейрональных тока варьируется в черви с различными жесткость1,34, однако, мониторинг отступы, как мера интенсивности стимула вместо силы рекомендуется.

Мы надеемся, что распространение настоящего Протокола поможет пользователям воспользоваться микрофлюидика mechanobiology исследований с использованием C. elegans как модель системы и таким образом ускорить процесс улучшения положения науки по этому важному вопросу на местах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Сандра н. Маносалвас-Kjono, Ladpli Пурим, Фарах Мемон, Дивья Gopisetty и Вероника Санчес для поддержки в конструкции устройства и поколение мутанта животных. Это исследование было поддержано NIH грантов R01EB006745 (БЛП), R01NS092099 (для MBG), K99NS089942 (для МК), F31NS100318 (для ALN) и получил финансирование от Европейского Совета исследований (ERC) под Европейского союза Horizon 2020 исследований и инноваций программы () Грантовое соглашение № 715243 в МК).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric - imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
  2. Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
  3. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
  4. Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
  5. Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
  6. Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
  7. Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
  8. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
  9. Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
  10. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  11. Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
  12. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  13. Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
  14. Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
  15. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
  16. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  17. Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
  18. Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
  19. Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
  20. Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
  21. Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
  22. Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
  23. Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
  24. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
  25. Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
  26. Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
  27. Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
  28. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  29. Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
  30. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
  31. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
  34. Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
  35. Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
  36. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  37. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
  38. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
  39. Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
  40. Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).

Tags

Неврология выпуск 132 микрофлюидика мягкие литография C. elegans mechanobiology mechanosensation динамика кальция
С помощью микрофлюидика устройства для механической стимуляции и высокой резолюции визуализация <em>C. elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim,More

Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter