Summary
Un metodo semplice per preparare BSA-degli acidi grassi coniugati e illustriamo un metodo semplice per derivare macrofagi murini primari da cellule del midollo osseo. Allora dimostriamo che gli acidi grassi saturi può indurre la morte delle cellule del macrofago, e tale morte delle cellule è associato positivamente con accumulo cellulare di ceramide livelli.
Abstract
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e proteina-acido grasso adiposa. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi, che potrebbe giocare un ruolo critico nella regolazione della loro funzioni immuni. Numerosi studi hanno dimostrato che vari acidi grassi, saturi o insaturi, può possedere diversi impatti sulla crescita delle cellule e la funzione. Tuttavia, gli approcci utilizzati per la preparazione dell'acido grasso variano, che può portare a risultati non-fisiologica. Albumina, un vettore naturale per gli acidi grassi nel sangue periferico dei mammiferi, è consigliabile per la formazione di un coniugato complesso con il sale di sodio degli acidi grassi per studiare la funzione dell'acido grasso in cellule di mammifero, riducendo così al minimo la tossicità dell'acido grasso sapone. Così, un semplice, relativamente rapido riscaldamento e sonicating metodo è sviluppato e presentato qui per la formazione di coniugato acido grasso-BSA. Descriviamo un protocollo utilizzando acidi grassi saturi, soprattutto gli acidi stearico di indurre morte cellulare severa nei macrofagi derivato del midollo osseo del topo. Noi dimostrare ulteriormente che la morte cellulare indotta da acido grasso saturo è associata positivamente con ceramide cellulare accumulato livelli. Questo metodo può essere esteso per lo studio dell'impatto dell'acido grasso sulle altre cellule di mammiferi.
Introduction
Acidi grassi svolgono un ruolo critico nel metabolismo energetico e nella sintesi dei fosfolipidi di membrana in diversi tipi di cellule. Gli acidi grassi hanno una bassa solubilità in acqua. Una preparazione adeguata degli acidi grassi è di importanza critica per studiare le funzioni biologiche degli acidi grassi nelle cellule dei mammiferi. Quando gli acidi grassi sono preparati con etanolo, molti acidi grassi può mostrare il loro effetto tossico sapone (detersivo) sulla membrana cellulare, anche a concentrazioni relativamente basse1. Come un trasportatore naturale, importante per gli acidi grassi liberi nel siero, l'albumina di siero è considerato un buon vettore per acido grasso consegna in vitro per acido grasso funzione analisi2,3,4. Tuttavia, i dettagli della preparazione del coniugato dell'acido grasso e albumina del siero non sono solitamente disponibili anche se sono stati pubblicati molti articoli di ricerca utilizzando gli acidi grassi.
I macrofagi esprimono altamente epidermica dell'acido grasso-proteina e adiposo dell'acido grasso-legante della proteina5,6,7,8. Essi attivamente l'assorbimento saturata e acidi grassi insaturi che possono regolare le loro funzioni immuni. Per studiare l'impatto degli acidi grassi sui macrofagi e altre cellule, diversi metodi di preparazione dell'acido grasso sono stati applicati1,7,9. Usando opportunamente preparato acido grasso/siero albumina coniugati per studiare l'impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago è di importanza critica nell'ottenere dati biologicamente significativi. Studi sull'impatto degli acidi grassi sulla funzione del macrofago possono fornire conoscenze di base e potenziali bersagli terapeutici relativi al metabolismo dell'acido grasso nelle malattie del macrofago-coinvolti.
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Protocol
il protocollo è stato approvato dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) della University of Louisville.
1. macrofagi derivati del midollo osseo di topo (BMDMs)
- Euthanize un mouse di tipo selvaggio a 8-week-old 6, sano usando CO 2. Aggiungerla a un bordo della gomma piuma e spruzzarlo con etanolo al 70%, fino a quando è bagnato. Togliere le ossa tibia/femore con pinze e le forbici. Metterli in una capsula di Petri con 5 mL 1 x tampone fosfato salino (PBS). Eseguire tutte le procedure in condizioni sterili.
- Tagliato aperto a entrambe le estremità della tibia/femore con una forbice in un cappuccio sterili per coltura. Sciacquare l'osso con un ago da 25 G con PBS + 2% siero bovino fetale (FBS) in una provetta da 15 mL.
- Centrifugare le cellule del midollo osseo a 500 x g, 4 ° C per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in tampone di lisi delle cellule di anima rosse 1ml a lisare globuli rossi (RBC) per meno di 1 min. Diluire immediatamente con 9 mL di PBS 1X. Centrifugare nuovamente come descritto al punto 1.3. Decantare i surnatanti.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di PBS 1X, filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon sterile 40 μm in un'altra provetta da 15 mL per rimuovere detriti cellulari/gruppi. Centrifugare nuovamente come in 1.3. Decantare i surnatanti.
- Risospendere il pellet cellulare in 15 mL Roswell Park Memorial Institute medie (RPMI) 1640 con 5% FBS e 10 μg/mL Gentamicina, piastra che le cellule in un piatto di coltura del tessuto-100mm a 37 o C incubatore per 60 min. Roteare delicatamente il piatto, togliere il galleggiante cellule e contarli.
- Piastra 6 x 10 6 cellule in un piatto di 100 mm con differenziazione media (RPMI 1640 con 5% di FBS e gentamicina 10 μg/mL, mescolato con media condizionati 30% L929 10) del macrofago di 12 mL con 10 dei macrofagi di topo ricombinante ng/mL fattore distimolazione (M-CSF) per 2 giorni.
- Dopo la coltura per 2 giorni in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2, nutrire ogni piatto con del macrofago fresco 6ml differenziazione media con 10 ng/mL M-CSF.
- Il giorno 5, prendere 8 mL di vecchi media fuori senza disturbare le celle e aggiungere del macrofago fresco 10ml differenziazione media con 10 ng/mL M-CSF.
- Il giorno 7, raccogliere i macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) utilizzando un sollevatore cellulare.
Nota: Macrofagi allegati possono essere dissociati con 5 mL 1 mM EDTA in PBS 1X per 5/10 minuti dopo la rimozione delle cellule di galleggiante e lavare la piastra due volte con 5 mL di PBS 1X. Centrifugare le cellule come descritto al punto 1.3., li risospendere in fresco del macrofago differenziazione media e li contano con un emocitometro.- Conferma la BMDMs ' fenotipo da citometria a flusso come descritto 5. Preparare il mouse derivato macrofagi in una certa concentrazione per i seguenti studi.
2. BSA-grassi acido coniugato preparazione
- preparare 2 mM BSA in PBS sterile. Ad esempio, pesare 6,65 g BSA, aggiungere 30 mL di PBS 1X per sciogliere, quindi aggiungere ulteriori PBS fino a 50 mL, ridimensionamento componenti per fare 2 mM BSA in PBS 1X.
- Sale di sodio individuale di 5 mM di preparare degli acidi grassi in 2 mM BSA. Riscaldare a 37 ° C o superiore, se necessario e Sonicare la miscela di 2 mM BSA e sale di sodio degli acidi grassi, fino ad ottenuta una soluzione chiara.
Nota: Rispetto agli acidi grassi insaturi, acidi grassi saturi bisogno di una temperatura più alta e più tempo di sonicazione per dissoluzione. - Filtro la soluzione di grasso-acido-BSA attraverso un 0.22 μm filtro, aliquota in sterile microcentrifuga da 1,5 mL tubes e conservarli a 4 ° C per uso a breve termine o a-20 ° C per la conservazione a lungo termine. Nessuna precipitazione deve essere osservata dopo conservazione a 4 ° C in frigorifero.
3. Saturi acidi grassi inducono delle cellule morte del Mouse del midollo osseo macrofagi derivati
- piastra BMDMs in una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti con 0,4 x 10 6/ml in macrofago differenziazione media.
- Trattare le cellule con la 0.4 mM acido palmitico e acido stearico per 16-24 h in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2. Utilizzare BSA come controllo negativo.
- Raccogliere le cellule con un sollevatore di cella dopo trattamento e selezione verso il basso le cellule a 500 x g, 4 ° C per 5 min.
- Macchia le cellule con Annessina V-Alexa 488 e 7-aminoactinomycin D (7-AAD) in 100 μL Annessina V associazione buffer per 15 min a temperatura ambiente.
- Diluire il campione con 200 µ l di tampone di annessina-associazione, mescolare delicatamente, quindi mantenere i campioni sul ghiaccio dopo il periodo di incubazione.
- Analizzare le cellule marcate più presto di flusso cytometry 5. Annessina V-Alexa 488 viene rilevato nel canale di FITC e 7-AAD è rilevato nel canale PerCP/PerCP-Cy 5.5.
4. Colorazione di Ceramide intracellulare
- dopo trattamento dell'acido grasso, raccogliere le celle come descritto al punto 3.3. Quindi fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 30 min.
- Lavare il campione con 1 mL di PBS 1X, spin giù come passaggio al punto 3.3 e decantare il supernatante.
- Macchia le cellule con l'anticorpo primario anti-ceramide (diluizione 1: 200) in 100 μL 1x permeabilizzazione di tampone per 30 min.
- Lavaggio e spin giù le cellule come al punto 4.2.
- Macchia le cellule con l'anticorpo secondario (diluizione 1: 500) di IgM anti-topo in 100 μL 1x permeabilizzazione di tampone per 30 min.
- Lavaggio e spin giù le cellule come al punto 4.2. Aggiungere 250 μL 1X PBS e analizzare le cellule marcate di flusso cytometry 5.
Nota: Vedere la lista di reagente dettagliate nella tabella di apparecchiature e reagenti.
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Representative Results
L'obesità aumenta le concentrazioni di acidi grassi liberi nel siero. Come fagociti professionali, macrofagi prendono attivamente gli acidi grassi per mantenere l'omeostasi host. Durante questi processi, Overload lipidi possono indurre la morte delle cellule del macrofago. A tal fine, abbiamo coltivato BMDMs in vitro con obesi livelli di acidi grassi dietetici e morte delle cellule del macrofago misurato usando flusso cytometric macchiatura. Rispetto al controllo di BSA, acidi grassi saturi, in particolare acidi stearico, ha indotto la morte significativo delle cellule di BMDMs. le cellule morte sono state indicate come popolazioni positivi doppi macchiati di annessina V e 7-AAD (Figura 1a-b). Della nota, gli acidi grassi insaturi non ha indotto significativi del macrofago cellule morte5. I dati suggeriscono l'effetto tossico di aumento dei livelli di acidi grassi saturi in vivo.
Allo stesso modo, utilizzando una linea cellulare del macrofago cui vitalità era suscettibile di trattamento di acidi palmitici o acidi stearico5, abbiamo trovato che suscettibilità dei macrofagi alla morte cellulare indotta da acido palmitico è stata influenzata anche dal numero di cellule in la cultura (Figura 2a). In poche parole, le stesse condizioni culturali, più macrofagi nei pozzi, il meno morte indotta dagli acidi grassi. Inoltre, la morte cellulare indotta da acido palmitico è stata associata positivamente con accumulati livelli di ceramidi cellulari (Figura 2b). Quando i macrofagi sono stati coltivati in condizioni ad alta densità, medie nutrienti sono state vuotate più velocemente per il metabolismo energetico, queste cellule erano meno suscettibili della morte cellulare indotta da acido palmitico rispetto ai macrofagi coltivati in una condizione di bassa densità. Al contrario, quando le cellule sono state esposte ad una condizione di sostanza nutriente-arricchito (per esempio, obesità), acidi grassi in eccesso possono essere metabolizzati per produrre i ceramidi tossici, portando così alla morte cellulare indotta da acido grasso. Così, condizioni culturali delle cellule possono portare variazione ai risultati della morte cellulare indotta da acido grasso saturo.
Figura 1: alta concentrazione di acidi grassi, soprattutto acidi stearico, indurre la morte delle cellule del macrofago. BMDMs (giorno 7) erano placcato come 0,4 x 106/ml nel fresco del macrofago differenziazione media. Dopo il collegamento delle cellule per 0,5 h-1, BMDMs sono stati trattati con la concentrazione designata di ogni acido grasso per 24 h. Media da solo e BSA sono stati usati come controlli negativi. Dopo il trattamento, le cellule erano sollevate e raccolto, poi filate giù a 500 g per 5 min a 4 ° C. Le cellule sono state colorate con 7-AAD e Annessina V Alexa 488 nel buffer di annessina-associazione 100 μL per 15 min. Quindi aggiungere un altro buffer di annessina-associazione 200 μL di ciascun campione prima dell'analisi di citometria a flusso. (A) dimostrazione di dati di citometria a flusso delle cellule indotte dagli acidi grassi. (B) sintesi della morte cellulare indotta da acidi grassi. Barra di errore rappresenta esempio SD La morte cellulare indotta da acido palmitico (PA) e particolarmente l'acido stearico (SA) è statisticamente significativo rispetto del controllo di BSA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la disponibilità di suscettibilità dei macrofagi di media nutrienti impatti all'acido palmitico ha indotto la morte delle cellule. (A) stato di nutrizione cellulare impatti relativa tolleranza allo stress indotto da acido grasso saturo. (B) la suscettibilità delle cellule all'apoptosi indotta acidi grassi saturi altamente è correlata con i livelli cellulari accumulati di ceramide. Il gradiente di nutrienti di media è stato raggiunto coltivando la linea cellulare del macrofago di tipo selvaggio a 1m, 2m, 4m e 8m (M = 1 x 106) in piastre di petri 6-mm con 6 mL di RPMI 1640 con 5% FBS e 10 μg/mL Gentamicina per 18 h. Il colore di media è più giallo a causa di svuotamento più nutriente quando un numero maggiore di cellule è coltivato nei piatti. Oltre il 90% delle cellule sono ancora altamente praticabile. Le cellule vitali annesso erano sollevate pipettando dopo la seduta in PBS per 5 min e ri-coltivate immediatamente a 0.2x106/ml nei mezzi freschi in piastre da 24 pozzetti. Cellule sono state trattate immediatamente con acido palmitico 0,4 mM per 18 h usando BSA come il controllo per ogni origine (gradiente di nutrienti) delle cellule. Quindi tutte le cellule trattate sono state raccolte e con 7-AAD per morte cellulare o tinto con ceramide intracellulare. Morte cellulare spontanea (7-AAD +) percentuali erano meno di 8,6%. La morte delle cellule specifiche di trattamento è stata stimata come differenza % in 7-AAD + tra trattamento e proprio BSA controllare (a). Il livello di ceramide specifici di trattamento è stato stimato come la differenza di intensità (MFI) media di fluorescenza fra il trattamento ed il proprio controllo di BSA (b). Questo esperimento è stato ripetuto, e vengono presentati dati rappresentativi. Barre di errore rappresentano campione SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La corretta preparazione della soluzione di acido grasso è di importanza critica per studiare la funzione biologica degli acidi grassi. La neutralizzazione degli acidi grassi aumenta la relativa solubilità in soluzione acquosa. Tuttavia, sali di sodio degli acidi grassi, soprattutto acidi grassi saturi, sono ancora di bassa solubilità in acqua o PBS, come abbiamo osservato. Un metodo consiste nell'utilizzare etanolo al 95-100% per aiutare a sciogliere l'acido grasso1. Utilizzando questo metodo, maggiore tossicità per le cellule possono essere osservati anche alle concentrazioni più basse di acidi grassi insaturi meno tossici. Un altro modo per preparare la soluzione di acido grasso è utilizzare metil-β-ciclodestrina come un sistema di consegna in modo che gli acidi grassi hanno condizioni ottimali, rimanendo in soluzione nella loro forma monomerica9,11. Acidi grassi preparati con tale metodo è sembrato avere funzione normale, ma conducendo il metodo è complicato. L'impatto di metil-β-ciclodestrina sulla crescita delle cellule è che ad alta concentrazione potrebbe portare a cellule morte12. Per gli acidi palmitici e stearici saturati, una temperatura elevata (60 oC) viene utilizzata per aiutare con solubilizzazione9.
Poiché l'albumina è una proteina importante acido grasso-associazione nel fluido extracellulare, che aiuta nel trasporto degli acidi grassi nei sistemi linfatici e vascolari, che è favorita come il vettore naturale per lo studio funzionale degli acidi grassi. Per evitare la bassa solubilità dell'acido grasso sale in soluzione acquosa, sonicazione agevolerà notevolmente la coniugazione dell'acido grasso con BSA, così aiutando nella solubilizzazione dell'acido grasso. Ci vuole molto più tempo (ore) per solubilizzare gli acidi grassi saturi, di acidi grassi insaturi (30 min) con la stessa quantità di volume e concentrazione. Anche se riscaldamento e sonicazione sono critici per coniugazione acido grasso-BSA, una temperatura elevata (meno di 50 oC) è suggerito per ottenere chiaro BSA-PA, soluzioni coniugati BSA-SA e a bassa temperatura è fortemente raccomandato per solubilizzanti acidi grassi insaturi a causa della loro suscettibilità all'ossidazione ad alta temperatura. Il rapporto molare di 5:2 di acido grasso a BSA è considerato buono rispetto alla 3:1 o 6:1 rapporto molare che è stato pubblicato7. Questo può garantire meno priva di grassi acido nella soluzione per evitare la tossicità dell'acido grasso sapone. BSA-acidi preparati in questo modo sembrano essere soluzioni stabili (nessuna precipitazione, almeno) a 4 ° C per almeno 3 mesi come indicato nella loro funzionalità sulla morte cellulare del macrofago. Guarnizione del tappo della provetta se preparato gli acidi grassi non sono deve essere utilizzato per un lungo periodo di tempo.
Quando si ottiene una soluzione limpida di acido grasso-BSA in PBS, risultati costanti dal trattamento dell'acido grasso più probabilmente sono garantiti. Tuttavia, macrofagi muoiono di fame e ben nutriti rispondono in modo diverso al trattamento degli acidi grassi, soprattutto acidi grassi saturi. Macrofagi con sostanze nutritive in eccesso sono più sensibili alla morte cellulare indotta da acido grasso saturo di fame o quelli morti di fame perché affamate cellule metabolicamente possono disintossicare gli acidi grassi saturi a causa della loro richiesta di sopravvivenza e crescita. Tale morte cellulare è altamente associato con i livelli di ceramide cellulare accumulato. Della nota, ceramide tossicità si verifica solo quando i livelli intracellulari di ceramide raggiungono una determinata soglia. Per garantire risultati coerenti da macrofagi trattati con acido grassi o qualsiasi altro tipo di cellule, cellule dovrebbero essere coltivate con i mezzi freschi con abbondanti sostanze nutritive. Eventuali condizioni di coltura cellulare sub-ottimale potrebbero causare dati sub-ottimali.
Nel complesso, questi protocolli forniscono le che tanto necessarie particolari per studiare l'impatto degli acidi grassi sui macrofagi da altri laboratori. Rispetto ad altri metodi, questo approccio diretto genera acidi coniugati BSA-grassi senza utilizzare un solvente extra come l'etanolo. Il passo più impegnativo è quello di preparare preciso, stabile soluzione acida BSA-grassi perché sonicazione genera calore ed è difficile per controllare la temperatura. Fortunatamente, gli acidi grassi insaturi sono facili da preparare in breve tempo e rimangono stabili, mentre gli acidi grassi saturi sembrano stare relativamente alte temperature perché sono saturi e resistenti all'ossidazione in tale condizione. Finora, non abbiamo osservato che alcun problema o limitazione con i coniugati acidi grassi BSA preparati in questo modo. Modifica del nostro protocollo sarebbe necessario se sono necessari esperimenti più sensibili.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto parzialmente dai fondi di Start-up Università di Louisville e National Cancer Institute (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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