Summary
Nuevas herramientas para la investigación de la mecanobiología se necesitan entender cómo mecánico estrés activa vías bioquímicas y produce respuestas biológicas. Aquí, nos muestra un nuevo método de estimulación mecánica selectiva de animales inmovilizados con una trampa de microfluidos que permite proyección de imagen de alta resolución de las respuestas celulares.
Abstract
Un objetivo central de la mecanobiología es entender el efecto recíproco del estrés mecánico sobre las proteínas y las células. A pesar de su importancia, la influencia del estrés mecánico sobre la función celular es todavía mal entendida. En parte, esta brecha de conocimiento existe porque algunas herramientas permiten deformación simultánea de tejidos y células, la proyección de imagen de la actividad celular en los animales vivos y eficiente de movilidad en organismos modelo lo contrario altamente móviles, tales como el nematodo Elegans de Caenorhabditis. El tamaño pequeño de C. elegans hace un excelente partido a los dispositivos de investigación basada en microfluídica, y se presentan soluciones para la inmovilización con dispositivos microfluídicos. Aunque estos dispositivos permiten obtener imágenes de alta resolución, el animal está completamente dentro de polidimetilsiloxano (PDMS) y el vidrio, limita el acceso físico para la entrega de fuerza mecánica o las grabaciones electrofisiológicas. Recientemente, hemos creado un dispositivo que integra los actuadores neumáticos con un diseño de captura compatible con microscopía de fluorescencia de alta resolución. El canal de actuación se separa del canal atrapa el gusano por una delgada membrana PDMS. Este diafragma se encuentra en el lado de un gusano aplicando presión desde una fuente externa. El dispositivo puede dirigirse a las neuronas individuales mechanosensitive. La activación de estas neuronas es fotografiada en alta resolución con indicadores calcio codificados genéticamente. Este artículo presenta el método general utilizando cepas de C. elegans expresando su indicador de actividad de calcio-sensible (GCaMP6s) en sus neuronas de receptor del tacto (TRNs). El método, sin embargo, no se limita a TRNs ni sensores de calcio como una punta de prueba, pero puede ser ampliado a otras células mecánicamente sensibles o sensores.
Introduction
El sentido del tacto ofrece animales información crucial acerca de su entorno. Dependiendo de la fuerza aplicada, touch es percibida como inocua, placentera o dolorosa. La deformación del tejido durante el tacto es detectada por células especializadas mechanoreceptor incrustadas en la piel que expresan proteínas del receptor, comúnmente canales del ion. Los pasos a fuerza de percepción a la activación de canal de iones durante el tacto y el dolor no se entienden completamente. Menos aún se sabe sobre cómo el tejido de la piel filtros de deformación mecánica y si mecanorreceptores detectan cambios en la tensión o estrés1,2,3. Esta brecha en la comprensión se presenta, en parte, de la falta de herramientas adecuadas para aplicar estímulos mecánicos precisos a la superficie de la piel de un animal vivo observando las respuestas a nivel celular. Mientras que la microscopía de fuerza atómica se ha utilizado extensivamente para aplicar y medir fuerzas en células aisladas4,5 y activan los receptores Piezo1 en la vida de las células6, experimentos similares usando animales vivos, especialmente C. elegans, han sido notoriamente difícil debido a la movilidad intrínseca del sujeto. Este desafío es eludido tradicionalmente mediante el uso de pegamento del cianocrilato de grado quirúrgico o veterinario para inmovilizar animales individuales en agar cojines1,7,8,9. Este enfoque ha sido productivo, pero tiene limitaciones relacionadas con la habilidad necesaria para la inmovilización por encolado y la superficie del agar suave sobre el cumplimiento de la mecánica. Una estrategia de la microfluídica es una alternativa gratuita que evita algunas de las complicaciones vinculadas a pegar.
El nematodo C. elegans es un organismo modelo genético con un sistema nervioso completamente asignado que, debido al tamaño del animal, es un buen ajuste para la tecnología de microfluídica. Dispositivos de microfluidos ofrece la ventaja que los animales lo contrario extremadamente móviles pueden ser refrenados mientras se realiza la proyección de imagen de alta resolución y entrega de los estímulos neuro-modulador pertinentes. Con la ayuda de microfluidos tecnologías, animales vivos pueden ser inmovilizadas sin daño10,11, que permite el monitoreo de la actividad conductual sobre la vida de12,13 y alta resolución proyección de imagen de la actividad neuronal14,15,16,17. Además, muchas neuronas de mechanoreceptor necesarias para el sentido del tacto y del dolor puede ser caracterizado en su fisiológico1,8, mecánico4,18,19y molecular nivel20,21,22.
C. elegans detecta estímulos mecánicos suaves a la pared del cuerpo usando seis TRNs, tres de los cuales inervan el animal anterior (ALML más baja/R y AVM) y tres de los cuales inervan la parte posterior del animal (PLML/R y PVM). Las moléculas de canal de iones necesarias para la transducción de una fuerza aplicada en una señal bioquímica se han estudiado ampliamente en su TRNs8. Este artículo presenta una plataforma de microfluidos23 que permite a los investigadores a aplicar fuerzas mecánicas precisas a la piel de un inmovilizado de C. elegans ascáride, mientras leía a la deformación de los tejidos internos por proyección de imagen óptica. Además de presentar estímulos mecánicos bien definidos, transitorios de calcio pueden ser grabados en las neuronas mechanoreceptor con resolución subcelular y correlacionados con características morfológicas y anatómicas. El dispositivo consta de un canal central reventado que tiene un solo animal y presenta su piel junto a seis canales de accionamiento neumático (figura 1 y figura 2). Los seis canales se colocan a lo largo del canal de captura para entregar estímulos mecánicos a cada uno de seis TRNs del gusano. Estos canales están separados de la cámara de captura por finas membranas PDMS, que pueden ser impulsados por una fuente de presión de aire externa (figura 1). Calibrado de la desviación con respecto a la presión y proporcionar las medidas en este artículo. Cada actuador puede ser abordado individualmente y utilizado para estimular la mechanoreceptor de elección. La presión se suministra con una bomba de presión piezo-conducido pero puede utilizarse cualquier dispositivo alternativo. Mostramos que el protocolo de presión puede utilizarse para activar TRNs en vivo y demostrar funcionamiento dispositivos adecuados para entregar estímulos mecánicos para adultos C. elegans, carga de animales adultos en dispositivos, realizar proyección de imagen del calcio experimentos y analizar los resultados. Fabricación de dispositivo consta de dos pasos principales: 1) Fotolitografía para hacer un molde de SU-8; y 2) PDMS para hacer un dispositivo de moldeo. Aras de la brevedad y claridad, los lectores se conocen previamente publicados artículos y protocolos24,25 para obtener instrucciones sobre cómo producir los moldes y dispositivos.
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Protocol
1. fabricación de dispositivo
- Descargar el archivo adjunto la máscara (1 archivo suplementario) y generar una máscara de cromo con un servicio comercial o servicio interno. Como la dimensión más pequeña en el dispositivo es el μm 10 (espesor de la membrana del actuador), asegúrese de que la máscara tiene una resolución lo suficientemente alta, dentro de ± 0.25 μm, producir confiablemente las características.
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Seguir métodos de fotolitografía estándar SU-8 (p. ej., hace referencia a24,25,26) para fabricar el molde para la posterior producción de dispositivos PDMS; un resumen de los pasos se enumera a continuación.
Nota: SU-8 es un material fotosensible, que vínculos cruzados sobre la exposición a la luz ultravioleta (máxima absorción ~ 365 nm). Utilice las instrucciones del fabricante como punto de partida para determinar los parámetros de procesamiento para el soft-cuece al horno, exposición (UV) y después de hornear.- Depositar SU-8 2002 en una oblea de silicio y una capa de la vuelta a un espesor aproximado de 2 μm, para mejorar la adherencia de pequeñas estructuras. Suave-cueza al horno en una placa caliente durante 1 minuto a 95 ° C, ligeramente sobre-exponer superficie (Ultravioleta) el entero (~ 100 mJ/cm2) y después cocer al horno en una placa caliente durante 2 min a 95 ° C.
- Spin-capa una capa gruesa de 47 μm de 2050 SU-8 para la definición de las características del dispositivo. Utilizar una velocidad de centrifugado de 500 rpm por 15 s (130 rpm/s aceleración) y entonces 2.000 rpm durante 90 s (260 rpm/s aceleración). Si es necesario, repita y ajustar la velocidad de giro para conseguir el grosor adecuado de photoresist.
- Suave-cueza al horno en una placa caliente por 2 min a 65 ° C y luego de 7 min a 95 ° C. Exponer el photoresist según las instrucciones del fabricante (~ 160 mJ/cm2) con un filtro de máscara y pase de largo de chrome para las paredes laterales rectas.
- Retirar la oblea y la cueza al horno en una placa caliente durante 1 min a 65 ° C y 7 min a 95 ° C.
- Disolver una SU-8 con el desarrollador y limpiar con 2-propanol.
- Cueza al horno la oblea en la placa caliente a 180 ° C por 30 min (duro-cueza al horno) estabilizar la fotoresistencia características.
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Hacer una réplica PDMS del modelo SU-8 usando réplica estándar de métodos27de moldeo.
- Tratar el molde de SU-8 con el vapor de trichloromethylsilane (TCMS) para reducir la adherencia PDMS (silanización).
PRECAUCIÓN: TCMS es tóxicos y reactivos con el agua.- Colocar la oblea con motivos en un estante de la oblea dentro de un desecador de vacío del frasco en una campana de humos libre de agua o de reactivos solubles en agua.
- Bajo el capó, utilice un gotero para aplicar 1 gota de TCMS para un plato de vidrio y coloque dentro del desecador.
- Cierre la tapa de Desecador y permiten TCMS vapor cubrir la oblea para por lo menos 20 minutos.
- De ventilación y a continuación, abra el desecador. Abra la tapa de la campana de cristal y retirar la oblea con unas pinzas de plástico. Coloque en un barco de papel aluminio o placa de Petri para el moldeado de réplica PDMS. Disponer de materiales recubiertos de TCMS en el adecuada residuos peligrosos.
- Mezcla de PDMS (proporción 10:1) utilizando 40 g de la base del polímero y 4 g PDMS agente endurecedor.
- Vierta la mezcla sobre el molde de SU-8 y desgasificar la mezcla durante al menos 30 minutos en una cámara de vacío.
- La cura por al menos 6 horas a 70 ° C en un horno.
- Tratar el molde de SU-8 con el vapor de trichloromethylsilane (TCMS) para reducir la adherencia PDMS (silanización).
- Levante la PDMS la oblea la oblea horizontal sobre una superficie plana y con cuidado, despegando el PDMS. No doble la oblea hacia arriba durante este paso, como puede romper el molde.
Nota: Adherencia incompleta de SU-8 a la oblea o silanización incompleta puede resultar en la destrucción de las estructuras SU-8 durante este paso. - Cortar PDMS alrededor de los dispositivos de fichas individuales que los dispositivos se ajustan en un cubreobjetos de 24 x 60 mm.
- Con un punzón de biopsia de 1 mm, hacer agujeros en la entrada, dos salidas y seis actuadores con un punzón de biopsia de 1 milímetro. Objetivo de los 2 mm de diámetro círculos alrededor de los bordes del dispositivo.
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Virutas de PDMS de Bond de cubreobjetos de vidrio.
- Exponer ambas superficies para plasma de oxígeno de 80 W (30 s).
- Coloque suavemente la superficie PDMS expuesta en la superficie expuesta de la cubierta para un sello conformal.
- Recueza el dispositivo sobre una placa caliente (100 ° C, 10 minutos).
Nota: Vinculación insuficiente puede conducir a la falla del dispositivo debido a la fuga.
2. preparación del microscopio
Nota: Animales transgénicos: expresar un indicador de calcio como GCaMP6s28 u otra sonda actividad genéticamente codificados en el neuron(s) de interés (por ejemplo, TRN); Co expresan una proteína fluorescente de actividad independiente emite en una longitud de onda diferentes para corregir pequeñas laterales y artefactos de movimiento fuera de enfoque que surgen debido a la estimulación mecánica. El software de análisis automatizado de las pistas y compensa los cambios inducidos por el movimiento en la intensidad de la sonda de la actividad. El gusano cepas GN69223 (o AQ323629) expresa GCaMP6s (o GCaMP6m) y el tagRFP de calcio-independiente bajo el control del promotor del mec-7. Además, GN692 contiene la mutación lite-1(ce314), que impide la activación de TRNs debido al sensor de luz azul lite 130 durante la excitación de la fluorescencia de GCaMP6s23.
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Establecer un sistema de microscopio para la excitación simultánea de GCaMP y solicitud de propuestas.
- Use ya sea una continua fuente de luz y un filtro de excitación de banda dual que transmite la luz sólo cian y amarillo o una fuente de luz que emite solamente longitudes de onda en un ancho de banda definido como cian simultánea (0,77 mW) y amarillo (1,21 mW) fuentes de excitación de LED para excitación simultánea de la fluorescencia dependiente de calcio e independiente, respectivamente.
- Utilizar una cámara digital para habilitar la grabación de imágenes de microscopía.
Nota: La mayoría de las cámaras cuentan con un software para la adquisición de la imagen. Alternativomente, hay software libre disponible que puede utilizarse para controlar la cámara y posiblemente también otras partes del sistema de microscopía. - Ajustar la intensidad de excitación basada en la intensidad de la fluorescencia para evitar la saturación de la cámara.
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Utilice un cubo de fluorescencia que dependiendo de la elección de la fuente de excitación debe estar equipada con un filtro de la excitación.
Nota: Un GFP de 488 nm y 580 nm mCherry filtro de la excitación fue utilizado aquí.- Añadir un divisor de haz al cubo para reflejar luz cian y amarillo y transmitir luz verde y roja.
- Equipar al microscopio con 10 X objetivo y un objetivo de alta magnificación (p. ej., 63 X / 1.32 aceite NA) para enfocar la luz sobre la muestra de la excitación.
- Montar un divisor de haz frente a la cámara para la grabación simultánea de la GCaMP y la señal de calcio-independiente. Asegúrese de que el divisor de viga tiene un espejo dicroico (paso de largo, corte a 570 nm) para separar la luz verde y rojo utilizando un filtro de emisión verde (pasabanda centrado en 525 nm 50 ancho nm) y filtro de una emisión de luz roja (pasabanda centrado en 632 nm con 60 nm ancho).
- Proyecto fluorescencia verde y roja en la mitad superior (verde) y mitad inferior (rojo), respectivamente, de la cámara de la viruta (ver figura 3). Esta orientación es un prerrequisito para el software de análisis previsto.
3. animal preparación
- Preparar sincronizadas de edad joven adulto o adulto día uno C. elegans, como se describe anteriormente por Porta-de-la-Riva et al. 31
- Preparar el chip de microfluidos.
- Conecte el depósito de flujo de gravedad (~ 60 cm sobre el nivel del chip) que contiene filtrado buffer M9 (filtro de jeringa de 0,2 μm polyethersulfone) una salida de la viruta. Conectar la salida de otros a una salida de un contenedor de residuos de dos tomas de corriente, es decir, un matraz de filtración. Conecte la otra toma del contenedor de residuos a una bomba peristáltica.
Nota: Utilice tubería de polietileno (PE) para todas las conexiones y tubo de metal accesorios para conectar la tubería de PE para el chip. De esta manera todas las soluciones de residuos lavadas fuera de la viruta y recogidas en el contenedor de residuos. El flujo a través de los canales de salida crea una succión suave que mantendrá el gusano ajustada durante el proceso de captura más adelante. - Preparar interconexiones que consta de 50 mm largo PE tubería (0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID) con tubería metálica (calibre tamaño 23TW, 0,635 mm OD) en ambos extremos. Press-fit estas interconexiones en cada uno de los seis dedos de actuación y en la entrada del gusano (ver figura 1). Deje estas interconexiones en el chip, como extracción repetida lleva a desgaste en los orificios PDMS.
- Conecte el depósito de flujo de gravedad (~ 60 cm sobre el nivel del chip) que contiene filtrado buffer M9 (filtro de jeringa de 0,2 μm polyethersulfone) una salida de la viruta. Conectar la salida de otros a una salida de un contenedor de residuos de dos tomas de corriente, es decir, un matraz de filtración. Conecte la otra toma del contenedor de residuos a una bomba peristáltica.
- Coloque el chip en el microscopio. Escoger de 2 a 5 gusanos en una gota de filtraron buffer M9 de (filtro de jeringa de 0,2 μm) y utilizan una jeringa de 1 mL para elaborar en una tubería de PE (0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID) conectada a una jeringa de 1 mL, tirando el émbolo suavemente. Mantener los animales en el tubo de PE y no en la jeringa.
Nota: Muchos gusanos o soluciones sin filtrar en el chip pueden conducir a la obstrucción. - Conecte la tubería de PE de la jeringa a la interconexión en la entrada del gusano (figura 1 y figura 2) de la viruta. Activar el flujo por gravedad mediante la apertura de la válvula y encienda la bomba peristáltica. Ahora presione suavemente el émbolo de la jeringa para mover los animales en el canal de captura mientras observa el canal bajo el microscopio con objetivo 10 X en modo de brightfield.
Nota: de vez en cuando aparecen burbujas de aire no plantean un problema; generalmente automáticamente se mueven en el tomacorriente. Varios animales se pueden 'aparcados' en la sala de espera y utilizar secuencialmente.- Después de cargar el animal en el canal de captura (véase también figura 2), ajustar su posición suavemente empujando o tirando del émbolo de la jeringa a la posición de la cabeza del animal en la forma cónica de la parte delantera de la canal.
- Asegúrese de que el gusano (1 de día adulto) tiene el tamaño adecuado para ser atrapados en el chip.
- Si el gusano no llena la sección representativa entera del canal desde la nariz hasta cerca del final del cuerpo (no incluyendo la punta de la cola) o el gusano se mueve a lo largo del eje del canal sin mover el émbolo de la jeringa , retire el gusano presionando el émbolo de la jeringa hasta que desaparece desde el canal de captura y cargar uno nuevo (ver paso 3.8).
- Cambiar al modo de la fluorescencia del microscopio y una lente más alta (40 X o superior) y compruebe si la neurita de la neurona de interés viene a mentir a través de la membrana de uno de los actuadores. Si no es así, ajuste la posición del animal tirando o empujando el émbolo. Si eso no funciona, retire el gusano y cargar uno nuevo.
- Centrarse en el cuerpo celular de la neurona de interés y conecte la interconexión del actuador más cercana a la neurona en la parte anterior del cuerpo de la célula a una bomba de presión programable mediante tubo de PE.
- Si el experimento requiere medir la distancia entre el actuador y la neurona, mover el campo de visión, por lo tanto en el campo de visión y el channelwall es paralela al borde superior e inferior de la imagen.
- Definir un protocolo de presión mediante la bomba de presión programable.
Nota: Este protocolo se puede ajustar a la experiencia deseada.- Comience con una presión constante de 0 kPa durante un tiempo correspondiente a por lo menos 50 imágenes de la secuencia de imagen (necesaria para la normalización). Para una tasa de proyección de imagen de 10 Hz esto corresponde a 5 s. Añadir una forma de onda del estímulo deseado y la presión y definir la duración del estímulo como un segundo paso.
Nota: Para estimular el TRNs, una forma de onda sinusoidal (es decir, 75 kPa, 10 Hz) superpuesto con un paso (es decir, 275 kPa) es recomendable ya que genera una gran respuesta neuronal. - Si el experimento requiere estímulos adicionales, incluyen un periodo de al menos 10 s a una presión constante de 0 kPa entre estímulos. Antes de encender la bomba de presión, asegúrese de que la presión del instrumento está en kPa 0 constante evitar la estimulación accidental del gusano antes del experimento real.
- Comience con una presión constante de 0 kPa durante un tiempo correspondiente a por lo menos 50 imágenes de la secuencia de imagen (necesaria para la normalización). Para una tasa de proyección de imagen de 10 Hz esto corresponde a 5 s. Añadir una forma de onda del estímulo deseado y la presión y definir la duración del estímulo como un segundo paso.
- Ejecutar el protocolo de la proyección de imagen y presión.
- En el software de adquisición de imagen de la cámara, establecer una secuencia de imágenes de 10 Hz con un tiempo de exposición de 100 ms para la duración del Protocolo de presión. Ajustar la intensidad de excitación tal que el aumento de la fluorescencia máxima no saturar la cámara. Guardar las imágenes como un archivo *.tif con al menos 50 imágenes ante el primer estímulo para la normalización.
- Iniciar el protocolo de imagen en el software de adquisición de la imagen y el protocolo de la presión en el software de la bomba programable. Durante la grabación, observar si la neurona de interés es el punto más brillante en un área de 10 x 10 pixeles, no se mueve más allá de 10 píxeles en imágenes secuenciales, se queda en el campo de visión durante la grabación.
Nota: Si no se hace, el software de análisis no. Puntos brillantes (es decir, autofluorescencia) alrededor de la neurona que las grabaciones de las neuronas difíciles de limpiar. Para corregir esto, sacar el gusano de la trampa y cargar un nuevo gusano en el chip. Si el gusano se mueve demasiado, prueba una nueva grabación del gusano mismo y observar el movimiento del gusano. Si el problema persiste el gusano podría ser demasiado pequeño para ser atrapados. En este caso sacar este gusano y carga un gusano ligeramente más grande en la trampa. - Si lo desea, grabar señales de las neuronas múltiples en el campo de visión al mismo tiempo siempre y cuando las neuronas están separadas por al menos 10 píxeles durante toda la grabación.
- Para investigar la habituación, realizar el experimento repetidamente en un animal.
- Retire el gusano desde el canal de captura.
- Si se desea mantener el gusano para estudios posteriores, desconectar las salidas del chip hacia el flujo de gravedad y el depósito de residuos. Presione suavemente el émbolo de la jeringa hasta que el gusano entero a través del canal de captura en el canal de flujo.
- Continúe presionando el émbolo de la jeringa hasta que el animal aparezca en una gota fuera de la viruta. Desconecte la jeringa como el tubo de PE de la entrada del gusano, usarlo para aspirar los gusanos en la gota y transferirlo a una placa de agar.
- Si no se desea mantener el gusano, sacar el gusano presionando el émbolo de la jeringa hasta que el gusano entero a través del canal de captura en el canal de flujo; el flujo por gravedad y la succión de la bomba peristáltica llevan el animal fuera de la viruta y en el depósito de residuos.
4. Análisis
- Descargar e instalar el más reciente Fiji versión32.
- Descargue e instale la versión más reciente del SDK de java.
Nota: Si es necesario, eliminar o renombrar la carpeta de java dentro de la carpeta de Fiji de Fiji utilizar el compilador de java recién instalada. -
Abra el software de Fiji.
- Compruebe si el software ejecuta el compilador de java recién instalada abriendo ' Plugins | Utilidades | ImageJ | Propiedades.
- Descargar el archivo pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, ver archivo adicional 2).
- Arrastrar y soltar el archivo. Java en la ventana del software para abrirlo como un plugin.
-
Compilar y ejecutar el archivo pokinganalyzer*.java presionando las teclas Ctrl + R en Fiji; una interfaz gráfica de usuario (meter analizador) abre (figura 3).
- Haga clic en la pestaña "Ayuda" y Lea acerca de los requisitos del software y cómo realizar el análisis. Para empezar, seleccione la ficha "Abrir video" especificar la ubicación del archivo de vídeo para el analizador: haga clic en el botón "Abrir un vídeo", desplácese a la ubicación del video y abrirlo.
Nota: El software comienza con esta pestaña abierta. Si no está abierto al iniciar un nuevo análisis haga clic en la pestaña "Abrir video". Si el video está en formato a.tif, el programa abre el vídeo y mostrar la primera imagen en la parte inferior de la interfaz internamente. Si la imagen no es del video que debe ser analizado, haga clic en el botón "Abrir un vídeo" para abrir otro video. - Para continuar, haga clic en la pestaña de "Definir ROIs". En esta pestaña, definir la posición de la TRN. Tenga en cuenta que la primera imagen del vídeo abierto se muestra en la parte inferior de esta ficha haga clic en el botón "Definir TRN" y haga clic en la neurona en la parte superior de la imagen visualizada que debe mostrar la fluorescencia GCaMP.
- Opcional: Si el actuador está visible en la mitad superior de la imagen el programa puede automáticamente rastrear la distancia entre la neurona y el actuador si se desea. Para esto, consulte "Definir el actuador?" -caja, haga clic en el botón "Definir actuador" y haga clic en el actuador en la mitad superior de la imagen.
- Haga clic en la ficha "Análisis" definir la tasa de adquisición de imagen. Escriba un número en el campo o haga clic en el arriba o abajo botones para aumentar o disminuir el número. Si está en la ficha anterior la "definir el actuador?" -casilla, definir el tamaño de celda de la cámara, el aumento y el factor binning, por lo que el programa puede calcular la distancia.
- Haga clic en el botón "Iniciar análisis".
Nota: El programa ahora seguimiento de la neurona por su fluorescencia en la secuencia de imágenes en la mitad superior (dependiente de calcio) y en la mitad inferior (independiente de calcio) de la secuencia de imágenes. Para tener en cuenta para el movimiento de la neurona en el plano de grabación del programa estudiará un área de 10 x 10 píxeles alrededor de la localización de la neurona en la imagen anterior para encontrar la posición de la neurona en la siguiente imagen. Calculará la fluorescencia en ambas mitades de la corrección para la fluorescencia de fondo (Fbg) y dividiendo por la fluorescencia en las primeras 50 imágenes (F0):
Cambios de la fluorescencia en el canal verde, dependiente de la actividad (FCa2 +) causadas por la neurona de movimiento fuera del plano de recodificación son entonces corrección mediante la fluorescencia en el canal rojo, independiente de la actividad (F corr) y la desviación estándar de pre-estímulo del calcio-dependiente (sdCa2 +) y (sdcorr) independiente de la fluorescencia por:
- El programa mostrará su progreso en la barra de estado en la parte inferior de la interfaz; Cuando la barra de estado llega al 100%, haga clic en la pestaña "Resultados". Si la barra de estado se detiene antes de 100%, el programa dará un mensaje de error indicando el motivo que el programa no podría analizar el video.
- Si la relación señal a ruido es demasiado baja, el programa no puede identificar la neurona; ajustar los parámetros de proyección de imagen en grabaciones posteriores.
- Si la neurona sale del campo de visión durante la grabación, el programa no puede seguir más y se detendrá. Para posteriores grabaciones, coloque la neurona en el medio del campo de visión al principio de la grabación.
- Si algunas regiones en el campo de visión están sobresaturados, el análisis automatizado producirá resultados no válidos. Para posteriores grabaciones, asegúrese de que la señal de fluorescencia no sature el sensor de la cámara.
- En la pestaña 'resultados', el resultado se muestra en la parte superior. Guardar un archivo *.txt ficha separada de la tabla haciendo clic en "Guardar la tabla de resultado".
Nota: Esta tabla consiste en el tiempo en segundos y la fluorescencia dependiente de calcio normalizada (corregido por la fluorescencia de calcio-independiente). Si previamente definido, también contiene la distancia total entre la TRN y el actuador en μm y la distancia entre la TRN y el actuador perpendicular a la pared del canal en μm. resultados representativos de la intensidad de la fluorescencia aumentan después de estimulación versus la distancia del cuerpo celular en el actuador más cercano se representan gráficamente en la figura 4. - Si hay múltiples neuronas en una grabación (separada por más de 10 píxeles), haga clic en la pestaña de "Definir ROIs" de nuevo y volver al paso 4.6.2 con la segunda neurona.
- Haga clic en la pestaña "Ayuda" y Lea acerca de los requisitos del software y cómo realizar el análisis. Para empezar, seleccione la ficha "Abrir video" especificar la ubicación del archivo de vídeo para el analizador: haga clic en el botón "Abrir un vídeo", desplácese a la ubicación del video y abrirlo.
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Representative Results
Litografía de SU-8 y la vinculación de la viruta
El protocolo de litografía y moldeado de PDMS siguen los procedimientos estándar. Detalles pueden encontrarse en otros lugares23,24,25,26. El PDMS debe despegarse de la ostia sin problemas después de curar. Si las características de SU-8 rip off durante la peladura de PDMS, la capa de adherencia de SU-8 o la silanización era insuficiente. Si no es suficiente, vinculación débil puede resultar en la salida de la canal de captura o actuadores, dando por resultado la degradación del rendimiento y la ausencia de estimulación plasma-activación de los cubreobjetos de vidrio y las virutas PDMS. Si la fuga de fluido es evidente, el chip es inutilizable.
Rendimiento del actuador
Todos los actuadores PDMS y la tubería de conexión del chip al depósito de aire se deben sellar adecuadamente para asegurar la adecuada actuación neumática de los diafragmas. Repetida de la inserción y extracción de la tubería de PE (plomería) dañará agujeros PDMS y conducir a una disminución en la presión. Una pérdida de presión limitará desviación del actuador y la fuerza aplicada a la piel del animal inmovilizado. Deflexión del diafragma puede medirse usando un chip de vacío (ningún animal actual) realizar varios ciclos de actuación con la presión deseada y comparando los valores cuantitativos con las predicciones teóricas. La desviación del diafragma no se midió en presencia de un animal en el canal de captura, porque el límite de la membrana y del gusano son difíciles de visualizar. Esto permite calibración de precisión con un animal capturado no. La tabla 1 enumera el desvío esperado en función de la presión. Estos valores se calcularon usando la placa elástico teoría y detalles pueden encontrarse en Nekimken et al. 23 se espera que esta relación varía con diferencias en el espesor del diafragma generada durante el casting de la viruta y otros factores tales como la integridad de la unión entre el chip y el vidrio y sellos conectar el chip a las fuentes de presión. Aquí, los valores fueron reproducibles con ligera variación no superior a 1 μm en 450 kPa de presión. Han caracterizado el funcionamiento de los diafragmas para los tres perfiles de diferentes estímulos y refieren al lector interesado a Nekimken et al. 23 Resumen, allí son varios factores a tener en cuenta si los valores difieren del cuadro 1: 1) una fuga en la tubería o tubos conectores, 2) el PDMS tiene una elasticidad diferente, que puede resultar de una relación alternativa de base polímero y el agente endurecedor, o 3) el PDMS ha envejecido y continuó la reticulación con el tiempo. Por lo tanto, se recomienda el uso de chips que se han preparado dentro de un mes de su aplicación.
Rendimiento de captura
Después de insertar los gusanos en la entrada de la viruta, una ligera presión con la jeringa debe colocar un solo animal dentro del canal de captura y presentar su piel junto con los seis actuadores (figura 1). Lo importante es la nariz del animal no necesariamente sobresale en el tanque del almacenador intermediario. En cambio, es más importante para el animal que la neurita es adyacente al actuador más cercano y su cuerpo de la célula dentro del campo de visión del microscopio. Para lograr una óptima activación neuronal, se debe ajustar la distancia entre el actuador y el cuerpo de la célula tales que el actuador se encuentra anterior al cuerpo de la célula de interés. En nuestra experiencia, para las neuronas estimuladas que posterior al cuerpo de la célula, ninguna activación tendrá lugar y calcio transitorios estará ausentes. Inmovilización adecuada se logra con pequeños hermafroditas adultos o un día de edad (dispositivos optimizados para estas dos edades están disponibles en la misma máscara). Animales más pequeños se deslizan en el depósito de recolección o moverse lateralmente dentro del canal de captura. Animales que son demasiado grandes se exprimió en el canal, que podría dar lugar a una activación prematura de su TRNs y posterior fracaso para detectar a oscilaciones mechanoreceptor. También, eliminación de gusanos grandes es difícil, lleva a la muerte del animal u obstrucción del dispositivo. Con este diseño, la neurona PLM generalmente no se inmoviliza totalmente, por lo que es libre de moverse lateralmente y verticalmente. Aunque hemos activado exitosamente neuronas PLM, registro de oscilaciones de calcio en estas neuronas es difícil debido al movimiento vertical de la cola. Otro diseño de captura se ha utilizado para grabar en PLM33.
Proyección de imagen del calcio transitorios y análisis
Una vez en el lugar, los animales pueden ser estimulados usando uno de los seis actuadores. Los seis actuadores están posicionados para ofrecer estímulos mecánicos a cada uno de los seis TRNs. Un controlador de flujo de microfluidos conectado a una fuente de 450 kPa presión interna fue utilizado para proporcionar al animal un protocolo de estímulo que consiste en un paso de 275 kPa 2-s, una rampa de 2-s 0 – 275 kPa y un zumbido 2-s (un 75 kPa, 10 Hz senoidal superpuesta con un paso de 275 kPa) , cada uno separado por un período de espera de 10-s. Se analizaron las secuencias de imagen grabada al mismo tiempo de las oscilaciones de calcio en Fiji, usando un software de medida disponible en nuestra cuenta de GitHub (véase más arriba y https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Encontramos que la presión rampas y pasos de presión activación TRNs sólo si los estímulos logra presiones por encima de 400 kPa. Por el contrario, una robusta activación de TRNs todos estimulados usando un zumbido sinusoidal, 10 Hz a presiones < 275 kPa se observó (figura 4). En general, TRNs respondieron mejor a un breve estímulo sinusoidal (llamado 'buzz'), de acuerdo con informes anteriores, utilizando diferentes metodologías1,9. La estimulación con un zumbido es altamente eficiente, llevando a ~ 90% de la activación en todas las neuronas y los ensayos de prueba (figura 4). Sorprendentemente, no había fuerte correlación observada si el estímulo fue aplicado a la dorsal o el lado ventral, y era independiente de la distancia entre el cuerpo de la célula y la posición del estímulo en la neurita. Los estudios futuros tendrán que investigar si la demora de la respuesta máxima se correlaciona con la distancia del estímulo.
Figura 1: Resumen del diseño de viruta. (A) diseño esquemático de la fotomáscara y la viruta resultante con todos los conectores indicados. Hay seis dedos de actuación, tres a cada lado del canal central reventado. Barra de escala = 3 mm. (B) fotografía del dispositivo microfluídico con PDMS adheridos al cubreobjetos y conectado a la tubería en la entrada del gusano y el gusano de comunicación. Sólo uno de los dedos de actuación está conectado a la fuente de presión, mientras que los otros cinco no se ocupan. Partes de la figura han sido reproducidas de referencia23 bajo licencia de comun creativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: primer plano del canal central reventado y el procedimiento de captura. (A) dibujo esquemático del canal de captura. Los pilares en el lado de entrada del gusano ayudan a orientar el gusano y facilitar la carga de los animales. Los dedos de actuación pueden ser presurizados y aplicar sangría a un diafragma fino en la muestra atrapada. Barra de escala = 200 μm. (B) video cuadro representativo de un gusano que están atrapado en el canal horizontal. El canal es diseñado tal que el gusano viene para poner a través de los seis actuadores. La cola está a la izquierda, la cabeza está a la derecha. Ubicación de las neuronas receptoras de un toque personal (TRNs) son indicados por las flechas y marcados en la figura. Barra de escala = 100 μm (en todos los paneles). Partes de la figura han sido reproducidas de referencia23 bajo licencia de comun creativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resumen del plugin de Fiji siempre analizar rastros de calcio adquiridos con este protocolo de. El software inicia una interfaz gráfica de usuario. La primera pestaña ("abrir video") de la interfaz de usuario muestra el botón para abrir un video, muestra el camino y el primer fotograma del video abierto. La segunda pestaña ("ROIs definir") incluye el botón para definir una neurona receptor de tacto, una casilla de verificación para activar el botón "Definir actuador" y el botón "Definir actuador". En la parte inferior, se muestra el primer fotograma del vídeo. En la parte superior de la tercera pestaña ("análisis"), se muestran los parámetros ajustables para el análisis de la imagen. La parte central muestra el botón de "Iniciar análisis". En la parte inferior, una barra de progreso muestra el progreso del análisis actual. En la cuarta pestaña, "Resultados", el resultado se muestra como un gráfico de la intensidad de fluorescencia relativa en el tiempo. En la parte inferior, hay un botón para guardar la tabla. En la quinta pestaña, "Ayuda", un texto de ayuda aparece mostrando los requisitos para el software de análisis y la instrucción sobre cómo usarlo. Figura adaptada de referencia23 bajo licencia de comun creativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: neuronas individuales responden a estímulos mecánicos. (A) micrografía de fluorescencia representante de GCamP6s etiquetado como neurona de AVM táctil receptor antes y después de estimulación mecánica con un zumbido. Barra de escala = 10 μm. escala de Color = 1.500-3.500 valores de gris. (B) protocolo de estímulo incluyendo 2 excitación de diafragma de s que representa un paso de 275 kPa, una rampa de 275 kPa y un seno (75 kPa; 10 Hz) superpuestos con un paso de 275 kPa (buzz). (C) normalizado GCamP6s rastro de intensidad (media ± SEM como área sombreada) grabado de AVM estimulado con el perfil que se muestra en B de animales de tipo silvestre (verde, n = 14) y animales mutantes en el canal mechanoreceptor subunidad 4 mec (azul, n = 10), es decir conocido para facilitar las respuestas al estrés mecánico. Esto indica que los transitorios son inducidos por los estímulos mecánicos aplicados. Partes de la figura han sido reproducidas de referencia23 bajo licencia de comun creativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Presión (kPa) | Significa desviación (μm) | SD | Desviación esperada (μm) |
| 0 | -0.01 | 0.01 | 0 |
| 50 | 0.77 | 0.26 | 0.607143 |
| 100 | 1.57 | 0.58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0.65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0.74 | 2.42857 |
| 250 | 3,86 | 0,79 | 3.03571 |
| 300 | 4.61 | 0,79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0,82 | 4.25 |
| 400 | 5.92 | 0,82 | 4.85714 |
| 450 | 6.43 | 0.75 | 5.46429 |
Tabla 1: valores de desviación experimental de presiones aplicadas desde 0 – 450 previstos kPa y sus predicciones teóricas. Datos derivados de un estímulo de paso. Media ± SD. Estos datos fueron adquiridos con un canal de captura vacía.
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Discussion
Este protocolo muestra un método para entregar precisa estimulación mecánica sobre la piel de un ascáride atrapado en un chip de microfluidos. Se pretende facilitar la integración de los estímulos físicos para responder a cuestiones biológicas y pretende agilizar investigación mecanobiología en laboratorios biológicos. Este método amplía análisis anteriores para evaluar la función de mechanosensory neuronas en C. elegans. Técnicas cuantitativas y semi cuantitativas anteriores miden fuerzas1,34 y del comportamiento35, pero eran difíciles de integrar con la proyección de imagen de alta resolución de la actividad neuronal. Así creemos que el uso de este chip extiende las aplicaciones actuales y su rendimiento está optimizado para la estimulación de las neuronas requerida de tacto suave. Hemos optimizado la desviación del actuador al alcanzar 5 μm, que es un estímulo lo suficientemente fuerte como para llegar a respuestas neuronales casi máximas. Con ligeras variaciones, creemos que este diseño podría utilizarse para estimular receptores de tacto áspero, como nociceptors PVD que inervan la superficie cuerpo36.
Modificaciones y la resolución de problemas
Si no hay habitación disponible para litografía SU-8, pueden utilizarse una caja limpia de sobremesa o estaciones de litografía suave de SU-8 equipadas con lámparas de UV, placas programables y recubridores de vuelta. Una alternativa de bajo costo para la producción de microfluídica también pueden ser dispositivos que evita el uso de las instalaciones de sala limpia seguido26.
En el diseño, hemos implementado una técnica de captura existentes, que inmoviliza un solo animal en un canal microfluídico. El diseño de la trampa es adaptado de un dispositivo que se utiliza para estudiar la sensación olfativa en el gusano36, pero no es la única opción viable para suprimir el movimiento del gusano. Otras estrategias se han divulgado para mantener gusanos en dispositivos microfluídicos: CO2, electroforético, inmovilización compresiva11,37,38 han sido utilizados y podrían integrarse en la diseño.
Hicimos entrega de presión a los canales de actuación utilizando una bomba de presión piezoeléctrico comercialmente disponible que pueden controlar y entregar hasta 800 kPa de una fuente de presión externa. Conectamos la bomba de aire comprimido en la investigación del edificio, que es capaz de entregar ~ 450 kPa. Si no hay ninguna fuente de aire comprimido está disponible, podría utilizarse un tanque de gas inerte comprimido, (por ejemplo, N2). Esto tendría el beneficio añadido de proporcionar presiones más altas y la generación de grandes deformaciones, pero también requiere alta presión accesorios para la conexión al controlador de presión al chip. Fabricación de la viruta de PDMS más suave es alternativa para aumentar las deformaciones inducidas por la presión.
En este experimento, la salida de la bomba de presión está conectada al chip PDMS aberturas mm 1 receptor (p. ej., perfore orificios) conectado con interconexiones libre de adhesivo y reversibles que consiste en un press-fit 20 G metal tubo insertado en una PE de la tubería. Estos han demostrado resistir presiones de hasta 700 kPa39. Debe tenerse cuidado durante la inserción repetida, sin embargo, como el PDMS alrededor de los orificios tiende a romper y así limitar el rendimiento o inutilizar el chip. Por esta razón, el tubo de metal fue insertado una vez y dejó enchufado en el chip, sin quitar e insertar repetidamente.
Pasos críticos
Estimulación es entregada por un canal de accionamiento a presión, que aplica sangría a la piel. La deformación resultante y la activación de la neurona mechanoreceptor pueden ser reflejadas con alta resolución en un microscopio óptico de fluorescencia y confocal configuración. Varios factores pueden dificultar la detección de las respuestas de GCaMP. En primer lugar, C. elegans expresan un receptor de luz azul30 en muchas neuronas, incluyendo TRNs21,23, que activa las células después de la iluminación con azul (488 nm) luz. Así, C. elegans la proyección de imagen usando el sensor de calcio genéticamente codificados GCaMP6s activará sus neuronas sobre iluminación, oscurecimiento de las oscilaciones de calcio activadas por estímulo mecánico23. Trabajando en el fondo mutante lite 1 o utilizando sensores de actividad rojo-cambiado de puesto calcio evita este confound. Segundo, mecánicamente inducida por calcio transitorio podría no detectarse si el perfil de estímulo no coincide con la sensibilidad de los mecanorreceptores. No pudo detectar la activación de gran amplitud escalones y rampas, pero había evocado extremadamente altas señales tras la estimulación con estímulos dinámica moderada (e.g., buzz - kPa 200). Finalmente, TRNs habituar a un estímulo repetido entregado con corta (< 60 s) intervalos interstimulus. Por lo tanto, es importante para secuencias de estimulación de diseño que minimizan la habituación excepto en casos donde se estudia la habituación.
Recomendamos filtrar todas las soluciones, como escombros y polvo en los buffers pueden obstruir fácilmente el canal pequeño reventado. Además, animales deben ser sincronizada de edad y tamaño comparable al diseño de la viruta; animales más pequeños que los adultos jóvenes se deslice a través del dispositivo o no restringida y animales más grandes no pueden entrar en los canales de captura y están en peligro de explosión o estorbar el chip. En caso de obstrucción, aplicación de presión excesiva a la entrada de flujo de gusano o gravedad puede limpiar los canales, pero también podría conducir al fracaso de la conexión.
Como se mencionó en la sección de resultados, varios factores pueden llevar a un fallo en el programa de análisis. Si se encuentran problemas en la compilación del código, se recomienda verificar que se está ejecutando el software más reciente de Fiji y Fiji está utilizando el compilador de Java más reciente. Si el programa corre pero hay inesperados resultados Asegúrese de que la película grabada tiene un almacenador intermediario de marco de 50 antes de realiza la estimulación mecánica real para asegurar una adecuada estimación de la fluorescencia de la línea de fondo y fondo. Además, el campo de visión de la verde, dependiente de la actividad (GCaMP6s) y el rojo, canal independiente de la actividad (tagRFP) se supone que se proyecta sobre la mitad superior e inferior de la viruta de la cámara, respectivamente. Si el divisor de haz óptico proyecta las imágenes sobre la mitad derecha e izquierda del sensor, girar la cámara 90 º para obtener la orientación deseada durante la grabación o rotar las pilas de la imagen en un paso de preprocesamiento. Además, el programa identifica la neurona por su fluorescencia y se producirá un error si la relación señal a ruido o el contraste es demasiado bajo. En este caso, la modificación del tiempo de intensidad y exposición de excitación puede resolver el problema. El programa también se detendrá si la neurona sale del campo de visión durante la grabación, en que caso la neurona debe colocarse en el centro del campo de visión antes de comenzar una nueva adquisición.
Limitaciones de la técnica
El diseño actual permite la estimulación de las neuronas de mechanoreceptor de la pared del cuerpo como los nociceptors PVD y el TRNs, pero no los mecanorreceptores que inervan la región principal del gusano, como FLP y cenizas. Está limitado a presiones < 700 kPa. Para presiones mayores, las guarniciones de tubo diferentes deban emplearse. Puesto que la fuente de presión aquí no excedía a 500 kPa, la presión máxima posible aplicar fue limitada a 450 kPa. El calcio transitorios observados aquí marca el límite superior de la señal esperada. Otra limitación para el diseño de nuestros actuadores es su relación de aspecto. En principio, diafragmas más finos permita grandes deformaciones, pero las estructuras con alta relación de aspecto están difíciles de fabricar de forma fiable. Si las deformaciones más grandes son esenciales, actuadores más amplios o deformaciones paralelas de ambos lados pueden ser útiles, presentado por Cho et al. 29
Aunque podemos controlar deformaciones del diafragma, es difícil medir las fuerzas aplicadas durante la estimulación de los canales de actuación neumática. La limitación de principio es que el área de contacto del actuador no está bien definido. Esto es porque el actuador sí es elástica y deformación durante la actuación, que cambia el contacto radio con el aumento de desviación. Con estas advertencias en mente, podemos estimar que una muesca de μm 5 (alrededor de 300 kPa actuación presión en un chip de vacío) se prevé aplicar unos 3,8 µN el gusano según los cálculos de rigidez gusano de Petzold et al. 34 desde la dependencia de la fuerza de la corriente neuronal varía en gusanos con diferentes rigideces1,34, sin embargo, control sangría se recomienda una medida de la intensidad del estímulo en lugar de fuerza.
Esperamos que la difusión de este protocolo ayudará a los usuarios tomar ventaja de la microfluídica para la investigación de la mecanobiología con C. elegans como sistema modelo y así acelerar el avance de la ciencia sobre este importante tema en el campo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty y Verónica Sánchez por apoyan en la generación de animales mutantes y diseño del dispositivo. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH R01EB006745 (Para BLP), R01NS092099 (a MBG), K99NS089942 (de MK), F31NS100318 (a ALN) y recibió financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) bajo investigación horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación programa () otorgar el acuerdo no. 715243 a MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
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