Summary
Nya verktyg för Mekanobiologi forskning behövs för att förstå hur mekanisk stress aktiverar biokemiska vägar och framkallar biologiska svar. Här, vi visa upp en ny metod för selektiv mekanisk stimulering av immobiliserade djur med en mikroflödessystem fälla möjliggör högupplöst avbildning av cellulära svar.
Abstract
Ett centralt mål för Mekanobiologi är att förstå det reciprocal verkställer av mekanisk stress på proteiner och celler. Trots dess betydelse, är påverkan av mekanisk stress på cellulär funktion fortfarande dåligt förstått. Delvis, finns denna kunskap klyfta eftersom några verktyg möjliggör samtidiga deformation av vävnader och celler, avbildning av cellulär aktivitet i levande djur, och effektiv begränsning av motilitet i annars mycket mobila modellorganismer, såsom Nematoden Caenorhabditis elegans. Den lilla storleken på C. elegans gör dem till en utmärkt matchning till mikrofluidik-baserad forskning enheter och lösningar för immobilisering har presenterats med mikroflödessystem enheter. Även om dessa enheter tillåter för högupplöst avbildning, är djuret helt inkapslad i Polydimetylsiloxan (PDMS) och glas, att begränsa fysisk åtkomst för leverans av mekanisk kraft eller elektrofysiologiska inspelningar. Nyligen har skapat vi en enhet som integrerar pneumatiska manöverdon med svällning design som är kompatibel med högupplöst fluorescensmikroskopi. Kanalen aktivering avskiljs från kanalen mask-svällning av en tunn PDMS-membran. Detta membran är avlänkas in i sidan på en mask genom att tillämpa tryck från en extern källa. Enheten kan rikta enskilda mechanosensitive nervceller. Aktiveringen av dessa nervceller är avbildade på högupplösta med genetiskt-kodade kalcium indikatorer. Denna artikel presenterar den allmänna metoden med C. elegans stammar uttrycker kalcium känsliga aktivitetsindikator (GCaMP6s) i sin touch receptor nervceller (TRNs). Metoden är inte begränsad till TRNs eller till kalcium-sensorer som en sond, men kan utökas till andra mekaniskt känsliga celler eller sensorer.
Introduction
Känsel ger djur med avgörande information om deras miljö. Beroende på den tillämpliga kraften uppfattas touch som ofarlig, lustfyllt eller smärtsamma. Vävnaden deformationen under touch detekteras av specialiserade Mekanoreceptorfysiologi celler inbäddade i huden som uttrycker receptor proteiner, oftast jonkanaler. De steg som förbinder kraft uppfattning att ion kanal aktivering under beröring och smärta är inte helt klarlagda. Ännu mindre är känt om hur huden vävnad filtrerar mekanisk deformation och huruvida mekanoreceptorer upptäcka förändringar i stammen eller stress1,2,3. Denna lucka i förståelse uppstår, delvis på grund av lämpliga verktyg att tillämpa exakt mekaniska stimuli till ytan av huden på ett levande djur medan du observerar svaren på cellnivå. Medan atomic force microscopy har använts i stor utsträckning att tillämpa och mäta krafter i isolerade celler4,5 och även aktivera Piezo1 receptorer i levande celler6, liknande experiment med levande djur, särskilt C. elegans, har varit ökänt utmanande på grund av den inneboende rörligheten i ämnet. Denna utmaning är traditionellt kringgås genom att använda veterinär - eller kirurgisk-grade cyanoakrylat lim för att immobilisera enskilda djur på agar kuddar1,7,8,9. Detta tillvägagångssätt har varit produktiv, men har begränsningar relaterade till den skicklighet som krävs för immobilisering av limning och mjuk agar ytan på mekaniska efterlevnad. En mikrofluidik strategi är ett avgiftsfritt alternativ som undviker några av de komplikationer kopplade till limning.
Nematoden C. elegans är en genetisk modellorganism med ett helt mappade nervsystem som, på grund av djurets storlek, är en bra passform för mikrofluidik teknik. Mikrofluidik-baserade enheter erbjuder fördelen att annars extremt mobila djuren kan vara fastspända när de utför högupplöst avbildning och leverans av relevanta neuro-immunmodulerande stimuli. Med hjälp av mikrofabricerade kan teknik, levande djur vara orörlig utan skada10,11, aktivera övervakning av beteendemässiga aktivitet över hela livslängd12,13 och högupplösta Imaging neuronal aktivitet14,15,16,17. Vidare, många Mekanoreceptorfysiologi nervceller behövs för känslan av beröring och smärta kan karakteriseras på deras fysiologiska1,8, mekanisk4,18,19, och molekylär nivå20,21,22.
C. elegans sinnen skonsam mekaniska stimuli dess kroppen väggen med sex TRNs, av vilka tre innerverar djurets främre (ALML/R och AVM) och tre som innerverar djurets bakre (PLML/R och PVM). De ion kanal molekyler behövs för att transducing en tillämpad kraft till en biokemisk signal har studerats i dess TRNs8. Denna artikel presenterar en mikroflödessystem plattform23 som gör det möjligt för forskare att tillämpa exakt mekaniska krafter till huden på ett immobiliserade C. elegans spolmask, medan du läser ut deformeringen av dess inre vävnader av optisk imaging. Förutom att presentera väldefinierade mekanisk stimuli, kan kalcium transienter registreras i Mekanoreceptorfysiologi nervceller med subcellulär upplösning och korrelerade med morfologiska och anatomiska funktioner. Enheten består av en central svällning kanal som innehar ett enda djur och presenterar sin hud bredvid sex pneumatiskt styrda kanaler (figur 1 och figur 2). De sex kanalerna är placerade längs kanalen svällning att leverera mekaniska stimuli till varje maskens sex TRNs. Dessa kanaler är separerade från svällning kammaren med tunn PDMS membraner, som kan drivas av en extern luft trycket källa (figur 1). Vi kalibrerade omläggning med avseende på trycket och ger mätningarna i denna artikel. Varje ställdon kan behandlas individuellt och används för att stimulera en Mekanoreceptorfysiologi val. Trycket levereras med hjälp av en piezo-driven tryckpump men några alternativa enheten kan användas. Vi visar att trycket protokollet kan användas för att aktivera TRNs i vivo och demonstrera operativa enheter lämpar sig för att leverera mekaniska stimuli till vuxen C. elegans, fylla på vuxna djur i enheter, utför kalcium imaging experiment och analysera resultaten. Enheten fabrication består av två huvudsakliga steg: 1) photolithography göra en mögel från SU-8; och 2) molding PDMS för att göra en enhet. För enkelhetens och tydlighetens skull hänvisas läsare till tidigare publicerade artiklar och protokoll24,25 för instruktioner om hur att producera formar och enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. anordning tillverkning
- Hämta maskfilen bifogad (kompletterande fil 1) och skapa en chrome mask med hjälp av en kommersiell tjänst eller egen anläggning. Som den minsta dimensionen på enheten är 10 µm (ställdon membran tjocklek), se till att masken har tillräckligt hög upplösning, inom ± 0,25 µm, tillförlitligt producera funktioner.
-
Följ SU-8 photolithography standardmetoder (t.ex., referenser24,25,26) att fabricera formen för efterföljande produktion av PDMS enheter; en sammanfattning av stegen nedan.
Obs: SU-8 är ett ljuskänsligt material, som antipyridinantikropp vid exponering för ultraviolett ljus (maximal absorption ~ 365 nm). Använd instruktionerna tillverkaren som utgångspunkt att avgöra processparametrar för den mjuka-bakar, exponering (UV), och efter baka.- Sätta in SU-8 2002 på en silicon wafer och spin-coat det till en ungefärlig tjocklek av 2 µm, för bättre vidhäftning av små strukturer. Soft-baka på en värmeplatta för 1 min vid 95 ° C, något över exponera (UV) hela ytan (~ 100 mJ/cm2), och efter baka på en värmeplatta för 2 min vid 95 ° C.
- Spinn-rocken ett 47-µm tjockt lager SU-8 2050 för att definiera enhetsfunktionerna. Använda en centrifugeringshastighet på 500 rpm för 15 s (130 rpm/s acceleration) och sedan 2.000 rpm för 90 s (260 rpm/s acceleration). Om nödvändigt, upprepa och justera den snurrande fart för att få rätt tjocklek fotoresist.
- Soft-baka på en värmeplatta för 2 min vid 65 ° C, och sedan för 7 min på 95 ° C. Exponera fotoresist enligt tillverkarens instruktioner (~ 160 mJ/cm2) med en chrome mask och lång-pass filter för att säkerställa Raka sidoväggar.
- Ta bort rånet och efter baka på en värmeplatta för 1 min vid 65 ° C och 7 min på 95 ° C.
- Upplösa oexponerad SU-8 med utvecklare och rengör med 2-propanol.
- Grädda rånet på en värmeplatta vid 180 ° C i 30 min (hård-baka) att stabilisera fotoresist funktioner.
-
Göra en PDMS replik från SU-8 modellen använder standard replika gjutning metoder27.
- Behandla SU-8 formen med trichloromethylsilane (TCMS) ånga att minska PDMS vidhäftning (silanisering).
Varning: TCMS är giftiga och vattenreaktiva.- Placera den mönstrade wafer i en wafer rack inom glaskupa vakuum exsickator i dragskåp utan vatten eller vattenlösliga reagenser.
- Under huven, Använd en pipett för att tillämpa 1 droppe av TCMS en glasskål och placera inuti exsickatorn.
- Stäng locket exsickator och tillåta TCMS vapor att bestryka rånet i minst 20 min.
- Vent och öppna sedan exsickatorn. Öppna glaskupa locket och ta bort rånet med hjälp av plast pincett. Placera i en petriskål eller aluminium folie båt för PDMS replika gjutning. Kassera TCMS-belagda material i rätt farligt avfall.
- Blanda PDMS (förhållandet 10:1) med 40 g av den bas polymer och 4 g PDMS-härdare.
- Häll blandningen över SU-8 mögel och lufta blandningen för minst 30 min i en vakuumkammare.
- Botemedel mot minst 6 h vid 70 ° C i ugn.
- Behandla SU-8 formen med trichloromethylsilane (TCMS) ånga att minska PDMS vidhäftning (silanisering).
- Lyft PDMS rånet genom att rånet horisontellt på en plan yta och noggrant skalar PDMS av. Böj inte rånet uppåt under detta steg, eftersom det kan bryta mögel.
Obs: Ofullständig vidhäftning av SU-8 till wafer eller ofullständig silanisering kan leda till förstörelse av strukturerna som SU-8 under detta steg. - Skär PDMS runt enheterna i enskilda marker så att enheterna får plats på ett 24 x 60 mm täckglas.
- Använda en 1 mm biopsi punch, gör hål i inloppet, två uttag och sex ställdon med en 1 mm biopsi punch. Sikta på 2 mm diameter cirklar runt kanterna på enheten.
-
Bond PDMS marker till glas täckglas.
- Exponera båda ytorna till 80 W syre plasma (30 s).
- Placera försiktigt den exponerade PDMS ytan på den exponerade ytan av cover slip för en conformal tätning.
- Glödga enheten på en värmeplatta (100 ° C, 10 min).
Obs: Otillräcklig bindning kan leda till fel på enheten på grund av läckage.
2. beredning av mikroskopet
Obs: Transgena djur: express en kalcium indikator såsom GCaMP6s28 eller andra genetiskt kodade aktivitet sond i neuron(s) av intresse (t.ex., TRN); tillsammans uttryck en aktivitet-oberoende fluorescerande proteiner avger olika våglängden att korrigera för små laterala och out-of-fokus rörelse artefakter som uppstår på grund av mekanisk stimulering. Automatiserad analysprogrammet spårar och kompenserar för rörelse-inducerade förändringar i intensitet av aktivitet sonden. Den masken stammar GN69223 (eller AQ323629) uttrycka GCaMP6s (eller GCaMP6m) och den kalcium-oberoende tagRFP under kontroll av mec-7 promotor. GN692 innehåller dessutom den mutation lite-1(ce314), vilket förhindrar aktivering av TRNs på grund av de blå ljussensor lite-130 under magnetisering av GCaMP6s fluorescens23.
-
Ställa in ett Mikroskop system för samtidiga excitation av GCaMP och RFP.
- Använd antingen en kontinuerlig ljuskälla och en dual band excitationsfilter som överför endast cyan och gult ljus, eller Använd en ljuskälla som avger endast våglängder i en definierad bandbredd såsom samtidig cyan (0,77 mW) och gul (1.21 mW) LED excitation källor för samtidiga excitation av kalcium-beroende och oberoende fluorescensen, respektive.
- Använda en digitalkamera för att aktivera inspelning av mikroskopi bilder.
Obs: De flesta kameror kommer med en programvara för bild förvärv. Alternativt finns det fritt tillgänglig programvara som kan användas för att styra kameran och eventuellt också andra delar av systemet för mikroskopi. - Justera excitation intensitet baserat på fluorescensintensiteten att undvika kamera mättnad.
-
Använd en fluorescens-kub som beroende av valet av exciteringskälla behöver utrustas med en excitationsfilter.
Obs: En 488-nm GFP och 580 nm mCherry excitationsfilter användes här.- Lägga till en stråldelare kuben för att reflektera cyan och gult ljus och sända grönt och rött ljus.
- Utrusta mikroskopet med en 10 X mål och en hög förstoring mål (t.ex., 63 X / 1,32 NA olja) att fokusera magnetiseringen ljus på provet.
- Montera en stråldelare framför kameran för samtidig inspelning av GCaMP och kalcium-oberoende signalen. Se till att balken splitter har en dichroic spegel (långa pass, cut-off på 570 nm) att separera grönt och rött ljus med hjälp av ett utsläpp filter för grön (passband centrerad på 525 nm med 50 nm bredd) och ett utsläpp filter för rött ljus (passband centrerad på 632 nm med 60 nm bredd).
- Projektet grön och röd fluorescens på den övre halvan (grön) och nedre halvan (röd), respektive av kameran chip (se figur 3). Denna inriktning är en förutsättning för det medföljande analysprogrammet.
3. djur förberedelse
- Förbereda ålder-synkroniserad unga vuxna eller vuxen dag ett C. elegans, som tidigare beskrivits av Porta-de-la-Riva o.a. 31
- Förbereda mikroflödessystem chip.
- Anslut gravitation flöde reservoaren (~ 60 cm ovanför chip nivå) som innehåller filtrerade (0,2 µm polyetersulfon spruta filter) M9 buffert till ett utlopp av chip. Anslut det andra utloppet till ett utlopp av en två-outlet avfallsbehållare, dvs, en filterkolv. Anslut andra uttaget av avfallsbehållaren till en Peristaltisk pump.
Obs: Använd polyeten (PE) slangar för alla anslutningar och metall rörkopplingar ansluta PE slangen till chipet. Detta sätt alla avfall lösningar blir spolas ur chipet och samlas i avfallsbehållaren. Flödet genom utlopp kanaler skapar en skonsam sugkraft som kommer att hålla masken tätt under senare svällning. - Förbereda interconnects bestående av 50-mm lång PE rör (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) med metall slang (gauge storlek 23TW, 0.635-mm OD) på båda ändarna. Press-fit sammanbinder dessa i varje av de sex aktivering fingrarna och till mask inlet (se figur 1). Lämna dessa sammanlänkningar i chipet, som upprepade borttagning leder till slitage på PDMS hålen.
- Anslut gravitation flöde reservoaren (~ 60 cm ovanför chip nivå) som innehåller filtrerade (0,2 µm polyetersulfon spruta filter) M9 buffert till ett utlopp av chip. Anslut det andra utloppet till ett utlopp av en två-outlet avfallsbehållare, dvs, en filterkolv. Anslut andra uttaget av avfallsbehållaren till en Peristaltisk pump.
- Placera chipet på mikroskopet. Plocka 2 – 5 maskar i en droppe filtreras (0,2 µm spruta) M9 filterbufferten och Använd en 1 mL spruta för att upprätta dem till en PE slangar (0.9652-mm OD, 0.5842-mm ID) ansluten till en 1 mL spruta genom att försiktigt dra kolven. Hålla djuren i PE röret och inte i sprutan.
Observera: För många maskar eller ofiltrerat lösningar i chip kan leda till igensättning. - Anslut PE slangen i sprutan till sammankopplingen vid inloppet mask (figur 1 och figur 2) av chip. Aktivera den gravitation flöden genom att öppna ventilen och börja den peristaltiska pumpen. Tryck försiktigt på sprutkolven i sprutan att flytta djuren i svällning kanalen medan du observerar kanalen under ett Mikroskop med en 10 X linsen i brightfield läge.
Obs: Ibland-framträdande luftbubblor inte utgör ett problem; vanligtvis automatiskt flyttas de till vägguttaget. Flera djur kan 'parkerade' i väntan kammaren och användas sekventiellt.- Efter lastning djuret in i svällning kanal (se även figur 2), justera dess position genom att försiktigt trycka eller dra kolven i sprutan för att placera huvudet av djuret i den koniska formen på framsidan av kanalen.
- Se till att masken (vuxen dag 1) har rätt storlek för att vara instängd i chipet.
- Om masken inte fyller hela tvärsnittet av kanalen från näsan till nära slutet av kroppen (inte inklusive spetsen av svansen) eller masken rör sig längs axeln av kanalen utan att flytta kolven i sprutan , ta bort masken genom att trycka på kolven i sprutan tills den försvinner från kanalen svällning och ladda en ny (se steg 3.8).
- Växla till fluorescens av mikroskopet och en högre förstoring lins (40 X eller högre) och kolla om neurite av neuron av intresse kommer att ligga över membranen av en av manöverdonen. Om inte, justera positionen för djuret genom att dra eller trycka kolven. Om det inte hjälper, ta bort masken och laddar en ny.
- Fokusera på cellkroppen av neuron sevärdheter och ansluta sammankopplingen av manöverdonet närmast neuron på främre sidan av cellkroppen till en programmerbar tryckpump som använder PE slangar.
- Om experimentet kräver mäta avståndet mellan ställdonet och neuron, flytta synfältet så båda är i synfältet och channelwall är parallell med övre och nedre kanten av bilden.
- Definiera en tryck-protokollet använder den programmerbara tryckpump.
Obs: Detta protokoll kan justeras till önskad experimentet.- Börja med ett konstant tryck 0 kPa för en tid som motsvarar minst 50 bilder av bildsekvens (nödvändigt för normalisering). För en tänkbar frekvens på 10 Hz detta motsvarar 5 s. Lägg till en önskad stimulans vågform och trycket och definiera längden på stimulansen som ett andra steg.
Obs: För att stimulera TRNs, en sinusvågform (dvs.75 kPa, 10 Hz) ovanpå med ett steg (dvs., 275 kPa) rekommenderas eftersom det genererar ett stort neuronala svar. - Om experimentet kräver ytterligare stimuli, omfatta en period av minst 10 s vid ett konstant tryck 0 kPa mellan stimuli. Innan du byter tryck pumpen, kontrollera att instrumentet trycket är konstant 0 kPa att undvika oavsiktlig stimulering av masken innan själva experimentet.
- Börja med ett konstant tryck 0 kPa för en tid som motsvarar minst 50 bilder av bildsekvens (nödvändigt för normalisering). För en tänkbar frekvens på 10 Hz detta motsvarar 5 s. Lägg till en önskad stimulans vågform och trycket och definiera längden på stimulansen som ett andra steg.
- Kör protokollet imaging och tryck.
- I förvärvet bildbehandlingsprogram på kameran, ställa in en bildsekvens vid 10 Hz med en exponeringstid på 100 ms för varaktigheten av protokollet trycket. Justera excitation intensiteten så att maximal fluorescens ökningen inte mätta kameran. Spara bilderna som en *.tif fil med minst 50 bilder innan den första stimulansen för normalisering.
- Starta imaging protokollet i förvärvet bildbehandlingsprogram och trycket protokollet i programvara programmerbara pumpen. Under inspelning, observera om neuron av intresse är den ljusaste platsen i ett område på 10 x 10 pixlar, rör sig inte längre än 10 pixlar i sekventiella bilder och stannar i synfältet under inspelningen.
Obs: Om detta inte görs, analys programvaran misslyckas. Ljusa fläckar (dvs autofluorescens) runt neuron göra ren inspelningar av nervcellerna som är svårt. Att korrigera detta, ta bort masken från fällan och ladda en ny mask i chipet. Om masken rör sig för mycket, prova en ny inspelning av samma mask och observera förslaget mask. Om problemet kvarstår kan masken vara för liten för att vara instängd. I detta fall ta bort denna mask och ladda en något större mask i fällan. - Om du vill spela in signaler från flera nervceller i synfältet samtidigt så länge nervceller är åtskilda med minst 10 pixlar under hela inspelningen.
- För att undersöka tillvänjning, utföra experimentet upprepande på ett djur.
- Ta bort masken från kanalen svällning.
- Om man vill hålla masken för efterföljande studier, koppla uttagen av chip mot gravitationen flödet och avfallsbehållaren. Tryck på kolven i sprutan försiktigt tills masken hela skjuts genom svällning kanalen in kanalen flöde.
- Fortsätt att trycka på sprutkolven tills djuret visas i ett droplet-program utanför chip. Koppla bort sprutan inklusive PE slangen från inloppet till mask, använda den för att aspirera maskar i droplet-programmet och överföra det på en agarplatta.
- Om man inte vill hålla masken, ta bort masken genom att trycka på kolven i sprutan tills masken hela skjuts genom svällning kanalen in kanalen flöde; gravitation flödet och sugningen av den peristaltiska pumpen kommer att bära djuret ur chipet och i avfallsbehållaren.
4. analys
- Hämta och installera den nyaste Fiji version32.
- Hämta och installera den nyaste versionen av java SDK.
Obs: Om det behövs, ta bort eller Byt namn på mappen java inuti mappen Fiji för Fiji att använda nyligen installerade java-kompilatorn. -
Programvara med öppen Fiji.
- Kontrollera om programvaran körs nyligen installerade java-kompilatorn genom att öppna ' Plugins | Utilities | ImageJ | Fastigheternas.
- Ladda ned filen pokinganalyzer*.java (https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer, se kompletterande fil 2).
- Dra och släpp filen .java i fönstret programvaran för att öppna den som en plugin.
-
Kompilera och köra filen pokinganalyzer*.java genom att trycka på Ctrl + R i Fiji; ett grafiskt användargränssnitt (PETA Analyzer) öppnas (figur 3).
- Klicka på fliken ”hjälp” och Läs om kraven för programvaran och hur att utföra analysen. Till att börja med välja ”Open video” tab. Ange videofilen plats för analysatorn: Klicka på knappen ”öppna en Video”, navigera till platsen för video och öppna den.
Obs: Programvaran börjar med den här fliken som öppnas. Om det inte är öppet när du startar en ny analys Klicka på fliken ”Open video”. Om videon är i a.tif format, öppna videon programmet internt och visa den första bilden i den nedre delen av gränssnittet. Om bilden inte är i videon som behöver analyseras, klicka på knappen ”öppna en video” att öppna en annan video. - För att fortsätta, klicka på fliken ”definiera ROIs”. På den här fliken, definiera positionen för TRN. Observera att den första bilden i den öppna videon visas i den nedre delen av denna tab. klick på knappen ”definiera TRN” och klicka på neuron i den övre delen av bilden som ska Visa GCaMP fluorescensen.
- Valfritt: Om ställdonet är synliga i den övre halvan av bilden programmet kan automatiskt spåra avståndet mellan neuron och ställdonet om så önskas. För detta, kontrollera ”definiera ställdonet”? -rutan, klicka på knappen ”definiera ställdon” och klicka på ställdonet i den övre halvan av bilden.
- Klicka på fliken ”analys” definiera andelen bild förvärv. Antingen skriver tal i det fältet eller klicka på upp eller ner knapparna för att öka eller minska numret. Om i föregående flik ”definiera ställdonet”? -rutan är markerad, definiera kamera Cellstorlek, förstoring och binning faktorn, så att programmet kan beräkna avståndet.
- Klicka på knappen ”starta analys”.
Obs: Programmet kommer nu att spåra neuron genom dess fluorescens i sekvensen bild i den övre halvan (kalcium beroende) och i den nedre halvan (kalcium oberoende) av bildsekvens. För att beakta neuron motion i planet för att spela in programmet undersöker ett område på 10 x 10 pixlar runt platsen där neuron i föregående bild att hitta positionen av neuron i följande bild. Det kommer att beräkna fluorescensen i båda halvorna av korrigering för bakgrunden fluorescensen (Fbg) och dividera med fluorescensen i de första 50 bilderna (F0):
Fluorescens förändringar i kanalen grön, aktivitet-beroende (FCa2 +) som orsakas av neuron rörelse ur planet av omkodning är sedan korrigerat med fluorescensen i röd, aktivitet-oberoende kanalen (F corr) och före stimulans standardavvikelsen för kalcium-beroende (sdCa2 +) och oberoende fluorescens (sdcorr) genom:
- Programmet kommer att visa dess framsteg i statusfältet i nedre delen av gränssnittet; När statusfältet når 100%, klicka på fliken ”resultat”. Om statusfältet stannar innan 100%, ger programmet ett felmeddelande om anledningen till att programmet inte kunde analysera videon.
- Om signal-brusförhållande är för låg, kan inte programmet identifiera neuron; Justera imaging parametrar i efterföljande inspelningar.
- Om neuron lämnar synfältet under inspelningen, programmet kan inte spåra den längre och kommer att sluta. För efterföljande inspelningar, placera neuron i mitten av synfältet i början av inspelningen.
- Om vissa regioner i synfältet är övermättad, kommer att automatiserad analys producera ogiltiga resultat. Efterföljande inspelningar, kontrollera fluorescens signalen inte mätta kamerasensorn.
- På fliken 'resultat' visas resultatet i den övre delen. Spara en tabbavgränsade txt-fil av resultattabellen genom att klicka på ”Spara resultatet bordet”.
Obs: Denna tabell består av tiden i sekunder och den normaliserade kalcium-beroende fluorescens (korrigerat av kalcium-oberoende fluorescensen). Om tidigare definierats, den innehåller också det totala avståndet mellan TRN och ställdonet i µm och avståndet mellan TRN och ställdonet vinkelrätt mot kanal väggen i µm. representativa resultat av fluorescensintensiteten öka efter stimulering kontra distansera av cell kroppen till närmaste ställdonet är ritade i figur 4. - Om det finns flera nervceller i en inspelning (avgränsade med mer än 10 pixlar), klicka på fliken ”definiera ROIs” igen och återgå till steg 4.6.2 med andra neuron.
- Klicka på fliken ”hjälp” och Läs om kraven för programvaran och hur att utföra analysen. Till att börja med välja ”Open video” tab. Ange videofilen plats för analysatorn: Klicka på knappen ”öppna en Video”, navigera till platsen för video och öppna den.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SU-8 litografi och Chip bindning
Litografi protokollet och PDMS molding följer standardprocedurer. Detaljer kan hittas någon annanstans23,24,25,26. PDMS bör lossna rånet utan problem efter härdning. Om SU-8 funktioner som slita under PDMS peeling, var antingen det SU-8 vidhäftning lagret eller silanisering otillräcklig. Om plasma-aktivering av glas coverslips och PDMS marker inte är tillräcklig, svag bindning kan resultera i läckage ur svällning kanal eller pneumatiska manöverdon resulterar i prestandaförsämring och avsaknad av stimulans. Om läckage är uppenbart, är chip obrukbar.
Manöverdonets prestanda
Alla PDMS manöverdonen och slangen ansluter chippet till luften behållaren måste vara ordentligt förseglade för att säkerställa korrekt pneumatiskt styrda av membranen. Upprepad insättning och borttagning av PE slangen (VVS) kommer att skada PDMS hål och leda till en minskning av trycket. Sådan förlust av trycket kommer att begränsa ställdon deformationen och den kraft som appliceras på huden av immobiliserade djuret. Omläggning av membranet kan mätas med en tom chip (inget djur närvarande) genom att utföra flera aktivering cykler med önskat tryck och jämföra de kvantitativa värdena med teoretiska förutsägelser. Omläggning av membranet mättes inte i närvaro av ett djur i svällning kanalen, eftersom membranet och worm gränsen är svårt att visualisera. Detta gör precision kalibrering med ett fångade djur inte möjligt. Tabell 1 visar den beräknade omläggning som en funktion av trycket. Dessa värden beräknades med hjälp av elastisk plattan teori och Detaljer kan hittas i Nekimken et al. 23 detta förhållande förväntas variera med skillnader i membranen tjocklek genereras under chip gjutning och andra faktorer såsom integritet limning mellan chip och glas och tätningar ansluta chip till trycket källor. Värdena var här, reproducerbara med liten variation som inte överstiger 1 µm vid 450 kPa tryck. Vi har präglat av membranen för alla tre olika stimulans profiler och hänvisar den intresserade läsaren till Nekimken et al. 23 i sammanfattningen, finns flera faktorer att överväga om värdena avviker från tabell 1: 1) läckage i slangar eller slangar kopplingar, 2) PDMS har en olika elasticitet, som kan resultera från en alternativa förhållandet bas polymer och härdare, eller 3) PDMS har åldern och fortsatte att crosslink över tid. Därför rekommenderas användning av marker som har utarbetats inom en månad efter sin ansökan.
Svällning prestanda
Efter att infoga maskar i inloppet av chip, bör ett lätt tryck med sprutan placera ett enda djur inuti kanalen svällning och presentera dess huden tillsammans med sex manöverdonen (figur 1). Ännu viktigare, behöver näsan av djuret inte nödvändigtvis sticker ut i reservoaren buffert. I stället är det viktigare att placera djuret så att neurite ligger i anslutning till närmaste ställdonet och dess cell kropp är inom synfältet av mikroskopet. För att uppnå optimal neuronal aktivering, bör avståndet mellan ställdonet och cellkroppen justeras så att ställdonet ligger anterior cellkroppen av intresse. Vår erfarenhet för nervceller stimuleras posteriort cellkroppen, nej aktiveringen kommer äga rum och kalcium kommer att transienter vara frånvarande. Korrekt fixering kan uppnås med unga vuxna eller en - dag-gammal hermafroditer (enheter som är optimerade för dessa två åldrar finns på samma masken). Mindre djur kommer att glida in i reservoaren samling eller flytta sidled inuti kanalen svällning. Djur som är för stor kommer att pressas in i kanalen, som kan leda till tidig aktivering av dess TRNs och efterföljande underlåtenhet att upptäcka Mekanoreceptorfysiologi transienter. Dessutom, borttagning av stora maskar utmanande, leder till djurets död eller igensättning av enheten. Med denna design immobiliseras PLM neuron vanligtvis inte helt, så är det gratis att flytta sidled och vertikalt. Även om vi har aktiverat PLM nervceller, är inspelning kalcium transienter i dessa nervceller svårt på grund av vertikal rörelse av svansen. En annan svällning design har använts för att spela in från PLM33.
Avbildning av kalcium transienter och analys
En gång på plats, djuren kan stimuleras med hjälp av en av de sex ställdon. De sex ställdon är positionerade för att leverera mekaniska stimuli till varje av de sex TRNs. En mikroflödessystem flödesregulator ansluten till en 450-kPa in-house trycket källa användes för att leverera till djuret ett stimulus protokoll som består av en 2-s 275 kPa steg, en 2-s 0 – 275 kPa ramp och en 2-s-buzz (75 kPa, 10 Hz sinus ovanpå med en 275 kPa steg) , avgränsade med en 10 s väntetid. De samtidigt inspelade bildsekvenser av de kalcium transienter analyserades i Fiji, med en custom-skriven programvara tillgänglig på våra GitHub konto (se ovan och https://github.com/HFehlauer/Poking-Analyzer). Vi hittade att trycket ramper och trycket steg aktiveras TRNs endast om stimuli uppnått tryck ovan 400 kPa. Däremot observerades en robust aktivering av alla TRNs stimuleras med hjälp av en sinusformad, 10-Hz buzz trycket < 275 kPa (figur 4). I allmänhet TRNs svarade bättre på ett kort sinusformad stimulus (kallas 'buzz'), i samförstånd med tidigare rapporter med hjälp av olika metoder1,9. Stimulering med en buzz är mycket effektiv, leder till ~ 90% av aktivering i alla nervceller och prövningar testade (figur 4). Överraskande nog fanns det ingen stark korrelation observerades på huruvida stimulansen tillämpades på den dorsala eller ventrala sida, och var oberoende av avståndet mellan cellkroppen och stimulans position på neurite. Framtida studier kommer att behöva undersöka om fördröjningen av den maximala Svaren korrelerar med stimulans avståndet.
Figur 1: översikt av chip design. (A) Schematisk layout photomasken och resulterande chip med alla anslutningar anges. Det finns sex aktivering fingrar, tre på varje sida av kanalen centrala svällning. Skalstapeln = 3 mm. (B) fotografi av mikrofabricerade enheten med PDMS bundna till täckglaset och ansluten till slangar i inloppet till mask och mask uttagen. Enda av aktivering fingrarna är ansluten till trycket källan, medan de övriga fem inte är upptagna. Delar av figuren har återgivits från referens23 under kreativa gemensamma licenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: närbild av centrala svällning kanal och svällning förfarande. (A) Schematisk ritning av kanalen svällning. Pelarna på masken inloppssida bidra till att orientera masken och underlätta lastning av djuren. Aktivering fingrarna kan vara trycksatt och strecksatsen en tunn membran i fångade preparatet. Skalstapeln = 200 µm. (B) representativa video stomme av en mask som att vara instängd i horisontell kanal. Kanalen är utformad så att masken kommer att lägga över de sex pneumatiska manöverdon. Svansen är till vänster, huvud är till höger. Läge av enskilda touch receptor nervceller (TRNs) är anges med pilar och märkt i figuren. Skalstapeln = 100 µm (i alla paneler). Delar av figuren har återgivits från referens23 under kreativa gemensamma licenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: översikt av medföljande Fiji plugin att analysera kalcium spår förvärvade med detta protokoll. Programvaran startar ett grafiskt användargränssnitt. Den första fliken (”Open video”) av användargränssnittet visar knappen för att öppna en video, det visar sökvägen och den första bildrutan i filmen öppnade. Den andra fliken (”definiera ROIs”) innehåller knappen om du vill definiera en touch receptor neuron, en kryssruta för att aktivera knappen ”definiera ställdon” och knappen ”definiera ställdon”. I den nedre delen visas den första bildrutan i videon. I den övre delen av den tredje fliken (”analys”) visas justerbara parametrar för bildanalys. Den mellersta delen visar knappen ”starta analys”. I den nedre delen visar en förloppsindikator förloppet för den aktuella analysen. I fjärde fliken ”resultat”, visas resultatet som ett diagram över den relativa fluorescensintensiteten över tid. I nedre delen finns det en knapp för att spara resultattabellen. I femte fliken ”hjälp”, visas en hjälptext visar kraven för analysprogramvara och instruktion på hur man använder den. Figur anpassad från referens23 under kreativa gemensamma licenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: enskilda nervceller reagera på mekaniska stimuli. (A) representativa fluorescens Mikrograf av GCamP6s märkt AVM touch receptor neuron före och efter mekanisk stimulering med en buzz. Skalstapeln = 10 µm. färgskala = 1.500-3.500 gråvärden. (B) Stimulus protokoll inklusive 2 s membran magnetiseringen som representerar en 275 kPa steg, en 275 kPa ramp och en sine (75 kPa; 10 Hz) ovanpå med en 275 kPa steg (buzz). (C) normaliserad GCamP6s intensitet trace (medelvärde ± SEM som skuggade området) inspelade från AVM stimuleras med profilen visas i B av vildtyp djur (grön, n = 14) och djur mutant i Mekanoreceptorfysiologi kanal subenhet mec-4 (blå, n = 10), d.v.s. kända för att underlätta Svaren till mekanisk stress. Detta indikerar att transienter induceras av de tillämpa mekaniska stimuli. Delar av figuren har återgivits från referens23 under kreativa gemensamma licenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tryck (kPa) | Menar nedböjning (µm) | SD | Förväntad nedböjning (µm) |
| 0 | -0,01 | 0,01 | 0 |
| 50 | 0,77 | 0,26 | 0.607143 |
| 100 | 1,57 | 0,58 | 1.21429 |
| 150 | 2.32 | 0,65 | 1.82143 |
| 200 | 3.13 | 0,74 | 2.42857 |
| 250 | 3.86 | 0,79 | 3.03571 |
| 300 | 4,61 | 0,79 | 3.64286 |
| 350 | 5.3 | 0,82 | 4,25 |
| 400 | 5,92 | 0,82 | 4.85714 |
| 450 | 6.43 | 0,75 | 5.46429 |
Tabell 1: förväntat experimentella nedböjning värden för tillämpad pressar alltifrån 0 – 450 kPa och deras teoretiska förutsägelser. Uppgifter härrör för steg stimulans. Menar ± SD. Dessa data förvärvas med en tom svällning kanal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll visar en metod för att leverera exakt mekanisk stimulering till huden på en spolmask instängd i en mikroflödessystem chip. Det är avsett att underlätta integrationen av fysiska stimuli för att besvara biologiska frågor och syftar till att effektivisera Mekanobiologi forskning inom biologisk labs. Denna metod utökar tidigare analyser för att utvärdera funktionen av mechanosensory nervceller i C. elegans. Tidigare kvantitativa och semikvantitativt tekniker mätt krafter1,34 och beteende35, men var svårt att integrera med högupplöst avbildning av neuronal aktivitet. Vi anser således att användningen av detta chip sträcker sig aktuella program och dess prestanda är optimerad för stimulering av nervceller som krävs för lätt beröring. Vi har optimerat avböjningen av ställdonet till reach 5 µm, vilket är en tillräckligt stark stimulans att nå nästan maximal neuronala svaren. Med små variationer anser vi att denna design kan användas för att stimulera hård beröring receptorer som PVD-nociceptorer som innerverar den kropp yta36.
Modifieringar och felsökning
Om inga rena rum är tillgängliga för SU-8 litografi, kan en bänkmonterade ren låda eller SU-8 soft-litografi stationer utrustad med UV lampor, programmerbara kokplattor och spin bestrykningsmaskiner användas. Ett billigt alternativ för produktion av mikrofabricerade enheter som undviker användningen av rena rumsfaciliteter kan också följt26.
I design genomfört vi en befintlig svällning-teknik, som immobilizes ett enskilt djur i en mikroflödessystem kanal. Fällans utformning är anpassad från en enhet som används för att studera lukt sensation i den mask36, men det är inte det enda hållbara alternativet att undertrycka mask rörelse. Andra strategier har rapporterats att hålla maskar i ultrakalla enheter: CO2, elektrofores, tryckkraft immobilisering11,37,38 har använts och kan integreras i en modifierad design.
Vi levererat trycket till aktivering kanaler med en kommersiellt tillgänglig, piezoelektrisk tryckpump som kan styra och leverera upp till 800 kPa från en yttre tryck källa. Vi ansluten pumpen till komprimerad luft i forskningen byggnad, som klarar leverera ~ 450 kPa. Om ingen källa av tryckluft är tillgänglig, kunde en tank av komprimerade, inert gas (t.ex., N2) användas. Detta skulle ha fördelen av att leverera högre tryck och generera stora deformationer, men kräver också högtryck rördelar att ansluta till tryckregulator till chip. Fabricera chipet från mjukare PDMS är alternativa sätt att öka tryckinducerad deformationer.
I detta experiment, är utlopp tryck pumpen ansluten till PDMS chip genom 1-mm mottagande öppningar (t.ex., stansa hål) ansluten med lim-fri och reversibel sammanlänkningar som består av en press-fit 20 G metall-rör insatt i en PE slangar. Dessa har visat att motstå tryck upp till 700 kPa39. Försiktighet måste iakttas under upprepade införande, emellertid, som PDMS runt hålen tenderar att riva och därmed begränsa prestanda eller göra chipet oanvändbart. Av denna anledning var metall slangar infogas en gång och vänster inkopplad i chipet, utan att ta bort och infoga det upprepade gånger.
Kritiska steg
Stimulering levereras av en trycksatt aktivering kanal, vilket gör indrag för huden. Den resulterande deformation och Mekanoreceptorfysiologi neuron aktivering kan avbildas med hög upplösning på en optisk fluorescens Mikroskop eller confocal set-up. Flera faktorer kan försvåra upptäckten av GCaMP svaren. Först, C. elegans uttrycka en blue-light-receptorn30 i många nervceller, inklusive TRNs21,23, som aktiverar cellerna efter belysning med blå (488 nm) ljus. Därmed, imaging C. elegans med genetiskt kodade kalcium sensorn GCaMP6s kommer att aktivera dess nervceller vid belysning, skymmer kalcium transienter aktiveras av mekanisk stimulering23. Arbetar i lite-1 mutant bakgrunden eller i rött-skiftat kalcium aktivitetssensorer undviker denna confound. Andra, mekaniskt inducerad kalcium övergående kanske inte identifieras om stimulans profilen inte matchar mekanoreceptorer känslighet. Vi misslyckades att upptäcka aktiveringen för hög amplitud steg och ramper, men framkallat extremt hög signaler efter stimulering med måttlig dynamics stimuli (t.ex., 200 - kPa buzz). Slutligen TRNs vänja en upprepad stimuli levereras med kort (< 60 s) interstimulus intervall. Det är således viktigt att design stimulering sekvenser som minimerar tillvänjning utom i fall där tillvänjning som studeras.
Vi rekommenderar att filtrera alla lösningar, som skräp och damm i buffertar kan enkelt täppa kanalen liten svällning. Ytterligare, djur måste vara ålder-synkroniserad och storlek-matchade till chip design; djur som är mindre än unga vuxna kommer att glida igenom enheten eller misslyckas med att vara återhållsamma och större djur går inte in i svällning kanaler och riskerar spricker eller igensättning chip. Vid igensättning, tillämpning av överdrivet tryck på inloppet mask eller gravitation flöde får rengöra kanalerna, men kunde också leda till montering.
Som nämnts i resultatavsnittet, kan flera faktorer leda till ett misslyckande i programmet analys. Om problem påträffas i sammanställningen koden, rekommenderas Kontrollera att den senaste Fiji programmet körs och att Fiji använder de nyaste Java-kompilatorn. Om programmet körs men det finns oväntade kontrollera resultat vänligen att den inspelade filmen har en 50-rambuffert innan den faktiska mekanisk stimuleringen utförs för att säkerställa en korrekt uppskattning av baslinjen och bakgrund fluorescensen. Ytterligare, synfältet av gröna, aktivitet-beroende (GCaMP6s) och röda, aktivitet-oberoende (tagRFP) kanal antas projiceras på den övre och nedre halvan av kamera chip, respektive. Om optiska stråldelare projekt bilderna på den vänstra och högra halvan av sensorn, slå på kameran 90° för att erhålla önskad orientering under inspelningen eller rotera bildstaplar i en pre-Processing steg. Dessutom programmet identifierar neuron genom dess fluorescens och misslyckas om signal-brus-förhållande eller kontrasten är för låg. I detta fall kan ändra magnetiseringen intensitet och/eller exponering tid lösa problemet. Programmet slutar också om neuron lämnar synfältet under inspelningen, i vilket fall neuron bör vara placerad i mitten av synfältet innan du påbörjar ett nytt förvärv.
Begränsningar av tekniken
Den nuvarande designen möjliggör stimulering av kroppen väggen Mekanoreceptorfysiologi nervceller som de PVD nociceptorer och den TRNs, men inte mekanoreceptorer som innerverar maskens huvud regionen, exempelvis FLP och aska. Det är begränsat till trycket < 700 kPa. För större påfrestningar behöver olika rörkopplingar vara anställd. Eftersom trycket leverans här inte översteg 500 kPa, begränsades det maximala trycket som är möjligt att ansöka till 450 kPa. Kalcium transienter observerats här Markera den övre gränsen för den förvänta signalen. En annan begränsning för utformningen av våra ställdon är deras bildförhållande. I princip, tunnare membraner skulle möjliggöra större deformationer, men strukturer med hög storleksförhållande är svårt att tillverka på ett tillförlitligt sätt. Om större deformationer är väsentliga, kan bredare ställdon eller parallella deformationer från båda sidor vara användbart, som presenterades av Cho et al. 29
Även om vi kan övervaka membran deformation, är det svårt att mäta de krafter som tillämpas vid pneumatisk stimulering av kanalerna som aktivering. Princip begränsningen är att kontaktyta ställdonet inte är väldefinierade. Detta beror på att ställdonet själv är elastisk och deformeras under aktivering, vilket ändrar kontakt radien med ökande utböjning. Med dessa förbehåll i åtanke, kan vi uppskatta att en 5 µm indrag (omkring 300 kPa aktivering tryck i en tom chip) förutspås för att gälla masken enligt mask stelhet uppskattningar av Petzold et al. ca 3,8 µN 34 eftersom kraft beroendet av den neuronala nuvarande varierar i maskar med olika stiffnesses1,34, dock övervakning indrag som ett mått på stimulus intensitet istället för kraft rekommenderas.
Vi hoppas att spridning av detta protokoll hjälper användare utnyttja mikrofluidik för Mekanobiologi forskning med C. elegans som modellsystem, och därmed påskynda befordran av vetenskap i detta viktiga ämne i fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty och Veronica Sanchez för stöd i enheten design och generering av muterade djur. Denna forskning stöddes av NIH grants R01EB006745 (till BLP), R01NS092099 (till MBG), K99NS089942 (till MK), F31NS100318 (till ALN) och mottagna medel från det Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horizon 2020 forskning och innovation program () bidragsöverenskommelse nr 715243 till MK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
References
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
