Summary
우리는 murine 기본 세포 골 수 세포에서 파생 하는 스트레이트-앞으로 방법을 설명 하 고 BSA 지방산을 준비 하는 간단한 방법 변화. 포화 지방산은 대 식 세포 세포 죽음을 일으킬 수 있다 그리고 이러한 세포의 죽음은 확실히 세 라마 이드 레벨의 세포 축적와 관련 다음 설명 합니다.
Abstract
대 식 세포는 매우 상피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질을 표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산, 면역 기능 조절에 중요 한 역할을 수 있습니다. 수많은 연구 다양 한 지방산, 포화 또는 불포화, 세포 성장 및 기능에 다른 영향을 보유. 그러나, 지방산 준비를 위해 사용 하는 방법 다는 비 생리 적인 결과 이어질 수 있습니다. 혈 청 알 부 민, 자연 캐리어 포유류 주변 혈액에서 지방산은 지방산 비누의 독성을 최소화 포유류 세포에서 지방산의 기능을 공부 하 공액 지방산의 나트륨 소금 복잡 한 성형에 대 한 것이 좋습니다. 따라서, 간단 하 고, 상대적으로 빠른 난방 및 메서드 sonicating 개발 이며 BSA 지방 산 성 어원이 형성에 대 한 여기에 제시. 우리는 포화 지방산, 특히 스 테아 르 산 마우스 골 수 유래 세포에 심각한 세포 죽음을 유도 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 더 포화 지방산 유도 된 세포 죽음은 긍정적으로 축적 된 세포 세 라마 이드 수준 연관 보여 줍니다. 이 메서드는 다른 포유류 세포에서 지방산의 영향 연구에 대 한 확장할 수 있습니다.
Introduction
지방산이 에너지 대사에서와 다른 종류의 세포 막 인지질 합성에 중요 한 역할. 지방산은 낮은 수성 가용성이 있다. 지방산의 적절 한 준비는 포유류 세포에서 지방산의 생물 학적 기능을 공부를 위한 중요 한 중요성 이다. 지방산 에탄올 준비가 때 많은 지방산1상대적으로 낮은 농도 에서도 세포 막에 그들의 독성 비누 (세제) 효과 보여줄 수 있습니다. 무료 지방산은 혈 청에 대 한 자연, 주요 전송으로 혈 청 알 부 민 지방산 배달에서 생체 외에서 지방산 기능 분석 실험2,,34에 대 한 좋은 통신사를 간주 됩니다. 그러나, 지방산 및 혈 청 알 부 민 켤레의 준비의 세부 대개 하지 사용할 수 있습니다 지방산을 사용 하 여 많은 연구 논문 출판 되었습니다 비록.
대 식 세포는 매우 표 피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질5,6,,78표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산이 면역 기능을 조절 수 있습니다. 대 식 세포와 다른 세포에 지방산의 영향 연구, 지방산 준비의 다른 방법이 적용된1,,79했다. 지방산은 대 식 세포 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 적절 하 게 준비 된 지방산/혈 청 알 부 민 어원이 같은 말을 사용 하 여 생물학적으로 의미 있는 데이터를 얻기에 중요 한 중요성 이다. 대 식 세포 기능에 지방산의 영향에 대 한 연구는 기본적인 지식 및 대 식 세포 관련 질병에 지방 산 성 대사에 관련 된 잠재적인 치료 표적 제공할 수 있습니다.
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Protocol
프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 루이스 빌 대학에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 골 수 유래 세포 (BMDMs)
- Euthanize CO 2를 사용 하 여 6에 8-주 오래, 건강 한 야생 타입 마우스. 폼 보드로 고정 하 고 그것이 젖 었 때까지 70% 에탄올 스프레이. 집게와가 위 경골/대 퇴 골 뼈를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 5 mL 1와 페 트리 접시에 넣어. 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.
- 오픈는 시저와 경골/대 퇴 골 뼈의 양쪽 끝에서에서 잘라 무 균 조직 문화 후드. 15 mL 튜브에 PBS + 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 25g 바늘 뼈를 플러시.
- 500 x g, 4 ° C 5 분 대에 골 수 세포를 원심
- 미만 1 분 9 mL 1 x PBS 가진 즉시 Dilute 위해 lyse 적혈구 (RBC)를 1 mL 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend. 1.3 단계에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.
- 셀 펠 릿 10 mL 1 x PBS에 resuspend, 세포 파편/덩어리를 제거 하려면 다른 15 mL 튜브에 불 임 40 μ m 나일론 메쉬를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 1.3에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.
- 15 mL 로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 5 %FBS 10 μ g/mL gentamicin, 37 o C 인큐베이터에서 100 m m 조직 문화 접시에 셀 60 분 부드럽게 요리, 소용돌이 대 한 부동 꺼내 접시에 셀 펠 릿 resuspend 세포, 그리고 그들을 계산.
- 10 ng/mL 재조합 마우스 대 식 세포와 미디어 (5 %FBS 30 %L929 바른된 미디어 10 혼합 10 μ g/mL gentamicin RPMI 1640) 차별화 12 mL macrophage 6 x 10 6 셀 100 mm 접시에 접시 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 2 일.
- 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 2 일간 배양 후 각 접시 6 mL 신선한 macrophage 차별화 10 ng/mL M-CSF와 미디어 피드.
- 5 일에 밖으로 오래 된 미디어의 8 mL 셀을 방해 하지 않고 고 추가 10 mL 신선한 macrophage 미디어 10 ng/mL M-CSF와 차별화.
- 셀 기중 장치를 사용 하 여 골 수 유래 세포 (BMDMs) 수확 7 일에.
참고: 연결 된 대 식 세포 수 또한 될 해리 했다 5 mL 1 m m 5 ~ 10 분의 1 x PBS에 EDTA와 float 세포를 제거 하 고 두 번 5 mL 1 x PBS 가진 접시를 세척 후. 1.3 단계에서 세포를 원심., 미디어, 차별 하는 신선한 macrophage에 그들을 resuspend 및는 hemocytometer로 그들을 계산. - 확인은 BMDMs
- ' 표현 형으로 cytometry에 의해 설명 5. 다음과 같은 연구에 대 한 특정 농도에 세포 파생된 마우스 준비.
2. BSA-지방산 산 켤레 준비
- 준비 2mm BSA 살 균 PBS에. 예를 들어 추가 30 mL 1 x PBS를 해산, 6.65 g BSA, 무게 추가 더 많은 PBS 50 mL까지 1 x PBS에 2mm BSA를 만들기 위해 구성 요소를 확장.
- 2mm BSA에에서 지방산의 준비 5mm 개별 나트륨 소금. 필요한 경우, 37 ° C 이상가 열 하 고 명확한 해결책을 얻을 때까지 2mm BSA의 혼합물 및 지방산의 나트륨 염을 sonicate.
참고: 불포화 지방산에 비해, 포화 지방산 필요 더 높은 온도 및 더 많은 쥡니다 시간 해산. - 필터는 0.22 통해 지방-산 성-BSA 솔루션 μ m 필터, 약 수 1.5 mL 메 마른 microcentrifuge에 그것은 튜브, 단기 사용을 위한 4 ° C에 또는 긴 기간 저장을 위해-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 아니 강 수는 냉장고에서 4 ° C에서 저장 후 관찰 해야 합니다.
3. 포화 지방산 유도 세포 죽음의 마우스 골 수 파생 된 세포
- 미디어를 차별화 하는 대 식 세포에 10 6 /mL x 0.4 BMDMs 24-잘 조직 문화 접시에 접시.
- 0.4 m m 팔 미 틴 산 및 스 테아 르 산 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 16 ~ 24 h에 대 한 세포 치료. BSA를 사용 하 여 부정적인 컨트롤로.
- 셀 치료 후 셀 기중을 수확 하 고 500 x g, 5 분에 4 ° C에서 셀 아래로 회전
- Annexin V-알 렉 사 488와 100에서 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 세포를 얼룩이 μ annexin V 바인딩 버퍼 실 온에서 15 분.
- Annexin 바인딩 버퍼의 200 µ L로 샘플을 희석, 부드럽게, 혼합 후 잠복기 후 얼음 샘플을 유지.
- 흐름 cytometry 5 스테인드 셀을 최대한 빨리 분석. FITC 채널에 감지 annexin V-알 렉 사 488와 7 AAD PerCP/PerCP-Cy5.5 채널에서 발견 되.
4. 세포내 세 라마 이드 얼룩
- 지방산 치료 후 수확 단계 3.3 에서처럼 셀. 다음 30 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 셀 수정
- 1 mL 1 x PBS와 샘플을 세척, 스핀 다운로 3.3에 고는 상쾌한 가만히 따르다.
- 30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 셀 안티-세 라마 이드 1 차적인 항 체 (1: 200 희석)을 얼룩
- 세척 및 스핀 아래로 단계 4.2에서 다시 셀.
- 반대로 마우스 IgM 이차 항 체 (1: 500 희석)와 세포 30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 얼룩
- 세척 및 스핀 다운 단계 4.2에서 다시 셀. 250 μ 1 x PBS를 추가 하 고 교류 cytometry 5 스테인드 세포 분석.
: 참고 장비 및 시 약의 테이블의 자세한 시 약 목록.
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Representative Results
비만에 혈 청 자유로운 지방산 농도 증가합니다. 전문 식 세포로 세포 적극적으로 차지 지방산 호스트 항상성 유지를 합니다. 이 프로세스 동안 오버 로드 된 지질 대 식 세포 세포 죽음을 유도 수 있습니다. 이 위해, 우리는 BMDMs에서 체 외에 식이 지방산 및 흐름 cytometric 얼룩을 사용 하 여 측정 된 대 식 세포 세포 죽음의 비만 수준으로 교양. BSA 제어, 포화 지방산에 비해 특히 스 테아 르 산, 유도 BMDMs. 죽은 세포 Annexin V와 7-AAD (그림 1a-b) 스테인드 이중 긍정적인 채우기로 표시 했다 중요 한 세포 죽음. 메모의 불포화 지방산은 상당한 대 식 세포 세포 죽음5을 유도 하지 않았다. 데이터는 vivo에서무료 포화 지방산의 증가 수준의 독성 효과 제안합니다.
마찬가지로, 사용 하 여 대 식 세포 세포 라인의 생존 능력은 팔 미 틴 산 스 테아 르 산5의 처리에 취약, 우리 발견 팔 미트 산 유도 된 세포 죽음 세포의 민감성은 셀 수에 의해 또한 영향을 문화 (그림 2a)입니다. 간단히 말하면, 동일한 문화적 조건 하에서 우물, 지방산에 의해 유도 된 적은 세포 죽음에서에서 더 많은 세포. 또한, 팔 미트 산 유도 된 세포 죽음 세포 ceramides (그림 2b)의 누적된 레벨에 긍정적으로 연관 되었다. 대 식 세포는 고밀도 상태에서 교양 있었다 때 중간 영양소는 에너지 대사에 대 한 빨리 소모 했다, 이러한 셀 팔 미트 산 유도 된 세포 죽음 저밀도 조건에서 배양 세포에 비해 적습니다. 대조적으로, 세포는 영양소 농축 상태 (예를 들어, 비만)에 노출 됐다 때 초과 지방산 지방산 유도 된 세포 죽음을 선도 함으로써 독성 ceramides를 생산 하 대사 수 있습니다. 따라서, 셀 문화 조건 포화 지방산 유도 된 세포 죽음의 결과에 변화를 가져올 수 있습니다.
그림 1: 대 식 세포 세포 죽음을 유도 하는 지방산, 특히 스 테아 르 산의 높은 농도. BMDMs (7 일) 미디어를 차별화 하는 신선한 macrophage에 106/mL x 0.4로 도금 되었다. 0.5-1 h, BMDMs에 대 한 셀 첨부 후 24 h. 혼자 미디어와 BSA 부정적인 컨트롤 사용에 대 한 각 지방산의 지정 된 농도로 치료 했다. 치료 후, 셀 해제 및 수확 후 4 ° c.에서 5 분 동안 500 g에서 스핀 다운 셀은 15 분 동안 100 μ annexin 바인딩 버퍼에 7 AAD와 Annexin V 알 렉 사 488 스테인드 했다. 교류 cytometry 분석 하기 전에 각 샘플에 또 다른 200 μ annexin 바인딩 버퍼를 추가 합니다. (A) 지방산에 의해 유도 된 세포의 흐름 cytometry 데이터의 시범. (B) 지방산에 의해 유도 된 세포 죽음의 요약. 오차 막대를 나타내는 샘플 sd. 팔 미트 산 (PA)에 의해 유도 된 세포 죽음 그리고 특히 스 테아 르 산 (SA) 통계적으로 중요 한 BSA 컨트롤에 비해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 세포 죽음을 유도 하는 팔 미트 산 미디어 영양소 영향 세포의 민감성의 가용성. (A) 포화 지방산 유도 스트레스를 관용 셀 영양 상태에 미치는 영향. (B) 셀 민감성 포화 지방산 유도 된 세포 죽음에 세 라마 이드의 축적 된 세포 수준 높은 상관 이다. 미디어 영양소 그라데이션 1 M, 2 M, 4 M와 6 mL 5%와 RPMI 1640와 6 mm 페 트리 접시에서 8 M (M = 1 x 106)에서 야생 유형 대 식 세포 세포 라인을 경작 하 여 달성 되었다 FBS와 10 μ g/mL gentamicin 18 시간. 셀 더 많은 요리에서 교양 때 미디어 색상 더 영양소 고갈으로 인해 더 노란색 이다. 세포의 90% 이상 높은 가능한 지금도. 첨부 가능한 셀 PBS에 5 분 동안 앉아 후 pipetting으로 해제 되었고 다시 즉시 0.2x106/mL 24-잘 접시에 신선한 미디어에서에서 경작. 세포는 0.4 m m 팔 미 틴 산 BSA를 사용 하 여 셀의 각 소스 (영양소 그라데이션)를 제어 하는 18 h에 대 한 즉시 치료 했다. 다음 모든 치료 세포 수확 하 고 세포 죽음에 대 한 7-AAD와 스테인드 또는 세포내 세 라마 이드와 스테인드. 자연 스러운 세포 죽음 (7-AAD +) 비율 8.6% 미만 했다. 치료 특정 세포 죽음 7에서 % 차이 추정 되었다-AAD + 치료 및 자체 BSA 사이 제어 (a). 치료 특정 세 라마 이드 수준 평균 형광 강도 (MFI)와 차이 치료 자체 BSA 제어 (b)으로 추정 되었다. 이 실험은 반복 하 고 대표적인 데이터 표시 됩니다. 오차 막대를 나타내는 샘플 sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
지방 산 성 해결책의 적절 한 준비는 지방산의 생물학적 기능 연구에 중요 한 중요성의 이다. 지방산의 중립화 수성 해결책에 있는 그것의 가용성을 증가 시킵니다. 그러나, 특히 포화 지방산, 지방산의 나트륨 염 우리가 관찰 물 또는 PBS에서 낮은 용 해도의 여전히 있습니다. 한 가지 방법은 지방산1해산 있도록 95-100% 에탄올을 사용 하는. 이 메서드를 사용 하 여 셀에 높은 독성 적은 독성 불포화 지방산에 대 한 낮은 농도 에서도 관찰 될 수 있습니다. 지방 산 성 솔루션을 준비 하는 또 다른 방법은 지방산이 최적의 조건, 그들의 단위체 양식9,11솔루션에 남아 있는 메 틸-β-cyclodextrin 배달 시스템으로 활용 하는 것입니다. 같은 방법으로 준비 하는 지방산은 정상적인 기능, 나타나지만 메서드를 수행 하는 것은 복잡. 메 틸-β-cyclodextrin 세포 성장에 미치는 영향은 높은 농도 세포 죽음12이어질 수 있습니다. 포화 stearic와 틴 산, 높은 온도 (60 oC) 가용 화9수 있도록 사용 됩니다.
혈 청 알 부 민 림프 및 혈관 시스템에 지방산을 운반에서 에이즈, extracellular 액체에 주요 지방산 의무적인 단백질은 지방산의 기능 연구에 대 한 자연 매체로 선호 합니다. 지방산의 낮은 용 해도 피하기 위해 수성 해결책에서 소금 쥡니다 크게 촉진 한다 따라서 지방산 가용 화에 은닉 하는 BSA와 지방산의 활용. 그것은 같은 양의 볼륨 및 농도 solubilize 포화 지방산 보다는 불포화 지방산 (30 분)을 훨씬 더 (시간)을 걸립니다. BSA-SA 어원이 솔루션, 그리고 낮은 온도 하는 것 좋습니다 solubilizing 얻는 명확한 BSA PA에 대 한 높은 온도 (50 미만 oC) 제안 난방 및 쥡니다 BSA 지방 산 활용에 대 한 중요 한 있지만, 높은 온도에서 산화에 그들의 민감성 때문에 불포화 지방산이 BSA에 지방산의 어 금 니 비율을 5:2 3: 1에 비해 좋은 여겨진다 또는 6:1 어 금 니 비율7출판. 이 적은 완전히 무료 지방산 지방산 비누의 독성을 피하기 위해 솔루션을 보장할 수 있습니다. BSA-지방산이이 방법 준비 나타납니다 안정적인 솔루션 (아무 강 수 이상) 대 식 세포 세포 죽음에 그들의 기능에서와 같이 3 개월 이상 4 ° C에서. 인감 지방산을 준비 하는 경우 튜브의 캡 시간의 긴 기간 동안 사용 하지 않습니다.
PBS의 BSA 지방산의 명확한 솔루션을 가져올 때 지방산 치료에서 일관 된 결과 보증 더 많은 가능성이 있다. 그러나, 굶주린 고 잘 먹이 세포 지방산 치료, 특히 포화 지방산에 매우 다르게 응답. 과잉 영양분을 세포 배 보다 포화 지방산 유도 된 세포 죽음에 더 취약 하거나 없고 세포 그들의 생존과 성장 요청으로 인해 포화 지방산을 독 metabolically 수 있기 때문에 그들을 굶 어. 이러한 세포의 죽음은 매우 축적 된 세포 세 라마 이드 수준 연관 된다. 노트, 세 라마 이드 독성 세포내 세 라마 이드 수준의 특정 임계값을 도달 하는 때에 발생 합니다. 지방산 처리 대 식 세포 또는 세포의 다른 종류에서 일관 된 결과 보장 하기 위해, 셀 풍부한 영양소와 함께 신선한 미디어와 함께 배양 한다. 최적의 셀 문화 조건을 최적의 데이터 발생할 수 있습니다.
전반적으로,이 프로토콜은 많이 다른 실험실에 의해 세포에 지방산의 영향을 공부에 대 한 세부 정보를 필요한 제공 합니다. 다른 방법에 비해, 직접 이렇게 에탄올 같은 외 용 제를 사용 하지 않고 BSA 지방 산 성 어원이 같은 말을 생성 합니다. 정확 하 게, 준비 하는 가장 어려운 단계 쥡니다 열을 생성 하 고 그것은 어렵다-제어 온도 때문에 BSA 지방 산 성 솔루션을 안정. 다행히도, 불포화 지방산은 짧은 시간에 준비 하 고 포화 지방산 포화와 같은 조건에서 산화에 저항 때문에 상대적으로 높은 온도 서 서 나타나는 동안, 유지 하기 쉽다. 지금까지, 우리 어떤 문제 또는 한계 BSA 지방 산 성 어원이 같은 말 준비이 이렇게 관찰 하지 했습니다. 우리의 프로토콜의 수정 더 민감한 실험 필요 하다 면 필요한 것입니다.
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Disclosures
저자는 금융 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품 루이빌 대학 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 하 고 국립 암 연구소 (베 데스 다, 메릴랜드) R01CA177679, R01CA180986를 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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