Summary
Vi illustrerer en rett fram metode til å utlede murine primære makrofager fra benmargen celler og en enkel metode å forberede BSA-fettsyrer conjugates. Deretter viser vi at mettede fettsyrer kan indusere macrophage celledød, og slike celledød er positivt assosiert med mobilnettet akkumulering av ceramide nivåer.
Abstract
Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer, som kan spille en avgjørende rolle i å regulere deres immun funksjoner. Mange studier har vist at ulike fettsyrer, mettet eller umettede, kan ha ulike virkninger på cellevekst og funksjon. Men varierer tilnærmingene brukt for fettsyrer forberedelse, som kan føre til ikke-fysiologiske resultater. Serum albumin, en naturlig operatør for fettsyrer i pattedyr perifert blod, anbefales for å danne en konjugert med salt natrium fatty syren å studere fettsyrer funksjon i pattedyrceller, således minimere toksisitet av fettsyrer såpe. Dermed er en enkel, relativt rask oppvarming og sonicating metoden utviklet og presenteres her for BSA fatty acid konjugat formasjonen. Vi beskriver en protokoll som mettede fettsyrer, spesielt sted syren å indusere alvorlig celledød i musen benmarg avledet makrofager. Videre viser vi at mettede fettsyrer-indusert celledød er positivt assosiert med akkumulert mobilnettet ceramide nivåer. Denne metoden kan utvides for studier av effekten av fettsyrer på andre pattedyrceller.
Introduction
Fettsyrer spille en avgjørende rolle i energi metabolisme og syntese av membran fosfolipider i forskjellige celler. Fettsyrer har en lav vandig oppløselighet. Aktuelle utarbeidelse av fettsyre er av avgjørende betydning for å studere biologiske funksjoner av fettsyrer i pattedyrceller. Når fettsyrer er forberedt med etanol, kan mange fettsyrer viser deres giftige såpe (vaskemiddel) effekt på cellemembranen, selv i relativt lave konsentrasjoner1. Som en naturlig, store transporter for frie fettsyrer i serum, serum albumin er ansett som en god transportør for fettsyrer levering i vitro fettsyrer funksjonen analyser2,3,4. Detaljer om utarbeidelse av fettsyre og serum albumin konjugert er imidlertid vanligvis ikke tilgjengelig selv om mange oppgaver ved hjelp av fettsyrer har blitt publisert.
Makrofager uttrykke svært epidermal fettsyrer-bindende protein og adipose fettsyrer-bindende protein5,6,7,8. De aktivt opptak mettet og umettede fettsyrer som kan regulere deres immun funksjoner. For å studere virkningen av fettsyrer makrofager og andre celler, var forskjellige metoder for fettsyrer forberedelse anvendt1,7,9. Bruke riktig forberedt fettsyrer/serum albumin conjugates for å undersøke virkningen av fettsyrer på macrophage funksjon er av avgjørende betydning i å skaffe biologisk meningsfull data. Studier av effekten av fettsyrer på macrophage funksjon kan gi grunnleggende kunnskaper og potensielle terapeutiske mål knyttet til metabolismen av fettsyrer i macrophage-involvert sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
protokollen ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på Universitetet i Louisville.
1. musen benmarg avledet makrofager (BMDMs)
- Euthanize en 6 - til 8-uke-gamle, sunn vill-type mus ved hjelp av CO 2. Feste det til et skum bord og spray den med 70% etanol før det er gjennomvåt. Fjerne tibia/femur Ben med tang og saks. Legg dem i en Petriskål med 5 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS). Utfører alle prosedyrer under sterile forhold.
- Klippes begge ender av det tibia/femur Ben med en saks i sterilt vev kultur hette. Tømme bein med en 25 G nål med PBS + 2% fosterets bovin serum (FBS) i en 15 mL tube.
- Sentrifuge benmarg cellene på 500 x g, 4 ° C i 5 min.
- Resuspend celle pellet i 1 mL røde blodlegemer lyseringsbuffer til lyse røde blodlegemer (RBC) for mindre enn 1 min. Dilute umiddelbart med 9 mL 1 x PBS. Sentrifuger igjen som i trinn 1.3. Dekanter supernatants.
- Resuspend celle pellet i 10 mL 1 x PBS, filtrere celle suspensjon gjennom en steril 40 μm nylon maske i en annen 15 mL tube fjerne celle rusk/klumper. Sentrifuger igjen som 1.3. Dekanter supernatants.
- Resuspend celle pellet i 15 mL Roswell Park Memorial Institute middels (RPMI) 1640 med 5% FBS og 10 μg/mL gentamicin, plate cellene i en 100 mm vev kultur parabol på 37 o C inkubator for 60 min. forsiktig swirl fatet, ta ut flytende celler og telle dem.
- Plate 6 x 10 6 celler i en 100 mm rett med 12 mL macrophage skille media (RPMI 1640 med 5% FBS og 10 μg/mL gentamicin, blandet med 30% L929 betinget media 10) med 10 ng/mL rekombinant musen macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) i 2 dager.
- Etter dyrking for 2 dager i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2, feed hver rett med 6 mL frisk macrophage skille media med 10 ng/mL M-CSF.
- På dag 5, ta 8 mL av den gamle mediet ut uten å forstyrre cellene og legge 10 mL frisk macrophage skille media med 10 ng/mL M-CSF.
- På dag 7, høste det Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMDMs) bruker en celle lifter.
Merk: Vedlagte makrofager kan også bli atskilt med 5 mL 1 mM EDTA i 1 x PBS for 5 til 10 min etter fjerner flyte cellene og vaske platen to ganger med 5 mL 1 x PBS. Sentrifuge cellene som i trinn 1.3., resuspend dem i frisk macrophage skille media og telle dem med en hemocytometer.- Bekreft BMDMs ' fenotypen av flowcytometri som beskrevet 5. Utarbeide avledet musen makrofager i en viss konsentrasjon for følgende studiene.
2. BSA fatty Acid bøy forberedelse
- forberede 2 mM BSA i sterilt PBS. For eksempel veie 6.65 g BSA, legge til 30 mL 1 x PBS å oppløse, deretter legge mer PBS inntil 50 mL, skalering komponenter for å gjøre 2 mM BSA på 1 x PBS.
- Forberede 5 mM personlige natrium salt av fettsyrer i 2 mM BSA. Varme til 37 ° C eller høyere, om nødvendig, og sonicate blanding av 2 mM BSA og natrium salt av fettsyrer til en klar løsning er oppnådd.
Merk: Sammenlignet med umettede fettsyrer, mettede fettsyrer trenger en høyere temperatur og sonication gang for oppløsende. - Filter fatty-acid-BSA løsningen gjennom en 0.22 μm filter, aliquot den til 1,5 mL steril microcentrifuge rør, og lagre dem på 4 ° C for kortvarig bruk eller på 20 ° C for langsiktig lagring. Ingen nedbør bør være observert etter lagring på 4 ° C i kjøleskapet.
3. Mettede fettsyrer indusere celle død av musen benmarg avledet makrofager
- Plate BMDMs i en 24-og vev kultur plate med 0,4 x 10 6 /mL i macrophage skille media.
- Behandler cellene med 0.4 mM palmitinsyre og stearinsyre 16-24 h på en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Bruke BSA som kontrollen negative.
- Høste celler med en celle lifter etter behandling og Nedspinning cellene på 500 x g, 4 ° C i 5 min.
- Stain cellene med Annexin V-Alexa 488 og 7-aminoactinomycin D (7-AAD) i 100 μL annexin V bindende buffer i 15 min ved romtemperatur.
- Fortynne prøven med 200 µL annexin-binding bufferen, bland forsiktig og holde prøvene på is etter inkubasjonstiden.
- Analysere farget cellene snarest ved flyt cytometri 5. Annexin V-Alexa 488 oppdages i FITC kanal og 7-AAD oppdages i PerCP/PerCP-Cy5.5 kanal.
4. Intracellulær Ceramide flekker
- etter fettstoffer syre behandling, høste celler som i trinn 3.3. Deretter ordne cellene i 4% paraformaldehyde i 30 min.
- Vask prøven med 1 mL 1 x PBS, Nedspinning som trinn i 3.3, og Dekanter nedbryting.
- Stain cellene med anti-ceramide primære antistoff (1:200 fortynning) i 100 μL 1 x permeabilization buffer for 30 min.
- Vask og spinn ned cellene igjen som i trinn 4.2.
- Stain cellene med anti-musen IgM sekundære antistoff (1:500 fortynning) i 100 μL 1 x permeabilization buffer for 30 min.
- Vask og spinn ned cellene igjen som i trinn 4.2. Legge til 250 μL 1 x PBS og analysere farget cellene ved flyt cytometri 5.
Merk: Se detaljert reagenslisten i utstyr og reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fedme øker frie fettsyrer konsentrasjonene i serum. Som profesjonell phagocytes tar makrofager aktivt opp fatty syren å opprettholde vert homeostase. Under disse prosessene, kan overbelastet lipider indusere macrophage celledød. Dette kultivert vi BMDMs i vitro med overvektige kosttilskudd fettsyrer og målt macrophage celledød bruker flyt cytometric flekker. Sammenlignet med kontrollen BSA, mettede fettsyrer, indusert spesielt sted syrer, betydelig celledød BMDMs. døde celler ble vist som dobbelt positiv bestander farget av Annexin V og 7-AAD (figur 1a-b). Av notatet, umettede fettsyrer ikke få betydelige macrophage celle død5. Dataene foreslår den toksiske effekten av økte nivåer av gratis mettede fettsyrer i vivo.
Likeledes fant bruker en macrophage celle linje med levedyktighet ble utsatt for behandling av palmitic syrer eller sted syren5, vi at makrofager mottakelighet for palmitinsyre-indusert celledød ble også påvirket av antall celler i kultur (figur 2a). Enkelt sagt, kulturelle oppstiller, det flere makrofager i brønnene, mindre celledød av fettsyrer. Videre var palmitinsyre-indusert celledød positivt assosiert med akkumulert nivåer av mobilnettet ceramides (figur 2b). Når makrofager ble kultivert i en høy tetthet tilstand, middels næringsstoffer var oppbrukt raskere for energi metabolisme, disse cellene var mindre utsatt for palmitinsyre-indusert celledød sammenlignet makrofager kultivert i en lav tilstand. I kontrast, når celler ble utsatt for en nærings-beriket tilstand (f.eks, fedme), kan overflødig fettsyrer være metaboliseres for å produsere giftig ceramides, og dermed fører til fettstoffer syre-indusert celledød. Dermed kan celle kulturelle forhold bringe variasjon til resultatene av mettede fettsyrer-indusert celledød.
Figur 1: høy konsentrasjon av fettsyrer, spesielt sted syrer, indusere macrophage celledød. BMDMs (dag 7) var belagt som 0,4 x 106/mL i frisk macrophage skille media. Etter celle vedlegg til 0,5-1 h, BMDMs ble behandlet med den angitte konsentrasjonen av hver fettsyrer for 24 h. Media alene og BSA ble brukt som negative kontroller. Etter behandling, ble celler løftet høstet og spunnet ned 500 g i 5 min på 4 ° C. Celler var farget med 7-AAD og Annexin V Alexa 488 100 μL annexin-binding buffer i 15 min. Deretter legge til en annen 200 μL annexin-binding buffer hvert utvalg før flyt cytometri analyse. (A) demonstrasjon av flyt cytometri data i celler av fettsyrer. (B) Sammendrag av celledød av fettsyrer. Feilfelt representerer eksempel SD. Spesielt stearinsyre (SA) er statistisk signifikant forhold til BSA kontrollens celledød indusert av palmitinsyre (PA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: tilgjengeligheten av media næringsstoffer virkninger makrofager mottakelighet for palmitinsyre indusert celledød. (A) cellen ernæring status påvirker sin toleranse for mettede fettsyrer-indusert stress. (B) cellen mottakelighet for mettede fettsyrer indusert celledød er sterkt korrelert med akkumulert mobilnettet nivåer av ceramide. Media næringsstoffer forløpningen ble oppnådd ved dyrking wild typen macrophage cellen linje 1 meter, 2M, 4M og M (M = 1 x 106) i 6 mm petri retter med 6 mL RPMI 1640 med 5% FBS og 10 μg/mL gentamicin for 18 t. Media fargen er mer gul på grunn av mer næringsstoffer uttømming når et større antall celler er kultivert i retter. Mer enn 90% av cellene er fortsatt svært levedyktig. Vedlagte levedyktig cellene var løftet av pipettering etter å ha sittet i PBS i 5 min og re kultivert umiddelbart på 0.2x106/mL i frisk medier i 24-og plater. Cellene ble behandlet umiddelbart med 0.4 mM palmitinsyre 18 h med BSA som kontrollen for hver kilde (nærings gradient) av celler. Deretter ble alle behandlet celler høstet og farget med 7-AAD for celledød eller beiset med intracellulære ceramide. Spontan celledød (7-AAD +) prosenter var mindre enn 8,6%. Behandling bestemt celledød ble beregnet som % forskjellen i 7-AAD + mellom behandling og sin egen BSA kontroll (a). Behandling bestemt ceramide nivået ble anslått som mener fluorescens intensitet (MFI) forskjellen mellom behandlingen og sin egen BSA kontroll (b). Dette forsøket ble gjentatt og representant data presenteres. Feilfelt representerer utvalg SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Riktig utarbeidelse av fettsyre løsning er av avgjørende betydning å studere biologiske funksjonen av fettsyrer. Nøytralisering av fettsyrer øker løselighet i vandig løsning. Natrium salter av fettsyrer, spesielt mettede fettsyrer, er imidlertid fortsatt av lav oppløselighet i vann eller PBS vi observert. En metode er å bruke 95-100% etanol til å oppløse fettsyrer1. Bruker denne metoden, kan høyere toksisitet celler sees selv i lave konsentrasjoner for mindre giftige umettede fettsyrer. En annen måte å forberede fettsyrer løsning er å utnytte metyl-β-cyclodextrin som en levering system slik at fettsyrer har optimale forhold, igjen i løsningen i deres monomerisk skjemaet9,11. Fettsyrer tilberedt med slik metode syntes å ha normal funksjon, men gjennomføre metoden er komplisert. Virkningen av methyl-β-cyclodextrin på cellevekst er at høy konsentrasjon kan føre til celle død12. Mettet stearic og palmitinsyre syrer brukes høy temperatur (60 oC) til å hjelpe med solubilization9.
Siden serum albumin er en stor fettsyrer-bindende protein i ekstracellulære væske, som hjelpemidler i transport av fettsyrer i lymphatic og vaskulære systemer, er det foretrakk naturlig bærer for funksjonell studiet av fettsyrer. For å unngå lav Løseligheten av fettsyrer salt i vandig løsning, sonication vil forenkle Bøyning av fettsyrer med BSA, dermed hjelpe fettsyrer solubilization. Det tar mye lengre tid (timer) som solubilize mettede fettsyrer enn umettede fettsyrer (30 minutter) med samme volum og konsentrasjon. Selv om varme- og sonication er kritiske for BSA fatty acid Bøyning, er høy temperatur (mindre enn 50 oC) foreslått for å få klar BSA-PA, BSA-SA konjugat løsninger og en lav temperatur er sterkt anbefalt for solubilizing umettede fettsyrer på grunn av deres mottakelighet for oksidasjon ved høy temperatur. 5:2 molar forholdet mellom fettsyrer til BSA er ansett god sammenlignet med 3:1 eller molar 6:1-forhold som var publisert7. Dette kan sikre mindre helt gratis fettsyrer i løsningen å unngå toksisitet av fettsyrer såpe. BSA-fettsyrer forberedt denne måten synes å være stabil løsninger (ingen nedbør, minst) på 4 ° C i minst 3 måneder som vist i funksjonaliteten på macrophage celledød. Seal hetten av røret hvis forberedt fettsyrer skal ikke brukes i lang tid.
Når en klar løsning av BSA-fettsyrer i PBS er oppnådd, er mer sannsynlig konsistente resultater fra fettsyrer behandling garantert. Imidlertid reagerer sultne og velfødde makrofager helt forskjellig på fettstoffer syre behandling, spesielt mettede fettsyrer. Makrofager med overflødig næring er mer utsatt for mettede fettsyrer-indusert celledød enn sultne eller sultet seg fordi sulten celler kan metabolically avgifte mettede fettsyrer på grunn av deres overlevelse og vekst forespørsel. Slike celledød er sterkt forbundet med akkumulert mobilnettet ceramide nivåer. Av notatet oppstår ceramide toksisitet bare når intracellulær ceramide nivåer når en viss terskel. For å sikre konsekvent resultater fra fettsyrer behandlet makrofager eller andre typer celler, bør celler bli kultivert med fersk medier med rikelig næringsstoffer. Alle sub-optimale celle kultur forhold kan resultere i sub-optimale data.
Samlet gir disse protokollene mye nødvendig informasjon for å studere virkningen av fettsyrer på makrofager av andre laboratorier. Sammenlignet med andre metoder, genererer dette direkte tilnærming BSA fatty acid conjugates uten å bruke en ekstra løsemiddel som etanol. Den mest utfordrende trinnet er å forberede nøyaktig, stabil BSA fatty acid løsning fordi sonication genererer varme og det er vanskelig å kontrollere temperaturen. Heldigvis er umettede fettsyrer enkle å lage på kort tid og forbli stabile, mens mettede fettsyrer synes å stå relativt høye temperaturer fordi de er mettet og motstandsdyktig mot oksidasjon i en slik tilstand. Så langt har vi ikke observert noen problem eller begrensning med BSA fatty acid conjugates forberedt på denne måten. Endring av våre protokollen vil være nødvendig hvis det trengs mer følsomme eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen økonomiske interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av universitetet i Louisville oppstart midlene og National Cancer Institute (Bethesda, MD) gir R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
