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Neuroscience

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Abstract

Strommesstechnik Aufnahme der Zellen ausgesetzt osmotischen Schock zeigen, dass die sekretorische Zellen auf dieser physischen Stress zu reagieren, durch die Reduzierung der Exozytose-Aktivität und die Menge der Neurotransmitter aus Vesikeln im einzigen Exozytose Veranstaltungen veröffentlicht. Es wurde vermutet, dass der Rückgang der Neurotransmitter ausgestoßen aufgrund von Änderungen in Membran Biophysikalische Eigenschaften, ist wenn Zellen als Reaktion auf osmotischen Stress schrumpfen und mit Annahmen, die sekretorischen Vesikel in das Zytoplasma der Zelle sind nicht betroffen durch extrazelluläre osmotischen Stress. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose überwacht, was aus den Zellen im Moment losgelassen wird, den ein Vesikels verschmilzt mit der Plasmamembran, den aber enthält keine Angaben über den Inhalt des Vesikels bevor die Fusion der Vesikel ausgelöst wird. Daher, durch die Kombination strommesstechnik Aufnahme mit anderen ergänzenden analytischen Methoden, die sind in der Lage, die Charakterisierung der sekretorischen Vesikel, bevor Exozytose an Zellen ausgelöst wird bietet einen umfassenderen Überblick für die Prüfung wie sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess werden durch osmotischen Schock betroffen. Wir beschreiben hier, wie ergänzend strommesstechnik Aufnahme mit intrazellulären elektrochemische Zytometrie und Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung kann verwendet werden, um Änderungen im sekretorischen Vesikel Größe und Neurotransmitter an charakterisieren chromaffin Zellen im Zusammenhang mit Exozytose Tätigkeit vor und nach der Exposition auf osmotischen Stress. Durch die Verknüpfung der quantitative Erkenntnisse aus Experimenten mit allen drei analytische Methoden, wurden Schlussfolgerungen zuvor gemacht, dass sekretorischen Vesikel auf extrazelluläre osmotischen Stress reagieren, indem in der Größe schrumpfen und die Vesikel Quanten Größe zu reduzieren behalten Sie eine konstante Vesikel Neurotransmitter Konzentration. Daher gibt das einige Klarstellungen hinsichtlich warum Vesikel, in Reaktion auf osmotischen Stress die Menge Neurotransmitter bei Freigabe Exozytose freigesetzt reduzieren. Die konduktometrische Aufnahmen hier zeigen, dass dies ist ein reversibler Prozess und das telson, nachdem osmotischen Schock mit Neurotransmittern aufgefüllt werden, wenn die gesetzten Zellen in einer isotonischen Umgebung rückgängig gemacht werden.

Introduction

Chromaffin Zellen in Nebennieren sind neuroendokrine Zellen, die Neurotransmitter-Moleküle in die Blutbahn abgeben. Dies geschieht durch ein zellulärer Prozess, bei dem das Andocken, und die Verschmelzung von Neurotransmitter gefüllten Vesikel, was Inhalt Auflösung von Vesikeln in den extrazellulären Raum in einem Prozess namens Exozytose. Die Neurotransmitter (Adrenalin und Noradrenalin) in chromaffin Zellen werden aktiv von Membranproteinen in großen dichten Kern Vesikel (LDCVs) transportiert und bei hohen Konzentrationen (~0.5-1 M)1,2gespeichert. Ansammlung von Neurotransmittern im Inneren der LDCVs geschieht durch die Affinität von Katecholamin-Moleküle zu den intravesicular Rumpfkern Protein-Matrix bestehend aus Chromogranin Proteine (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, und ein intravesicular cocktail Lösung mit Schlüsselkomponenten für Katecholamin-Verladung und Lagerung in die Blase wie ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in der Lösung und ~ 40 mM verpflichtet, die Protein-Matrix)8Mg2 + (5 mM)9, Ascorbat (10-30 mM)10und einem pH-Wert von ~5.511,12. Die LDCVs pflegen einen Iso-osmotischen Zustand der Zelle Zytoplasma (310 mOsm/kg)13, obwohl die theoretische gelöste Konzentration in den Vesikeln Summe bis zu mehr als 750 mM. Die Zusammensetzung der einzelnen intravesicular ist nicht nur wichtig für die Verladung und Lagerung Katecholamine, sondern auch für die Aggregation von gelösten Stoffen, dichten Kern-Protein-Matrix. Dies reduziert die Osmolarität der Vesikel wird deutlich reduziert und beeinflussen die Menge Katecholamin, die während der Exozytose5,6freigegeben wird.

Studien über die Wirkung des extrazellulären osmotischen Drucks auf die Exozytose von amperometrischen Aufnahme haben berichtet, dass hoher extrazellulärer osmotischer Druck hemmt Exozytose Aktivität und reduziert die Anzahl der Neurotransmitter abgesondert von einzelnen Vesikel Fächer4,14,15,16,17,18,19. Die Erklärungen dieser Beobachtungen haben auf die mögliche Verbesserung der makromolekularen Engstand in der Zelle Zytoplasma hemmende Vesikel Fusion Events und eine Veränderung in der Membran Biophysikalische Eigenschaften beeinflussen die Anzahl der spekuliert. Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt. Diese Gedanken angenommen hohen extrazellulären osmotischen Stress beeinflusst nicht die Vesikel Quanten Größe, bestimmt die Anzahl der Neurotransmitter-Moleküle gespeichert in einem Vesikel-Fach in vorherige Phase der getriggerten Exozytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in konduktometrische Messungen der Exozytose Freisetzung in Einzelzellen, eine Kohlefaser-Scheibe Mikroelektrode steht in engem Kontakt mit der Zelloberfläche, erstellen eine experimentelle Einrichtung imitiert die Synapse-Konfiguration, wo der amperometrischen Elektrode dient als ein postsynaptisches Detektor (Abbildung 1)22,23. Durch die Stimulierung einer Zelle, Exozytose, kann ein Neurotransmitter gefüllten Vesikel verschmelzen mit der Plasmamembran der Zelle und lassen teilweise oder volle Blase Inhalt in den extrazellulären Raum auslösen. Diese Neurotransmitter-Moleküle an der Oberfläche der Elektrode veröffentlicht können elektrochemisch erkannt werden, wenn die Neurotransmitter elektroaktive (z.B. Katecholamine) sind durch die Anwendung ein Redoxpotential von 700 mV Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode . Daher eine Reihe von Stromspitzen markieren die Erkennung der einzelnen Exozytose Ereignisse. Vom aktuellen versus Zeit Spur in einer amperometrischen Aufnahme die Anbaufläche jedes einzelnen amperometrischen Spike stellt die Ladung pro Exozytose Ereignis erkannt und der Maulwurf von Neurotransmittern freigegeben, unter Verwendung der Gleichung Faraday konvertiert werden kann. Daher die konduktometrische Aufnahmen liefern quantitative Informationen über die Menge Neurotransmitter aus einzelnen Exozytose Veranstaltungen vertrieben und Berichten über die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse, sondern präsentieren keine quantitative Informationen über die sekretorischen Vesikel Inhalte vor der Fusion der Vesikel und Neurotransmitter-Freisetzung wurde eingeleitet.

Daher, um ein besseres Verständnis der wie sekretorischen Vesikel in der Zelle Zytoplasma reagieren auf extrazelluläre osmotischen Stress bevor die Zelle ausgelöst wird, um zu unterziehen, Exozytose, andere ergänzende analytische Methoden verwendet werden können, um diese Informationen zu bereichern. Zum Beispiel um zu untersuchen, ob osmotischen Stress Vesikel Volumen ändert, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) bildgebende Analyse lässt sich die Vesikelgröße der Zellen nach chemischen Fixierung zu messen. Um zu untersuchen ob osmotischen Stress Quanten Vesikelgröße betrifft, eine neu entwickelte amperometrischen Technik namens intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgebracht werden, für die Quantifizierung der Vesikel Neurotransmitter Inhalt an sekretorischen Vesikel in ihrer nativen Zustand noch im Zytoplasma der lebenden Zellen26wohnhaft. In der intrazellulären elektrochemische Zytometrie-Technik eine Nanotip zylindrischen Kohlefaser-Elektrode sanft das Zytoplasma von lebenden Zellen und durch die Anwendung einer + 700 mV Potenzial an dieser Elektrode eingefügt (Vs Ag/AgCl Referenz Elektrode), die Katecholamin-Inhalte in Vesikeln quantifiziert werden kann, durch den Nachweis einer Redox Stromspitze aus einzelnen Bläschen kollidieren, adsorbierenden, und anschließend stochastisch Brechung an der Elektrodenoberfläche und damit deren Inhalt gegen die Freigabe der Elektrode Oberfläche26. Daher in der amperometrischen aktuelle versus Zeit Spur, jedes einzelne Vesikel zerreißendes Ereignis kann dazu führen, dass eine aktuelle transiente und, durch die Integration von Bereich des jeweils aktuellen Spike, kann Quanten Vesikelgröße mit Faraday´s Gesetz berechnet werden.

Daher kann durch die Verknüpfung der quantitativen Informationen gewonnenen Vesikel Größenmessungen mit TEM Bildgebung Vesikel Quanten Größe und analysiert, wie von intrazellulären elektrochemische Zytometrie aufgezeichnet, Vesikel Neurotransmitter Konzentration auch werden Sie bestimmt. Dies ermöglicht Vesikel Charakterisierung, wenn Zellen unterschiedliche osmotische Bedingungen ausgesetzt sind und bietet eine bessere Sicht wie Bläschen auf extrazelluläre osmotischen Stress in der Phase vor der Exozytose reagieren können. Die Ergebnisse aus der Kombination dieser Methods haben gezeigt, dass im Beisein von extrazellulären hohen osmotischen Druck, Bläschen schrumpfen und passen Sie ihre Quanten Größe und Vergleich der quantitative Informationen über die relativen Veränderungen dieser Messungen, dass zeigt beim schrumpfen anzupassen Vesikel ihre Inhalt und Größe weiterhin eine konstante Neurotransmitter Konzentration24. Somit ist dieses Verständnis wertvolle im Anschluss an die Bemerkungen über Neurotransmitter-Freisetzung in Zellen osmotischen Stress ausgesetzt. In diesen Protokollen beschreiben wir die Verwendung dieser drei komplementäre Methoden, mit denen die Charakterisierung der wie sekretorischen Vesikel in ihrer natürlichen Umgebung reagieren extrazellulären Osmolalität und die Auswirkungen dieser Reaktion auf die Exozytose Prozesses. Zusätzlich zu unseren bisherigen Beobachtungen über die Wirkung der hohen osmotischen Druck auf Exozytose24präsentieren wir weitere Experimente, die Zelle Erholung nach osmotischen Schock und die Wirkung von mehreren Barium Stimulationen in chromaffin beschreiben Zellen.

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Protocol

(1) Zellkultur Bovine Chromaffin Zellen durch enzymatische Verdauung von Nebennieren isoliert

  1. Um chromaffin Zellen gesammelt aus bovine Nebennieren zu isolieren, Sterilisieren Sie Zellen mit 70 % Ethanol-Lösung. Trim entfernt Fett- und Bindegewebe mit einem Skalpell. Um Blut zu entfernen, spülen Sie die Nebennieren Venen mit Lockes Lösung (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3,6 mM, Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) 5,6 mM bei pH 7,4), die handlich auf 37 ° C.
  2. Um das Gewebe zu verdauen, jede Drüse durch die Injektion von etwa 2,5 mL warmen steril filtriert 0,2 % Kollagenase P Lösung durch die Nebennieren Vene mit einer Spritze aufblasen und das Gewebe für 20 min bei 37 ° c inkubieren Untersuchen Sie die Drüsen um sicherzustellen, dass die Verdauung der Medulla abgeschlossen ist. Das Gewebe sollte weich und nicht angespannt fühlen.
  3. Sammeln der verdauten Medulla schnippeln aus den Drüsen in Längsrichtung. Zerkleinere die Medulla Gewebe mit einem Skalpell. Die Gewebe-Suspension über ein Stahl Sieb filtern und verdünnen mit Lockes Lösung für ca. 50 mL Volumen reduzieren die Aktivität der Kollagenbildung P.
  4. Pellet-Zellen bei 300 X g in einer Zentrifuge für 10 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie in 50 mL sterile Reagenzgläser. Wieder auszusetzen Sie das erhaltene Pellet in 20 mL Lockes Lösung und Filtern Sie die Lösung über eine sterile 100 µm-Nylon-Netzgewebe in Tuben zu.
  5. Mischen Sie die chromaffin Zellsuspension mit sterilen Percoll (1:1) und Zentrifugieren Sie die Zelle Lösung bei 18.600 x g für 20 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die oberste Schicht der Dichtegradient und Filtern Sie die Lösung über einen 100 µm-Nylon-Netzgewebe in Tuben.
  6. Um Percoll auszuschließen, verdünnen Sie die Zellsuspension mit Lockes Lösung und Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei Raumtemperatur vor Aussetzung wieder das Pellet in Lockes Lösung. Die geschätzte Zelldichte der isolierten Zellsuspension ist etwa 4 Millionen Zellen/mL.
  7. Für die Aufnahme der amperometrischen Exozytose und intrazellulären Zytometrie Messungen, Platte chromaffin Zellen Kollagen IV beschichtet 60 mm Plastikschalen bei einer Dichte von etwa 17,5 × 103 Zellen/cm2 und inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C in 5 % CO2 Umgebung. Innerhalb von 1-3 Tagen Zellkultur durchführen Sie die elektrochemische Experimente.
  8. Für die TEM imaging Experimente, Platte chromaffin Zellen in 75 cm2 Zellkulturflaschen bei einer Dichte von 7 Millionen Zellen pro Flasche und Inkubation bei 37 ° C in einer 5 % CO2 Umgebung für 1 Tag.

(2) einzelne Zelle Exozytose strommesstechnik Experimente24

  1. Um Kohlefaser Mikroelektroden für diese Experimente zu fabrizieren, nehmen Sie ein Glas Kapillare mit einem äußeren Durchmesser geeignet für den Elektrodenhalter Stadium der Kopf, der in diesen Experimenten verwendet wird. Verwenden Sie eine Borosilikat-Glas-Kapillare mit einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm und einem Innendurchmesser von 0,69 mm.
    1. Schließen Sie eines der Kapillaren enden an ein Wasserrohr streben. Platz 5 µm Durchmesser Carbonfasern auf so etwas wie ein weißes Blatt Papier, um die Visualisierung zu verbessern.
    2. Identifizieren einer einzigen Carbon-Faser und die Faser an einem Ende mit einem Finger die Carbonfaser in Position zu halten, während das offene Ende der Kapillare in der Nähe das freie Ende der Carbon-Faser Positionierung gedrückt halten. Sanft Aspirieren der Carbon-Faser in der Kapillare Glas so, dass die Carbonfaser durch beide Enden der Kapillare herausragt. Die Aspiration Kraft wegziehen.
  2. Legen Sie die Kapillare mit der Carbon-Faser in einer Mikropipette Puller und ziehen Sie das Glas in zwei separaten Glas Pipettenspitzen Kapillare. Um die Carbonfaser zu trennen, die zwischen den beiden Spitzen verbunden ist, verwenden Sie eine Schere schneiden die Carbonfaser und zwei Kohlefaser Mikroelektroden gewinnen.
  3. Legen Sie unter dem Mikroskop die Carbonfaser auf einen dickeren Objektträger, der ermöglicht manuelles Schneiden von Carbon-Fasern am Rand wo die Faser aus der Kapillare Glasbeschichtung mit einem Skalpell auszudehnen ist.
  4. Nach dem Schneiden der Carbon-Faser, ein Trinkgeld Glas beschichtete Kohlefaser, stecken Sie ein paar mm der Elektrodenspitze eine Epoxy-Lösung für 10 min Epoxy hochziehen und jede möglich Freifläche zwischen der Kohlefaser und dem umliegenden Glas zu versiegeln. Heben Sie die Elektroden langsam aus der Epoxy-Lösung zu verhindern, dass sperrige Leim Tropfen an der Spitze der Elektrode bildet.
  5. Platzieren Sie die Elektroden auf einem Halter (z.B. eine flache Holzstab) mit zweiseitigen hitzebeständiges Klebeband an die Elektroden angeschlossen werden können. Backen Sie die Epoxy behandelt Elektroden über Nacht im Ofen bei 100 ° C. Die Elektrode Spitzen leicht brechen, wenn sie mit einer Oberfläche in Kontakt kommen so sichern die Elektroden werden immer sicher aufbewahrt, mit einem Halter, wo die Elektroden sind fixiert und Tipps riskieren nicht berührt wird.
  6. Um eine flache Scheibe Elektrodenoberfläche zu erhalten, stellen Sie die Elektrode in die Halterung von einem Microgrinder und jeder Kohlefaser-Elektrode ein Winkel von 45° abgeschrägt. Markieren Sie nach abschrägen die Kapillare auf seiner Oberseite mit einem Permanentmarker später wissen, wie man der Elektrodenoberfläche Disk in einem 45 °-Winkel zu lokalisieren, wenn die Elektrode in der Nähe von Zellen für die Exozytose Messung zu platzieren.
    Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, wie diese Experimente, die ovale Scheibe Elektrode muss flach auf Zellen mit seiner Oberfläche Parallel zur Oberfläche der Petrischale gelegt werden. Darüber hinaus erfolgen abschrägen Elektroden am selben Tag als Experimente um einen frischen und sauberen Elektrodenoberfläche zu gewährleisten.
  7. Vor dem Gebrauch legen Sie jedes Kohlefaser Mikroelektrode in eine Testlösung (z.B. 0,1 mM Dopamin in PBS-Puffer (pH 7,4)) zur Überwachung der aktuellen mit zyklischer Voltammetrie Steady-State. Ein zyklischer Voltammetrie Scan beantragen eine mögliche Dreieck-Wellenform von -0,2 V bis 0,8 V Vs Ag/AgCl-Referenzelektrode auf 100 mV/s, um sicherzustellen, dass gute Reaktionskinetik Daten stammen, sind im Einvernehmen mit theoretisch berechneten Werte für eine 5 µm Durchmesser Scheibe Kohlefaser-Mikroelektrode25.
  8. Strommesstechnik Aufnahme der Exozytose, legen Sie die Petrischale mit kultivierten chromaffin Zellen auf einem inversen Mikroskop. Es ist wichtig, das Mikroskop eingerichtet mit einem Faraday-Käfig, elektronisches Rauschen bei der Aufnahme durch die sehr kleine Ströme zu messenden strommesstechnik zu beseitigen zu schützen. Verwenden Sie Mikroskop Heizung Bühne eine Temperatur von 37 ° C in der Zellexperimente weiterhin.
  9. Ein geräuscharmer Patch Clamp Instrument zu verwenden, um eine konstante Potential von 700 anzuwenden mV an der Arbeitselektrode im Vergleich zu einer Ag/AgCl-Referenzelektrode, die auch in der Petrischale abseits der Arbeitselektrode platziert wird. Digitalisieren Sie für Aufnahme Exozytose von chromaffin Zellen das Signal bei 10 kHz zu und wenden Sie einen internen Tiefpass Bessel-Filter bei 2kHz, das aufgezeichnete Signal zu filtern.
  10. Konduktometrische Aufnahme bei einzelnen Zellen ausführen, montieren Sie die frisch abgeschrägte und erprobten Kohlefaser Scheibe Mikroelektrode in den Elektrodenhalter der Kopf Bühne, die mit dem Potentiostaten verwendet wird.
    1. Sanft legen Sie die Elektrode mit der flachen ovalen Scheibe Form Elektrode Oberfläche nach unten in Richtung die apikale Oberfläche der Zelle und die Elektrode in Kontakt mit der Zellmembran mit einem Mikromanipulator.
    2. Stellen Sie den Abstand von der Elektrode in die Zelle durch die Überwachung der Zelle Verformung durch die Elektrode nach der Platzierung auf der Zellmembran und dann vorsichtig Einfahren der Elektrode zu einer Entfernung, wo die Zelle eine Form in der Nähe von seiner ursprünglichen Zellform gewinnt . Ideal für kinetische und quantitative Erfassung ist ein dünner Flüssigkeitsfilm von hundert Nanometern, die Elektrode und Zelle Oberfläche zu trennen erstellen, die ähnliche Bedingungen für postsynaptischen Detektion von chemischen Freigabe in einer Synapse.
  11. Um die Zellen zu Exozytose anzuregen, positionieren Sie ein Glas Mikropipette mit eine Größe von 2-3 µm Durchmesser, gefüllt mit 5 mM BaCl2 Lösung in einem Abstand von mindestens 20 µm von der Zelle, um zu verhindern, dass jede Lösung Austritt aus der Pipettenspitze Einfluss auf die experimentieren und anwenden einer 5 s Injektion Puls 5 mm BaCl2 Lösung an der Zelloberfläche, die Zelle Exozytose zu stimulieren.
  12. Um die reversiblen Auswirkungen des osmotischen Drucks auf die Exozytose Prozess untersuchen, bereiten eine isotonische Pufferlösung (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 5 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4) mit 310 mOsm/kg Iso-osmotischen Druck und einer hypertonen Puffer gemacht durch die Anpassung der NaCl-Konzentration der isotonische Pufferlösung mit einer Osmolalität 730 mOsm/kg entspricht.
  13. Legen Sie die Zellen in der isotonischen Puffer und stimulieren Sie die Zelle Exozytose durch die Anwendung eines Barium-Injektion-Puls während der Aufnahme der amperometrischen aktuelle Transienten während der eingeleiteten Exozytose Tätigkeit für ca. 3 min zu.
    1. Um die Exozytose Antworten in isotonischen Bedingungen auf Hypertone Bedingungen vergleichen, brüten Sie die Zellen für 10 min in hypertonen Pufferlösung und danach gelten Sie Barium Injektion Impuls zur Stimulierung Exozytose und 3 min amperometrischen Aufnahme durchführen.
    2. Für die reversible Reaktion der Zellen, Zellen wieder für 10 min. in isotonische Pufferlösung brüten und stimulieren die Zellen durch die Anwendung eines 5 s Barium Injektion Puls und 3 min zur Aufzeichnung der Antwort Exozytose aus der Zelle führen.
  14. Wie Experimente, die Wirkung auf die Exozytose Aktivität durch mehrere Barium Stimulationen durchführen eine amperometrischen Aufnahme der Exozytose Release von drei aufeinander folgenden BaCl2 Stimulationen auf der gleichen Zelle platziert in isotonischen Puffer und verwenden die gleiche Zeit-Protokoll für die aufeinander folgenden Zelle Inkubation Experimente mit verschiedenen Osmolarität.

(3) intrazellulären elektrochemische Zytometrie24,26

  1. Um die Elektroden für die Vesikel Quanten Größenmessungen fabrizieren, verwenden Sie die gleichen Materialien und bereiten Sie eine 5 µm im Durchmesser Kohlefaser-Elektrode entsprechend den Beschreibungen in den Abschnitten 2.1 und 2.2 der Mikroelektrode Fabrikation für amperometrischen Exozytose Messungen.
  2. Verwenden Sie unter dem Mikroskop ein Skalpell zum Schneiden der Kohlefaser erweitern aus der Glas-Spitze, so dass eine Carbon-Faser mit einer Länge von 30 bis 100 µm heben sich aus der Glas-Tipp.
  3. Verwenden Sie zur Vorbereitung eines Flamme geätzten Tipp der Kohlefaser-Elektrode eine Butan-Flamme. Um eine gleichmäßig geätzt zu erreichen, zylindrisch geformten Elektrodenspitze, halten die zylindrisch geformten Kohlefaser-Elektrode beim drehen es und legen Sie die Kohlefaser-Verlängerung aus dem Glas in den blauen Rand der Flamme Butan bis die Spitze des Kohlenstoffs ein rotes entwickelt Farbe. Dies dauert oft weniger als 2 s. Wenn dies gelingt, führt dies zu einer geätzten Elektrode Tipp Größe von 50-100 nm im Durchmesser (REM-Aufnahme von solchen Tipp zeigt Abbildung 5B). Legen Sie nach Flamme Ätzen die Elektrode unter dem Mikroskop, die Elektrodenspitze zu bewerten.
  4. Einsetzen Sie die zylindrischen Nanotip Mikroelektrode in Epoxy-Lösung für 3 min, gefolgt von einer 15 s Eintauchen der Elektrodenspitze in einer Aceton-Lösung. Dies ermöglicht Epoxy versiegeln den potenzielle Lücke Raum zwischen der Carbon-Faser und die isolierende Kapillare Glaswand, während das Aceton das Epoxidharz aus der geätzten Kohlefaser Elektrodenoberfläche löscht. Um das Epoxidharz zu heilen, Backen Sie die Elektroden im Ofen über Nacht bei 100 ° C.
  5. Vor Gebrauch testen die Steady-State Strom von jedem Kohlefaser Mikroelektrode, wie in Abschnitt 2.7 erläutert mit zyklischer Voltammetrie. Für Experimente, verwenden Sie Elektroden, die ein Plateau rund um aktuelle Anzeigen nur 1,5-2,5 nA27.
  6. Legen Sie für interzelluläre strommesstechnik Messungen die Zellen unter dem Mikroskop, wie in 2.8 beschrieben und verwenden Sie die gleichen experimentellen Einstellungen Potentiostaten wie in 2,9 beschrieben.
  7. Intrazelluläre amperometrischen Messung durchführen, und setzen um erheblichen Sachbeschädigungen an der Zelle zu verhindern die Nanotip zylindrischen Mikroelektrode in die Zelle durch Zugabe von eine sanften mechanischen erzwingen, gerade genug, um die Elektrode durch das Zellplasma zu schieben Membran und in der Zelle Zytoplasma mit einem Mikromanipulator.
  8. Nach dem Einlegen und mit der Zellmembran versiegelt um die zylindrische Elektrode starten Sie die amperometrischen Aufnahme an Ort und Stelle bei live Cell. Bei der Oxidation potenzielle gilt, für die Elektrode, Vesikel werden an der Elektrodenoberfläche adsorbieren und stochastisch Bruch.  Daher gibt es keine Notwendigkeit für jede Art von Anregung, diesen Prozess zu initiieren.
  9. Um die osmotische Wirkung auf Quanten Vesikelgröße ermitteln, sammeln Sie die intrazelluläre Zytometrie Messungen aus einer Gruppe von Zellen, die in isotonischen und hypertonen Puffer über die Versuchsbedingung wie beschrieben im Abschnitt 2.13 inkubiert worden.

(4) Datenanalyse strommesstechnik Aufnahmen

  1. Um die aufgezeichneten strommesstechnik Daten aus Exozytose und intrazellulären Vesikel Quanten Größe Analyse analysieren, nutzen Sie eine Software, die Analyse der aktuellen Transienten in der aufgenommene Strom versus Zeit Spur also das kinetische ermöglicht Peak-Parameter und die integrierte Gesamtladung für individuelle Stromspitzen kann bestimmt werden. Für die Datenanalyse haben wir in der Sulzer-Labor, das für die Daten-Analyse-Programm, Igor28 geschrieben wurdeentwickelte Software eingesetzt.
  2. Bei der Analyse der amperometrischen Spitzen, wählen Sie einen Grenzwert für die Gipfel der drei Mal Root-Mean Square (RMS) Standardabweichung des Rauschens für jede Aufnahme.
  3. Sammle die konduktometrische Spikes von jeder Zelle-Aufzeichnung manuell, um zu verhindern, dass falsche Stacheln, die nicht die Gaußsche Form folgen, Spitzen, die das Ergebnis der zusammengeführten Exozytose Ereignisse, und akzeptieren nur "glockenförmig" geformte Spitzen mit einem Schwellenwert von drei Mal zu verdoppeln höher als die RMS-Lärm.
  4. Sammeln die Daten für die gesamte Ladung pro einzelne amperometrischen peak und Faradays Gesetz (N = QnF) zur Berechnung der molaren Menge an Katecholamin Neurotransmitter pro Exozytose oder intrazellulären einzelne Vesikel Bruch Veranstaltung, wo N die Maulwürfe von ist erkannt Neurotransmitter, die durch eine Redoxreaktion an der Elektrodenoberfläche, Q = die gesamte Ladung erkannt unter jede Spitze, n = Anzahl der Elektronen in der Redoxreaktion übertragen (n = 2 für Katecholamine), und die Faraday´s-konstante F = 96485 C/Mol.
  5. Führen Sie statistische Auswertung der erhobenen Daten durch die erste Berechnung der durchschnittlichen Gebühren pro Ereignis für jede Zelle erkannt. Anschließend Varianz zwischen den Zellen, berechnen Sie die durchschnittliche Gebühr zwischen Zellen und verwenden Sie ein Student t-Test zwischen Zellen vorausgesetzt, ungleiche Varianz. Diese Studie verwendete das MATLAB-Programm zur statistischen Auswertung.

(5) TEM Bildgebung für die Vesikel Größe Analyse

  1. Um TEM Bildgebung der Zellen an die unterschiedlichen osmotischen Bedingungen durchzuführen, zunächst inkubieren Sie Zellen in isotonische oder Hypertone Puffer für 10 min bei 37 ° C in einer 5 % CO2 Umgebung vor chemischen Fixierung der Zellen.
  2. Führen Sie Zelle Fixierung mit Karnovsky Fixativ Methode29. Mit dieser Methode inkubieren Sie die Zellen mit einer Lösung mit 0,01 % Natriumazid, 1 % Formaldehyd und 1,25 % Glutaraldehyd, in denen die Probe bei 4 ° c gelagert werden können
  3. Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen mit 0,15 M Natrium Cacodylate Puffer.
  4. Zu die Zelle färben Proben post Fixierung und in Vorbereitung auf TEM imaging, die Zellen mit einer 1 % Osmium ausgefällt Lösung für 2 h bei 4 ° C, gefolgt von 1 h Inkubation in 0,5 %-Uranyl-Acetat-Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  5. In einem abschließenden Fixierung Schritt Entwässern Sie die Zellen zunächst durch die Zellen in 100 % igem Ethanol spülen und dann spülen Sie Zellen mit Aceton ab.
  6. Betten Sie die Zellproben in Epoxyharz ein und danach durchführen Sie Zentrifugation bei 4.000 x g für 30-40 min und erlauben Sie die Zellprobe polymerisieren bei 40 ° C für 15 h, gefolgt von 48 h Inkubation bei 60 ° C.
  7. In Vorbereitung für die Bildgebung, Abschnitt die Zellprobe eingebettet in Agar 100 Harz in Scheiben mit einer Dicke von 60 nm mit einer regungsloses.
  8. Vorbehaltlich der Zellen zu einer 4 % Uranyl acetate/25% Ethanol Lösung für 4 min, gefolgt von 20 s der Spülung mit Wasser. Waschen Sie die Zellen mit Reynolds Blei Citrat für 3 min, gefolgt von 20 s der Spülung mit Wasser.
  9. Durchführen Sie Getriebe-Elektronenmikroskopie-Bildgebung von Zellproben. In unseren Experimenten habe wir eine Transmissions-Elektronenmikroskop in Betrieb war bei 120 kV.
  10. Aus jedem aufgenommenen Bild einer Zelle Abschnitt illustriert die Zelle Ultrastruktur, die eine Bevölkerung der Vesikel in die Zelle Zytoplasma zeigt zuerst kalibrieren Pixel Bildgröße von im Zusammenhang mit der aufgezeichneten Maßstabsbalken in jedem TEM Bild Pixel. Verwenden Sie imaging-Software, um die Vesikel Größen bei jedem Bild der Zellen isotonische oder Hypertone Bedingungen ausgesetzt zu bestimmen. In unseren Experimenten verwendeten wir die Software ImageJ zur Bildanalyse. Es ist erwähnenswert, dass für Bildanalyse von zellulären Ultrastruktur von TEM-Aufnahmen von Zellen, Größenanpassung dieser Messungen anhand der Dicke der Zellteile muss berücksichtigt werden und wurden zuvor von Almers´s Lab30beschrieben.

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Representative Results

Wir beschreiben hier das Protokoll, für wie kombinieren TEM Bildgebung zusammen mit zwei elektrochemische Methoden, Kohlefaser-strommesstechnik und intrazellulären elektrochemische Zytometrie, Auskunft geben kann, die eine breitere Sicht in Anspielung auf die Wirkung der gewinnt extrazelluläre osmotischen Druck auf die sekretorischen Vesikel und Exozytose Prozess. Vergleicht man repräsentative amperometrischen Aufnahmen der Exozytose Release auf einzelne chromaffin Zellen mit der experimentellen eingerichtet (in Abbildung 1dargestellt), war eine signifikante Reduktion steht Aktivität angezeigt, wenn Zellen osmotische ausgesetzt waren betonen Sie im Vergleich zu Zellen in isotonischen Bedingungen (Abbildung 2A)24. Aus diesen Aufnahmen und Faraday´s Recht, die gesamte Ladung erkannt durch jeden einzelnen amperometrischen aktuelle Spike wurde zur Berechnung der Anzahl der Moleküle aus einzelnen Vesikel Exozytose Veranstaltungen an Zellen, die verschiedene vertrieben osmotische Bedingungen. Im Vergleich dazu, wie in Abbildung 2 b durch die kleinere Fläche von der durchschnittlichen amperometrischen aktuelle angezeigt röntgenologisch Spike Zellen in hypertonen Lösung weniger Neurotransmitter-Moleküle aus jedem Vesikel durch Fernerkundung osmotischen Stress24 Zellen entlassen wurden .

Um festzustellen, die Reversibilität dieses Rückgangs der Zahl der Neurotransmitter-Moleküle veröffentlicht, führten wir amperometrischen Aufnahmen der Exozytose an Zellen einer hypertonen Umgebung ausgesetzt und anschließend auf Zellen nach zurück in eine isotonische platziert Umgebung. In diesen Experimenten wurden chromaffin Zellen stimuliert dreimal hintereinander mit BaCl Lösung2 : zuerst in einem isotonischen Puffer, gefolgt von einer zweiten Stimulation nach 10 min in einer hypertonen Lösung und schließlich eine dritte Zellen inkubiert wurden Stimulation nach 10 min Zelle Inkubation in isotonischen Bedingungen. Die Ergebnisse präsentieren wie in Abbildung 3A angezeigt, dass die Menge der Neurotransmitter freigesetzt um ~ 50 % reduziert wurde, wenn Zellen der hypertonen Zustand im Vergleich zu der ersten Ba2 + Stimulation in der isotonischen Zustand ausgesetzt waren. Anschließend, wenn Zellen wurden zu einer isotonischen Umgebung zurückgebracht und ein Drittel Ba2 + Stimulation, die Menge Neurotransmitter pro Exozytose Ereignis veröffentlicht kehrte sich wieder auf den ursprünglichen Betrag in die erste Anregung aufgenommen, bisherigen Beobachtungen14bestätigt. Experimente mit drei aufeinanderfolgenden Ba2 + Stimulationen der Zellen in der isotonischen Zustand zeigen (siehe Abb. 3 b), dass mehrere sequenzielle Ba2 + Stimulationen in isotonischen Bedingungen die Menge Neurotransmitter nicht verändert bei Exozytose freigesetzt. Dies deutet darauf hin, dass Vesikel Quanten Größe schnell und reversibel mit extrazellulären Osmolarität angepasst wird.

Bei der Analyse der amperometrischen Spuren aus diesen Experimenten in Bezug auf Exozytose Aktivität wurde jedoch deutlich, wie in Abbildung 4Aangezeigt, diese Exozytose Tätigkeit war wesentlich beeinträchtigt, wenn Zellen hypertonen Stress ausgesetzt waren. Während der osmotischen Stress wurden Exozytose Veranstaltungen auf 12 % der Aktivität auf Zellen in einem isotonischen Zustand reduziert. Anschließend, nachdem die osmotischen Schock und Zellen wieder in ein isosmotic Umfeld platziert wurden, gewann Zellen 41 % ihrer ursprünglichen Exozytose Tätigkeit. Interessanterweise trat die Experimente in isotonische Bedingungen zeigten, wie in Abbildung 4 b, angezeigt, dass nach der Durchführung von drei aufeinander folgenden BaCl2 Stimulationen, die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse auf 53 % nach einer zweiten Stimulation reduziert wurde und weiter bis zu 26 % durch die dritte Stimulation im Vergleich zu der ersten Stimulation. Daher ist es klar, dass in Folge Ba2 + Stimulationen nicht Einfluss auf die Anzahl von Neurotransmittern losgelassen aus jedem Vesikel Exozytose wird ausgelöst scheinen, sondern beeinflusst wesentlich die Effizienz der Vesikel Freigabe.

Untersuchen wie sekretorischen Vesikel in ihrer natürlichen Umgebung von extrazellulären osmotischen Stress Vesikel volumenmäßig betroffen sind oder Quanten Größe, Vesikel Größe Analyse mit TEM Bildgebung wurde kombiniert mit intrazellulären elektrochemische Zytometrie an Zellen Isotonische und hypertonen Bedingungen ausgesetzt. In den intrazellulären elektrochemische Zytometrie Experimenten wurde eine Kohlefaser-Nanotip Elektrode eingefügt Zytoplasma der lebenden chromaffin Zellen wenn in isotonischen und hypertonen Lösung gelegt (wie in Abbildung 5gezeigt). Die daraus resultierende amperometrischen Stromspitze wurde von jedem Vesikel in die Zelle Zytoplasma kollidieren, adsorbierenden, stochastisch bersten und Freigabe der Vesikel-Inhalt an der Oberfläche der amperometrischen Elektrode auf platzen26überwacht. Die integrierte Gesamtladung für jede Spitze in der aktuellen versus Zeit Spur erkannt wurde verwendet, um die durchschnittliche Vesikel Quanten Größe in jeder Zelle Aufnahme gesetzlich Faraday´s zu berechnen. Diese intrazellulären elektrochemische Zytometrie Messungen, siehe Abbildung 6 und Abbildung 7 b, gezeigt, dass Quanten Vesikelgröße in Zellen, die osmotischen Stress ausgesetzt waren deutlich reduziert im Vergleich zu Zellen in isotonischen Bedingungen. Vergleicht man das Ausmaß der Veränderung in Quanten Vesikelgröße gemessen am intrazellulären elektrochemische Zytometrie, der gebrochene Rückgang die Menge der Neurotransmitter freigesetzt Exozytose an Zellen, die extrazelluläre osmotischen Stress erleben , zeigte eine relative Abnahme von 60 % in Quanten Größe und die Menge Neurotransmitter freigesetzt im Vergleich zu Zellen in isotonischen Bedingungen (Abbildung 7)24. Um die Anpassung der Quanten Vesikelgröße beziehen sich auf eine mögliche Variation in Vesikel Neurotransmitter Konzentration von Zellen, die osmotischen Druck zu erleben, war TEM-Bild-Analyse durchgeführt, um die Vesikelgröße der Zellen, isotonische und hypertonen bestimmen Bedingungen. Darüber hinaus wurde die dunkle Färbung der Rumpfkern Proteinmatrix innerhalb der LDCVs, die in den TEM Bildern visualisiert wird, wie eine dunkle Kugel in der Membran Vesikel gebunden verwendet, um das Volumen der Rumpfkern Matrix in diesen Vesikeln zu messen. Wie in Abbildung 8dargestellt, reduzierte Vesikelgröße auf 60 % bei Zellen, die extrazelluläre osmotischen Stress im Vergleich zu Zellen in isotonischen Bedingungen ausgesetzt. Aus der berechneten Volumen der gemessene Durchmesser der LDCV und der dichten Kern ergibt, dass das Volumen der umgebenden Lösung Halo wie eine klare Lösung innerhalb der LDCVs in die TEM-Bilder auch berechnet wurde. Die zusammengefassten Ergebnisse aus der TEM-Bildanalyse zeigte, wie in Abbildung 8dargestellt, dass während der extrazellulären osmotischen Schock ist es vor allem das Volumen der Halo-Lösung in die LDCVs, die24reduziert.

Figure 1
Abbildung 1 : Einzelne Zelle Exozytose strommesstechnik. Eine schematische Darstellung der experimentelle Einrichtung für amperometrischen Messung der Exozytose an einzelne chromaffin Zellen24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: konduktometrische Spuren von Exozytose Messungen.  (A) A repräsentative amperometrischen Aufnahme der Exozytose an chromaffin Zellen in isotonische (schwarze Farbe) und in extrazellulären Umgebungen hypertonen (rote Farbe). (B) Erweiterung der eine durchschnittliche amperometrischen Spike aus Exozytose Messung von chromaffin Zellen in isotonische (schwarz) und hypertonen (rot) extrazelluläre Umgebungen24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Die Reversibilität der Anzahl der Katecholamine nach osmotischen Schock bei Exozytose freigesetzt. (A) die Anzahl der Moleküle bei Exozytose aus chromaffin Zellen freigesetzt (n = 4) von drei aufeinander folgenden Ba2 + Stimulationen, die erste Anregung in isotonische, der zweite in hypertonen, und die dritte in isotonischen Puffer. Die statistischen Ergebnisse des ungepaarten t-Tests werden angezeigt. Der p -Wert für den Vergleich der ersten Ba2 + Stimulation (Ba2 + Stim 1) in isotonischen Puffer mit der zweiten Ba2 + Stimulation (Ba2 + Stim 2) in hypertonen Puffer ist p= 0.1088 und p-Wert für der Vergleich der zweiten Ba2 + Stimulation in hypertonen Lösung mit der dritten Ba2 + Stimulation (Ba2 + Stim 3) in isotonischen Puffer ist p = 0,059. (B) Kontrollexperiment zeigt die Anzahl der Neurotransmitter-Moleküle, die an drei aufeinander folgenden Ba2 + Stimulationen chromaffin Zellen freigegeben (n = 4) in isotonischen Puffer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Die Wirkung des osmotischen Drucks auf die Exozytose Aktivität. (A) die Wirkung der extrazellulären Osmolarität auf Exozytose Aktivität wird als Exozytose Ereignisse beim chromaffin präsentiert Zellen (n = 4) sind mit Barium Lösung isotonische, dann Hypertone, stimuliert und schließlich in isotonischen Bedingungen. Die Werte werden als die durchschnittliche Anzahl der Spikes von jeder Zelle präsentiert und der Durchschnitt aus allen Zellen abgetastet (Standardfehler des Mittelwertes (SEM)). Die statistische Signifikanz der Änderungen wird vorgestellt mit einem t-Test für ungepaarte Daten (der p -Wert für isotonische Ba2 + Stimulation 1 und hypertonen Ba2 + Stimulation 2 ist p= 0.0126 und der p-Wert für den Vergleich der Hypertone Ba2 + Stimulation 2 und isotonische Ba2 + 3 ist eine Stimulation p= 0,037). (B) Kontrollexperiment präsentiert die Häufigkeit der Exozytose Ereignisse nach drei aufeinander folgenden Barium Stimulationen bei chromaffin Cells (n = 4) in isotonischen Bedingungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Intrazelluläre Vesikel elektrochemische Zytometrie, Veränderungen in der Vesikel Quanten Größe zu überwachen. (A) eine schematische Darstellung des experimentellen zur intrazellulären elektrochemische Zytometrie eingerichtet. (B) ein Scan Elektronenmikroskopie-Bild von einer typischen Nanotip konische Kohlefaser-Elektrode24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Intrazelluläre elektrochemische Zytometrie Messungen zeigen (A) repräsentative Spuren von intrazellulären amperometrischen Zytometrie Aufnahmen bei chromaffin Cells isotonische (schwarz) und hypertonen (rot) extrazelluläre Umgebungen. (B) Erweiterung der eine durchschnittliche amperometrischen Spike aus intrazellulären Zytometrie Messung bei chromaffin Cells isotonische (schwarz) und hypertonen (rot) extrazelluläre Umgebungen24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 : Quantifizierung der Anzahl der Katecholamine veröffentlicht bei Exozytose und Bestimmung der Quanten Vesikelgröße. (A) die durchschnittliche Anzahl der Moleküle während Exozytose Aufnahmen bei chromaffin Cells in isotonischen freigegeben (n = 22) und hypertonen (n = 20) Umgebungen. Die Werte werden als eine durchschnittliche Anzahl von Molekülen pro Exozytose Veranstaltung von jeder Zelle veröffentlicht und gemittelt aus den Zellen abgetastet (± SEM) dargestellt. Die statistische Signifikanz der Änderungen werden vorgestellt mit t-Test für ungepaarte Daten (p -Wert = 0,0003) (B) die durchschnittliche Anzahl der Moleküle pro Vesikel wie von intrazellulären elektrochemische Zytometrie bei chromaffin Cells in isotonische (n erkannt = 19) und hypertonen (n = 16) Bedingungen. Die Werte sind als die durchschnittliche Anzahl der Moleküle pro Spike präsentiert, wie jede Zelle erkannt und im Durchschnitt aus allen Zellen abgetastet (± SEM). Die statistische Signifikanz der Änderungen wird vorgestellt mit t-Test für ungepaarte Daten (p - Wert = 0,0108)24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 : Wirkung des osmotischen Drucks auf große Rumpfkern Vesikelgröße. Das berechnete Volumen der LDCVs, die dichten Core-Protein und die Halo-Lösung rund um den dichten Kern-Protein-Matrix wurde in Attolitres (aL) aus Bildanalyse von TEM Bilder von chromaffin Zellen in isotonischen berechnet (n = 12) und hypertonen (n = 9) Puffer. Die Ergebnisse wurden von einem Durchschnitt von 311 Vesikel pro Zelle und Durchschnitte von Einzelzellen (± SEM) gesammelt. Die p-Werte sind von ungepaarten t-Tests vergleichen isotonisch und hypertonen Puffer gemeldet. Der P-Wert ist 0.0385 (*) für Vesikel Volumen, 0.3967 für dichten Kernvolumen, 0.0047 (*) für Halo Band24. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll und die Vorteile der Kombination von drei ergänzende analytische Methoden zur Analyse von sekretorischen Vesikel und die Exozytose Prozess besser zu verstehen wie eine physische Kraft wie osmotischen Druck sekretorischen Vesikel auswirken können und der Exozytose Prozess in sekretorischen Zellen. Diese Methoden umfassen die Kohlefaser-Mikroelektrode strommesstechnik, das ist eine etablierte Methode zur Erfassung von Exozytose Aktivität, intrazelluläre elektrochemische Zytometrie, die verwendet wird, um Quanten Größe von Vesikeln in ihrer natürlichen Umgebung zu bestimmen und Übertragung-Elektronen-Mikroskopie-Bildanalyse sekretorischen Vesikel Volumen zu überwachen. In diesem Werk, durch das Sammeln von quantitativen Daten aus strommesstechnik Aufnahmen von einzelnen Vesikel Exozytose Veranstaltungen in chromaffin Zellen eine isotonische und einer hypertonen extrazellulären Umgebung ausgesetzt wir bestätigt, osmotischen Schock reduziert die Menge Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt und, dass diese Zellen können reversibel erholen und lassen Sie die ursprüngliche Menge, wenn in einer isotonischen Umgebung (Abbildung 3).

Die konduktometrische Aufnahmen Angaben zur Häufigkeit der Exozytose Ereignisse im Vergleich zur Zeit und können daher auch Änderungen im Exozytose Tätigkeit an Zellen in unterschiedlichen osmotischen Umgebungen überwachen verwendet werden. Diese Daten können interpretiert und verwendet zu erkennen, ob Veränderungen in der Aktivität sofort oder als Funktion der Zeit auftreten. Wie wir in früheren Arbeiten, obwohl osmotischen Stress steht Aktivität behindert, schien es nicht die Fusion des leicht freisetzbaren Pools von Vesikeln24behindern. Die Exozytose Aktivitätsdaten können auch verwendet werden, um die Gesamtaktivität steht während eines Zeitraums von Aufnahmezeit zu analysieren. Hier präsentieren wir die kumulierte Anzahl der Exozytose Ereignisse aus einer 3-minütigen Aufnahme der Exozytose an chromaffin Zellen, die zwei unterschiedlichen osmotischen Bedingungen ausgesetzt. Diese Daten zeigen eine Hemmung in Exozytose Aktivität der Zellen, die osmotischen Stress und eine teilweise Erholung dieser Aktivität erreicht werden kann, nach Rückkehr von Zellen in einer extrazellulären isotonischen Umgebung zu erleben. Sehr wichtig ist, zeigten die Experimente jedoch, dass mehrere Ba2 + Stimulationen innerhalb des Zeitrahmens in diesen Experimenten verwendeten eine signifikante Reduktion in Exozytose Aktivität durch jedesmal verursacht, die eine Zelle zur Sekretion stimuliert wurde. Durch die dritte in Folge Ba2 + Stimulation nur ein Drittel der Exozytose Aktivität wurde beibehalten, und eindeutig die Barium, und vielleicht auch das Timing der Stimulationen in diesen Experimenten betraf die Vesikel-Zyklus. Dies könnte relevant für die Erklärung, warum steht Aktivität in den Zellen platziert in isotone Lösung nach dem osmotischen Schock geborgen wurde und warum diese Zellen eine ähnliche relative Reduktion in Aktivität im Vergleich zu Zellen in isotonischen Bedingungen nach drei angezeigt werden sequentielle Ba2 + Stimulationen. Daher informiert über sekretorischen Vesikel von dem Moment an den die Vesikel ausgelöst werden, um verschmelzen mit der Plasmamembran, Freigabe Neurotransmitter durch die Fusion Pore strommesstechnik Aufnahme der Exozytose. Dabei lassen Sie quantitative Daten über einzelne Vesikel Neurotransmitter und Informationen über die Exozytose Aktivität gesammelt werden kann.

Die Menge der Neurotransmitter freigesetzt kann durch die Art der Exozytose reguliert werden, die ausgelöst wird, wo die volle Blase Inhalt oder Teile des Inhalts freigegeben wird. Durch das Studium ausschließlich Exozytose Version mit Kohlefaser-strommesstechnik, der nur erkennt, was aus einem Vesikel verwiesen wird, ist es schwierig zu unterscheiden, ob eine Änderung in der erkannten Höhe der Neurotransmitter freigesetzt, eine Änderung im getriggerten Modus der zusammenhängt Exozytose, eine Änderung in den zellulären biophysikalischen Eigenschaften beeinflussen Vesikel Content Version, oder Änderungen in Quanten Vesikelgröße. Daher ergänzen die konduktometrische Aufzeichnung der Exozytose mit Messungen mit der intrazellulären elektrochemische Zytometrie, in Situ Messungen der Quanten Vesikelgröße in lebenden Zellen charakterisiert und verwendet werden können daher zu vergleichen die Bruchteil der Vesikel Content Release von Vesikeln während Exozytose26.

In dieser Arbeit angewendet, um untersuchen, ob die Quanten Vesikelgröße von osmotischen Stress betroffen war wir diese Technik für die Quantifizierung und Bewertung von Quanten Vesikelgröße Zellen isotonisch und hypertonen Bedingungen ausgesetzt. Einführen der Nanotip Elektrode in das Zytoplasma einer Zelle Leben eher invasiv angesehen wird, diese Experimente wurden nur einmal pro Zelle durchgeführt und waren nicht in der gleichen Zelle wiederholt. Daher werden diese Experimente bevorzugt als Einzelmessungen von Gruppen von zufällig ausgewählten Zellen, eine isotonische und einer hypertonen extrazellulären Umgebung durchgeführt. Um Änderungen in Quanten Vesikelgröße gemessen am intrazellulären elektrochemische Zytometrie, Veränderungen in der Menge Neurotransmitter bei Exozytose freigesetzt zu vergleichen, sollte man überlegen, den experimentellen Bedingungen intrazelluläre Aufnahme entsprechen und führen Sie auch strommesstechnik Aufnahme der Exozytose an separaten zufällige Zellen. Wenn Studien mit einer einzigen Zelle durchgeführt werden, ist es wichtig, in diesen experimentellen Protokollen auch den Einfluss der aufeinander folgenden BaCl2 Stimulationen zu berücksichtigen und um sicherzustellen, dass die experimentellen Bedingungen für die intrazelluläre Zytometrie übereinstimmen Messungen. Es ist auch erwähnenswert, dass es schwierig ist, die genaue Platzierung und Tiefe der Elektrode beim Einfügen in eine Zelle zu steuern. Somit stellt jede Zelle eine Zufallsstichprobe Vesikel Quanten Größe Analyse. Darüber hinaus sondieren Quanten Vesikelgröße mit dieser Methode unterscheidet nicht Unterschiede in zum Beispiel Vesikel Reife und daher auch übrigens Variation zu Messungen. Intrazelluläre Experimente zeigten, dass Quanten Vesikelgröße Zellen, extrazellulärer osmotischer Druck reduziert wurde. Die relative Verringerung Quanten Größe von dieser Methode erkannt wurde mit den Beobachtungen der relativen Veränderung der Neurotransmitter-Freisetzung während Exozytose verglichen. Diese Studie fand heraus, dass der Rückgang der Quanten Größe auf der gleichen Reihenfolge wie der Rückgang der Neurotransmitter Release auf Zellen sensing osmotischen Stress war.

Um zu überprüfen, wenn osmotischen Stress die Vesikel Neurotransmitter Konzentration verändert wurde, war die Vesikel Lautstärke anhand TEM bildgebende Analyse für chemisch festen chromaffin Zellen, die isotonische und hypertonen Bedingungen ausgesetzt waren. TEM bildgebende Analyse zeigte, dass Bläschen schrumpfen, wenn Zellen einen osmotischen Schock ausgesetzt sind und dass die relative Reduktion in der Größe, zusammen mit den Quanten Vesikelgröße angepasst wird weiterhin eine konstante Neurotransmitter Konzentration24. TEM Bildanalyse, wonach Nanometer Auflösung unterscheiden die beiden Phasen, die dichten Kern-Protein-Matrix und die umgebende Halo-Lösung in LDCVs, und so macht es möglich, das Volumen der Rumpfkern Protein-Matrix zu bestimmen und berechnen Sie das Volumen der Halo-Lösung. Aus dieser Analyse war der Rückgang der Vesikel Volumen bestimmt, vor allem im Zusammenhang mit einem abnehmenden Volumen aus der Halo-Lösung rund um die Rumpfkern Protein Matrix24.

Zusammenfassend lässt sich sagen sind diese Studie präsentiert ein Protokoll zeigt wie drei Analysemethoden wird kombiniert und ermöglicht die Charakterisierung der sekretorischen Vesikel vor Neurotransmitter Release und was aus diesen Vesikeln freigegeben, wenn Zellen, um ausgelöst werden Exozytose, um ein besseres Verständnis der wie sekretorischen Vesikel und Handy-Funktionen wie Exozytose von extrazellulären Stress betroffen ist. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Fragen auf wie Neurotransmitter freisetzen bei Exozytose und Quanten Vesikelgröße wird beeinflusst durch andere Veränderungen in der physischen Umgebung oder durch mögliche Medikamente, die sekretorische Zellen beeinflussen können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchte der schwedischen Forschungsrat (349-2007-8680) für die Finanzierung und Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Schweden) für die Spende von Rindern Nebennieren zu danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

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References

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