Summary
Ilustramos um método direto para derivar murino macrófagos primários de células da medula óssea e um método simples para preparar o ácido graxo-BSA conjuga. Em seguida, demonstraremos que ácidos graxos saturados pode induzir a morte celular de macrófagos, e essa morte celular é positivamente associado com o acúmulo celular de ceramida níveis.
Abstract
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa proteína ligadora de ácidos graxos. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados, o que pode desempenhar um papel crítico na regulação de suas funções imunológicas. Numerosos estudos têm demonstrado que vários ácidos graxos saturados ou insaturado, podem possuir diferentes impactos sobre o crescimento celular e função. No entanto, variam as abordagens utilizadas para preparação de ácidos graxos, que pode conduzir a resultados não-fisiológica. Albumina de soro, um portador natural de ácidos graxos no sangue periférico dos mamíferos, é recomendada para formando um conjugado complexo com o sal de sódio de ácidos graxos para estudar a função do ácido graxo em células de mamíferos, minimizando assim a toxicidade do sabão de ácidos graxos. Assim, um simples, relativamente rápido aquecimento e sonicating método é desenvolvido e apresentado aqui para formação de conjugado ácida graxos BSA. Descreveremos um protocolo utilizando ácidos graxos saturados, especialmente os ácidos esteárico para induzir a morte celular grave em macrófagos derivado de medula óssea de rato. Mais demonstramos que a morte celular induzida por ácido graxo saturado é positivamente associada com níveis de ceramida celular acumulada. Esse método pode ser estendido para estudos do impacto do ácido graxo em outras células de mamíferos.
Introduction
Ácidos gordos desempenham um papel fundamental no metabolismo energético e na síntese de fosfolipídios da membrana em diferentes tipos de células. Ácidos graxos tem uma baixa solubilidade na água. Preparação adequada dos ácidos graxos é de importância crítica para estudar as funções biológicas de ácidos graxos em células de mamíferos. Quando os ácidos graxos são preparados com etanol, muitos ácidos graxos podem mostrar seu efeito tóxico sabão (detergente) na membrana celular, mesmo em concentrações relativamente baixas1. Como um transportador de ácidos graxos livres no soro natural, major, albumina de soro é considerada uma boa operadora para ácidos graxos entrega em vitro para ácidos graxos função ensaios2,3,4. No entanto, os detalhes da preparação do conjugado de ácido graxo e albumina geralmente não estão disponíveis mesmo que muitos trabalhos de pesquisa usando ácidos graxos têm sido publicados.
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa ácido graxo-ligação proteína5,6,7,8. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados que podem regular suas funções imunológicas. Para estudar o impacto dos ácidos graxos em macrófagos e outras células, diferentes métodos de preparação de ácidos graxos foram aplicadas1,7,9. Usar o ácido graxo adequadamente preparados/soro albumina conjugados para investigar o impacto dos ácidos graxos na função de macrófagos é de fundamental importância na obtenção de dados biologicamente significativos. Estudos sobre o impacto dos ácidos graxos na função do macrófago podem fornecer conhecimentos básicos e alvos terapêuticos relacionados com o metabolismo de ácidos graxos em macrófago envolvendo doenças.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
o protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Louisville e institucional Cuidado Animal.
1. macrófagos derivados do Mouse da medula óssea (BMDMs)
- Euthanize um mouse de 6 a 8 semanas de idade, saudável tipo selvagem usando CO 2. Fixá-lo até uma placa de espuma e pulverizá-la com 70% de etanol até que esteja encharcada. Remova os ossos fêmur/tíbia com pinças e tesouras. Colocá-los em um tubo de ensaio com 5 mL 1 x tampão fosfato salino (PBS). Executar todos os procedimentos sob condições estéreis.
- Abrir ambas as extremidades do osso fêmur/tíbia com uma tesoura numa vizinhança de cultura de tecido estéril. Limpar o osso com uma agulha 25g com PBS + 2% de soro fetal bovino (FBS) em um tubo de 15 mL.
- Centrifugar as células de medula óssea em 500 x g, 4 ° C por 5 min.
- Ressuspender as células em tampão de lise de células vermelhas do sangue de 1 mL para lisar os glóbulos vermelhos (RBC) para menos de 1 min. dilua imediatamente com 9 mL 1X PBS. Centrifugue novamente como na etapa 1.3. Decantar os sobrenadantes.
- Ressuspender as células em 10 mL 1X PBS, filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon estéril 40 μm em outro tubo de 15 mL para remover detritos/aglomerados de células. Centrifugue novamente como em 1.3. Decantar os sobrenadantes.
- Ressuspender as células em 15 mL de Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI 1640) com 5% FBS e 10 gentamicina μg/mL, placa, que as células em um prato de cultura de tecidos de 100mm no 37 o C incubadora para 60 min. Agite suavemente o prato, retire o flutuante células e contá-los.
- Placa 6 x 10 6 células em um prato de 100 mm com macrófagos 12ml diferenciando mídia (RPMI 1640 com 5% FBS e gentamicina 10 μg/mL, misturado com 30% L929 condicionado media 10) com macrófagos de rato recombinante 10 ng/mL fator colônia-estimulando (M-CSF) por 2 dias.
- Após cultivo para 2 dias em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2, alimentar cada prato com macrófagos fresco 6ml, diferenciando a mídia com M-CSF de 10 ng/mL.
- No dia 5, pegue 8 mL da velha mídia fora sem perturbar as células e adicione macrófago fresco 10ml, diferenciando a mídia com M-CSF de 10 ng/mL.
- No dia 7, colher os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) usando um levantador de célula.
Nota: Os macrófagos anexados também podem ser dissociados com 5 mL, 1 mM EDTA em 1X PBS durante 5 a 10 min após a remoção das células de flutuador e lavar a placa duas vezes com 5 mL 1X PBS. Centrifugar as células como na etapa 1.3. ressuspendê-los no macrófago fresco diferenciando mídia e contá-las com um hemocytometer.- Confirmar os BMDMs ' fenótipo por citometria de fluxo como descrito 5. Preparar o mouse derivado de macrófagos em uma certa concentração para os estudos seguintes.
2. BSA-graxos ácido conjugado preparação
- preparar 2mm BSA em PBS estéril. Por exemplo, pesar g 6,65 BSA, adicionar 30 mL 1X PBS para dissolver, em seguida, adicione mais PBS até 50 mL, dimensionamento de componentes para fazer 2 mM BSA em 1X PBS.
- Prepare sal de sódio individuais 5mm de ácidos graxos em 2mm BSA. Aqueça a 37 ° C ou superior, se necessário e proceda à sonicação a mistura de 2 mM BSA e sal de sódio de ácidos graxos, até à obtenção de uma solução clara.
Nota: Em comparação com ácidos graxos insaturados, ácidos graxos saturados precisa de uma temperatura mais elevada e mais uma vez sonication para dissolver-se. - Filtrar a solução graxos-ácido-BSA através um 0,22 μm filtro, alíquota em 1,5 mL estéril microcentrifuga tubos e armazená-los em 4 ° C, para uso de curto prazo ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo. Nenhuma precipitação deve ser observada após armazenagem a 4 ° C, na geladeira.
3. Saturado de ácidos graxos induzir célula morte do Mouse medula óssea derivada macrófagos
- os BMDMs em uma placa de cultura de tecido de 24-poço da placa com 0.4 x 10 6 /mL no macrófago diferenciando mídia.
- Tratar as células com a 0,4 mM o ácido palmítico e ácido esteárico para 16 a 24 h em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2. Use o BSA como controlo negativo.
- Colher as células com um tirante de célula após o tratamento e spin para baixo as células a 500 x g, 4 ° C por 5 min.
- Mancha as células com anexina V-Alexa 488 e D aminoactinomycin-7 (7-AAD) em 100 μL anexina tampão de ligação V durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Diluir a amostra com 200 µ l de tampão de ligação anexina, misture delicadamente e, em seguida, manter as amostras no gelo após o período de incubação.
- Analisar as células coradas logo que possível por citometria de fluxo 5. Anexina V-Alexa 488 é detectado no canal FITC e 7-AAD é detectado no canal PerCP/PerCP-Cy5.5.
4. Coloracao intracelular de ceramida
- após o tratamento de ácido graxo, colhem as células como na etapa 3.3. Em seguida, corrigir as células em paraformaldeído 4% durante 30 min.
- Lavar a amostra com 1 mL 1X PBS, spin para baixo como passo em 3.3 e decante o sobrenadante.
- Manchar as células com anticorpo primário anticeramida (diluição de 1: 200) em 100 buffer de permeabilização de 1x μL de 30 min.
- Lavagem e a centrifugação para baixo as células novamente como na etapa 4.2.
- Manchar as células com anticorpo secundário de anti-rato IgM (diluição 1: 500) em 100 buffer de permeabilização de 1x μL de 30 min.
- Lavagem e a centrifugação para baixo as células novamente como na etapa 4.2. Adicionar 250 μL 1X PBS e analisar as células manchadas por citometria de fluxo 5.
Nota: Consulte a lista de reagente detalhadas na tabela de equipamentos e reagentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Obesidade aumenta as concentrações de ácidos graxos livres no soro. Como fagócitos profissionais, macrófagos ativamente ocupam ácidos graxos para manter a homeostase do anfitrião. Durante estes processos, lipídios sobrecarregados podem induzir a morte celular de macrófagos. Para este fim, nós cultivadas BMDMs em vitro com obesos níveis de dietética de ácidos graxos e a morte celular de macrófagos medido usando fluxo cytometric coloração. Comparado com o controle de BSA, ácidos gordos saturados, nomeadamente ácidos esteárico, induzido morte celular significativa de BMDMs. células mortas foram mostradas como duplas positivas populações manchadas pela anexina V e 7-AAD (Figura 1a-b). Digno de nota, ácidos graxos insaturados não induzir significativas macrófago célula morte5. Os dados sugerem que o efeito tóxico do aumento dos níveis de ácidos graxos saturados livres na vivo.
Da mesma forma, usando uma linha de celular de macrófagos cuja viabilidade era suscetível ao tratamento de Ácidos palmítico ou ácidos esteárico5, encontramos que a susceptibilidade dos macrófagos para morte celular induzida por ácido palmítico também foi afetada pelo número de células em a cultura (Figura 2a). Basta colocar, nas mesmas condições culturais, os macrófagos mais em poços, a menos morte celular induzida por ácidos gordos. Além disso, a morte celular induzida por ácido palmítico foi positivamente associada com níveis acumulados de ceramidas celulares (Figura 2b). Quando os macrófagos foram cultivados em uma condição de alta densidade, nutrientes médios foram esgotados mais rápido para o metabolismo energético, estas células foram menos suscetíveis à morte celular induzida por ácido palmítico comparado aos macrófagos cultivados em uma condição de baixa densidade. Em contraste, quando as células foram expostas a uma condição enriquecido em nutrientes (por exemplo, obesidade), excesso de ácidos graxos pode ser metabolizados para produzir ceramidas tóxicas, desse modo, levando à morte celular induzida por ácido graxo. Assim, as condições culturais do celular podem trazer variação aos resultados da morte celular induzida por ácidos graxos saturados.
Figura 1: alta concentração de ácidos graxos, especialmente os ácidos esteárico, induzir a morte celular de macrófagos. BMDMs (dia 7) foram banhados como 0.4 x 106/mL no macrófago fresco, diferenciando a mídia. Após a fixação da célula para 0,5 h-1, BMDMs foram tratados com a concentração designada de cada ácido graxo 24 h. mídia sozinha e BSA foram utilizados como controles negativos. Após o tratamento, as células foram levantadas colhidas, e girou para baixo a 500 g por 5 min a 4 ° C. As células foram coradas com 7-AAD e anexina V Alexa 488 no buffer de vinculação anexina 100 μL por 15 min. Em seguida, adicione outra reserva de vinculação anexina 200 μL de cada amostra antes da análise de citometria de fluxo. (A) demonstração dos dados de citometria de fluxo das células induzidas por ácidos graxos. (B) Resumo da morte celular induzida por ácidos graxos. Barra de erro representa amostra SD A morte celular induzida por ácido palmítico (PA), e particularmente o ácido esteárico (SA) é estatisticamente significativo em relação do controle de BSA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A disponibilidade de susceptibilidade dos macrófagos do mídia nutrientes impactos ao ácido palmítico induziu a morte celular. (A) status de nutrição celular impacta sua tolerância ao estresse induzido por ácido graxo saturado. (B) susceptibilidade celular para morte celular induzida de saturados ácidos graxos é altamente correlacionada com níveis celulares acumulados de ceramida. O gradiente de nutrientes de mídia foi conseguido a linha de celular de macrófagos do tipo selvagem em 1m, 2m, 4m e 8m (M = 1 x 106) em pratos de petri-6mm com 6 mL de RPMI 1640 com 5% de cultivo FBS e 10 μg/mL gentamicina para 18 hr. A cor da mídia é mais amarela devido à falta de mais nutriente quando um número maior de células é cultivado nos pratos. Mais de 90% das células são ainda altamente viável. As células viáveis anexadas foram levantadas pela pipetagem depois sentado em PBS por 5 min e re-cultivadas imediatamente em 0.2x106/mL em mídia fresca em placas de 24 poços. As células foram tratadas imediatamente com ácido palmítico de 0.4 mM para 18 h usando BSA como o controle de cada fonte (gradiente de nutrientes) das células. Então todas as células tratadas foram colhidas e manchadas com 7-AAD para morte celular ou manchadas com ceramida intracelular. Morte celular espontânea (7-AAD +) percentagens foram menos de 8,6%. Morte de célula específica do tratamento foi estimado como a diferença de % no 7-AAD + entre tratamento e sua própria BSA controlar (a). O nível de ceramida específica do tratamento foi estimado como a diferença de intensidade (IFM) média de fluorescência entre o tratamento e seu próprio controle de BSA (b). Este experimento foi repetido, e dados representativos são apresentados. Barra de erro representa amostra SD. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A adequada preparação da solução de ácido graxo é de importância crítica para estudar a função biológica dos ácidos graxos. A neutralização do ácido graxo aumenta sua solubilidade em solução aquosa. Entretanto, sais de sódio de ácidos graxos, especialmente ácidos graxos saturados, são ainda de baixa solubilidade em água ou em PBS, como observamos. Um método é usar etanol 95 a 100% para ajudar a dissolver o ácido graxo1. Usando esse método, maior toxicidade às células pode ser observada mesmo em concentrações inferiores para menos tóxicos ácidos graxos insaturados. Outra maneira de preparar a solução de ácido graxo é utilizar o metil-β-ciclodextrina como um sistema de entrega para que os ácidos graxos têm condições ideais, permanecendo na solução na sua forma monomérica9,11. Ácidos graxos preparados com tal método parecia ter função normal, mas conduzir o método é complicado. O impacto de metil-β-ciclodextrina em crescimento celular é que a alta concentração pode levar à morte12de célula. Para Ácidos palmítico e esteárico saturados, de alta temperatura (60 oC) é usada para ajudar com solubilização9.
Desde que a albumina é uma proteína ligadora de ácidos graxos principal no fluido extracelular, que auxilia no transporte dos ácidos graxos nos sistemas linfáticos e vasculares, ele é favorecido como o portador natural para o estudo funcional dos ácidos graxos. Para evitar a baixa solubilidade do ácido graxo sal em solução aquosa, sonication vai facilitar grandemente a conjugação do ácido graxo com BSA, auxiliando assim na solubilização de ácido graxo. Demora muito mais tempo (horas) para solubilizar os ácidos graxos saturados do que os ácidos graxos insaturados (30 min) com a mesma quantidade de volume e concentração. Embora o aquecimento e sonication são críticas para a conjugação de ácido graxos BSA, de alta temperatura (menos de 50 oC) é sugerido para obtenção clara BSA-PA, soluções conjugadas BSA-SA e uma baixa temperatura é fortemente recomendado para solubilizing ácidos graxos insaturados, devido à sua susceptibilidade à oxidação a alta temperatura. A relação de 5:2 molar de ácido graxo de BSA é considerado bom em comparação com o 3:1 ou 6:1 relação molar que foi publicado a7. Isso pode garantir menos ácidos graxos totalmente livre na solução para evitar a toxicidade do sabão de ácidos graxos. Ácidos graxos BSA preparados desta forma parecem ser soluções estáveis (sem precipitação, pelo menos) a 4 ° C, durante pelo menos 3 meses conforme sua funcionalidade na morte celular de macrófagos. Selo da tampa do tubo se preparado ácidos graxos não é deve ser utilizado por um longo período de tempo.
Quando é obtida uma solução clara de ácido graxos BSA em PBS, resultados consistentes de tratamento ácido graxo mais provável são garantidos. No entanto, macrófagos com fome e bem alimentados respondem de maneira bem diferente para o tratamento de ácidos graxos, especialmente os ácidos graxos saturados. Macrófagos com excesso de nutrientes são mais suscetíveis à morte celular induzida por ácidos graxos saturados do que morrer de fome ou faminto queridos porque faminta células metabolicamente podem desintoxicar os ácidos graxos saturados, devido a sua solicitação de sobrevivência e crescimento. Tal morte celular está altamente associado com níveis de ceramida celular acumulada. Digno de nota, ceramida toxicidade ocorre apenas quando os níveis intracelulares de ceramida ao limite. Para garantir resultados consistentes de macrófagos Tratado de ácido graxo ou qualquer outro tipo de células, as células devem ser cultivadas com mídia fresca com nutrientes abundantes. Quaisquer condições de cultura celular sub-ótimo podem resultar em dados abaixo do ideal.
Em geral, esses protocolos fornecem que muito necessária detalhes para estudar o impacto dos ácidos graxos em macrófagos por outros laboratórios. Em comparação com outros métodos, esta abordagem direta gera conjugados ácidos graxos BSA sem usar um solvente extra como o etanol. A etapa mais desafiadora é preparar precisos, estável a solução de ácido graxos BSA porque sonication gera calor e é difícil controlar a temperatura. Felizmente, ácidos graxos insaturados são fáceis de preparar em um curto espaço de tempo e permanecer estável, enquanto ácidos graxos saturados parecem estar relativamente altas temperaturas porque eles estão saturados e resistente à oxidação em tal condição. Até agora, não observamos que qualquer problema ou limitação com conjugados de ácido graxos BSA preparado desta forma. Modificação do nosso protocolo seria necessária se as experiências mais sensíveis são necessários.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesses financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado parcialmente pelos fundos de start-up de Universidade de Louisville e Instituto Nacional de câncer (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
