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Neuroscience

एकल Sciatic नसों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और एक एकल माउस से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि प्रवाह का उपयोग कर Cytometry

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56538
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1,3
1Department of Medicine I and Clinical Chemistry, University Hospital of Heidelberg, 2Institute for Diabetes and Cancer IDC Helmholtz Center Munich, Germany & Joint Heidelberg-IDC Translational Diabetes Program, 3German Center for Diabetes Research (DZD)

Summary

murine sciatic तंत्रिका के भीतर कोशिका सामग्री का मात्रात्मक विश्लेषण ऊतक की कमी के कारण मुश्किल है । इस प्रोटोकॉल ऊतक पाचन और तैयारी है कि व्यक्तिगत चूहों की नसों से प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्रदान करता है के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) में तंत्रिका-निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक स्वस्थ तंत्रिका में ंयूरॉंस अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । पीएन की प्रतिरक्षा कोशिकाओं चोट और रोग से प्रभावित कर रहे हैं, तंत्रिका समारोह को प्रभावित करने और पुनर्जनन के लिए क्षमता । ंयूरॉन प्रतिरक्षा कोशिकाओं सामांयतः इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण कर रहे है (यदि) । जबकि अगर तंत्रिका में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थान का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है, अगर केवल अर्द्ध मात्रात्मक है और विधि मार्करों की संख्या है कि एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है और सतह अभिव्यक्ति की डिग्री तक ही सीमित है । इस अध्ययन में, प्रवाह cytometry ल्युकोसैट घुसपैठ के मात्रात्मक विश्लेषण sciatic नसों या पृष्ठीय रूट ganglions (DRGs) में व्यक्तिगत चूहों के लिए इस्तेमाल किया गया था । एकल सेल विश्लेषण DAPI का उपयोग किया गया था और कई प्रोटीन या तो सतह या intracellular अभिव्यक्ति के लिए एक साथ विश्लेषण कर रहे थे । एक माउस से दोनों sciatic नसों कि इस प्रोटोकॉल के अनुसार इलाज किया गया ≥ ३०,००० एकल nucleated घटनाओं उत्पंन । sciatic नसों में ल्यूकोसाइट्स का अनुपात, CD45 की अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित, sciatic तंत्रिका में कुल सेल सामग्री के लगभग 5% और डीआरजी में लगभग 5-10% था । हालांकि इस प्रोटोकॉल पीएन के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका जनसंख्या पर मुख्य रूप से केंद्रित है, प्रवाह cytometry का लचीलापन एक साथ मार्करों की संख्या को मापने के लिए एक साथ इसका मतलब है कि अन्य कोशिकाओं Schwann कोशिकाओं के रूप में तंत्रिका के भीतर मौजूद आबादी, pericytes , fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं, भी इस पद्धति का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि इसलिए पीएन पर प्रणालीगत प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक नया साधन प्रदान करता है, जैसे न्यूरोपैथी के neurotoxicology और आनुवंशिक मॉडल या मधुमेह जैसे पुराने रोगों में.

Introduction

प्रतिरक्षा कोशिकाओं जो संचलन से पीएन दर्ज करें, के रूप में CD45 और CD11b की अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित, तंत्रिका की अखंडता को बनाए रखने और पुनर्जनन और अध...1में एक भूमिका दोनों खेलने में मदद । मैक्रोफेज (माउस में CD68 की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित) एक भड़काऊ phenotype की ओर टेढ़ा किया जा सकता है, अधिक MHC वर्ग द्वितीय और CD86 उनकी सतह (M1) पर व्यक्त, या एक विरोधी भड़काऊ phenotype के प्रति, अधिक intracellular CD206 व्यक्त (M2)2 . macrophage phenotype के विषम एक गतिशील प्रक्रिया के माध्यम से विनियमित है3संकेतन, रोगजनकों के खिलाफ रक्षा में मैक्रोफेज के विभिंन कार्यों को दर्शाती है (M1) और ऊतक पुनर्जनन (M2) में भूमिका । एक घायल तंत्रिका के उत्थान पहले तंत्रिका4,5में मैक्रोफेज द्वारा myelin मलबे की phagocytosis की आवश्यकता है, और विरोधी भड़काऊ (CD68+CD206+) M2 मैक्रोफेज में axon वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है पीएन6. कम भर्ती या पीएन, या phagocytosis के लिए ख़राब क्षमता के लिए मैक्रोफेज बिगड़ा पुनर्जनन और तंत्रिका अखंडता के रखरखाव में परिणाम हो सकता है । भड़काऊ M1 मैक्रोफेज, MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त, M2 मैक्रोफेज से phagocytosis के कम सक्षम हैं, और कई रोगजनन रोगों के neurodegenerative में न्यूरॉन सूजन फंसाया जाता है7.

परिवर्तन है कि क्षति का एक परिणाम के रूप में तंत्रिका निवासी प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए हो सकता है मात्रात्मक, CD45 के नुकसान में प्रकट+ ल्यूकोसाइट्स (या मामले में सूजन CD45+ ल्यूकोसाइट्स की वृद्धि हुई घुसपैठ), या गुणात्मक, जैसे macrophage phenotype का परिवर्तन M2 से M1 phenotype. पीएन की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को परंपरागत रूप से अगर के माध्यम से विश्लेषण किया गया है, जमे हुए वर्गों या आयल-एंबेडेड सामग्री का उपयोग कर8। यदि ब्याज की कोशिकाओं के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, अगर अक्सर ऊतक के एक संकीर्ण अनुभाग में कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या की गिनती पर निर्भर करता है का उपयोग कर, ठहराव ठहराव चयन पूर्वाग्रह के लिए अविश्वसनीय और कमजोर बना रही है । प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट की पहचान के लिए, extracellular और/या intracellular मार्कर के एक साथ का पता लगाने की आवश्यकता है, whilst macrophage phenotype के निर्धारण कम से कम दो मार्करों की आवश्यकता है, विशेष रूप से CD206 और MHC द्वितीय श्रेणी । के रूप में सबसे अधिक से अधिक उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी fluorescein isothiocyanate (FITC) और phycoerythrin (पीई), प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के लक्षण वर्णन के रूप में अगर सीमित और अधूरा हो सकता है, की आवश्यकता के रूप में कम से कम दो रंग चैनल, एकाधिक स्लाइड, ब्याज की एक ही क्षेत्र है, जो दाग और समानांतर में विश्लेषण कर रहे है से व्युत्पंन की जरूरत है । इस समय उपभोक्ता पहलू इसलिए आवश्यक नहीं है खुद को बड़े नमूना सेट के विश्लेषण के लिए उधार दे । इसके अलावा, के रूप में ब्याज की मार्कर के सबसे extracellular हैं, ऊतक में पता लगाने, जो या तो तेल या cryoconserved में एंबेड किया गया है, झिल्ली अखंडता के विघटन और epitopes के मास्किंग के कारण समस्याग्रस्त किया जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में के नुकसान एसीटोन और मेथनॉल9जैसे सॉल्वैंट्स के उपयोग से ब्याज की एंटीजन ।

इसके विपरीत, प्रवाह cytometry, जो निलंबन में एकल कोशिकाओं के ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति विशेषताओं के उपाय के रूप में वे प्रकाश की एक किरण के माध्यम से पारित, सेल आबादी के विश्लेषण के लिए एक और अधिक व्यावहारिक और व्यापक साधन प्रदान करता है । प्रवाह cytometry, बजाय ऊतक के एक डिजिटल छवि का निर्माण, सेट मापदंडों, जो एक सेल रिश्तेदार आकार और चिंतनशील सूचकांक शामिल है की एक स्वचालित ठहराव प्रदान करता है, आगे तितर बितर (FSC) के रूप में निर्दिष्ट, दानेदार/ साइड-कैटरिंग (SSC), और सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदान करने वाले, सेल को एक उपयुक्त fluorophore के साथ लेबल किया गया है, जैसे कि संयुग्मित एंटीबॉडी. एक ठेठ प्रवाह cytometer दो, एयर कूल्ड पराबैंगनीकिरण के होते हैं; एक आर्गन लेजर ४८८ एनएम पर नीले प्रकाश का उत्पादन और एक हीलियम-नियॉन लेजर ६३३ एनएम पर प्रकाश पैदा करता है । इस संयोजन का पता लगाने और माप के लिए अनुमति देता है, इसके साथ ही, या तो सतह पर या intracellular डिब्बे के भीतर कम से कम पांच लक्ष्यों की । अधिक उन्नत प्रवाह cytometers कई पराबैंगनीकिरण से मिलकर बना सकते हैं, जो एक बार में आठ विभिन्न fluorochromes तक का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, जो कि चयनित fluorochromes के पीक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य को महत्वपूर्ण रूप से ओवरलैप नहीं करते हैं ।

प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए, ब्याज की ऊतक पहले enzymatically पच, आम तौर पर collagenase के साथ होना चाहिए, एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए. murine sciatic नसों का विश्लेषण पहले एक चूहे से प्राप्त ऊतक की छोटी राशि के कारण मुश्किल हो गया है । इसके अलावा, axons के आसपास myelin के उच्च वसा सामग्री सेल वसूली में बाधा और मलबे की बड़ी मात्रा में पैदा करता है । विधि sciatic तंत्रिका तैयारी और पाचन के लिए यहां वर्णित बैरेट एट अल के Schwann सेल अलगाव प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था । 7, और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत चूहों की नसों से पर्याप्त कोशिकाओं को अलग करना है, ताकि चूहों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए करना है । कच्चे ऊतक डाइजेस्ट में एकल कोशिकाओं की पहचान के लिए DAPI का उपयोग axon मलबे, जो सामांयतः कोशिका हानि की ओर जाता है हटाने की आवश्यकता को दरकिनार । फैटी मलबे के भीतर फंसे कोशिकाओं की रिहाई में एक डिटर्जेंट युक्त बफर एड्स के साथ कई बार धुलाई, जिससे उपज में वृद्धि । इस प्रोटोकॉल के अनुसार एक ही माउस से दोनों पूर्ण लंबाई sciatic तंत्रिकाओं के पाचन ≥ ३०,००० एकल nucleated घटनाओं और डीआरजी से प्राप्त किया गया था कि संख्या से कम 3 बार उत्पंन करता है । CD45+ ल्यूकोसाइट्स के अनुपात sciatic तंत्रिका डाइजेस्ट में कुल सेल सामग्री का लगभग 5% था और डीआरजी डाइजेस्ट में लगभग 5-10% । sciatic तंत्रिका में CD45+ कोशिकाओं के बहुमत macrophage मार्करों, CD68 और CD206 व्यक्त की है ।

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Protocol

वंय-प्रकार C57BL/6 चूहों (नर; 10-12 सप्ताह) मानक 12 ज प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखा गया था और मानक चाउ आहार और पानी के लिए मुफ्त पहुंच प्रदान की गई । सभी पशु प्रयोगों स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा संबंधित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और स्थानीय पशु देखभाल और कार्ल्सृहे में क्षेत्रीय प्राधिकरण में उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित, जर्मनी (G216/

1. माउस का छिड़काव

  1. कुर्बानी का चूहा (C57BL ६/ नर; 10-12weeks) का उपयोग कर कं2 या स्थानीय विनियमों के अनुसार ।
    नोट: रेट्रो कक्षीय रक्तस्राव नियंत्रण ल्यूकोसाइट्स प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, EDTA-लेपित १.५ मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग कर । रक्तस्राव का यह तरीका त्याग के तुरंत बाद ही दक्ष होता है. इसके अलावा, पेरिटोनियल गुहा लेवेज (PCL) नियंत्रण मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम पंजाबियों का उपयोग रक्त के ठंडे समूहन से बचने के लिए, जो छिड़काव में बाधा हो सकती है ।
  2. ७०% v/v इथेनॉल के साथ उदारवादी पेट पर फर छिड़काव और कपास धुंध के साथ एक ऊतक के साथ बार पोंछते द्वारा माउस को संक्रमित । कुंद कैंची का प्रयोग, एक अनुदैर्ध्य चीरा द्वारा उदर त्वचा खुले में कटौती.
  3. पहले डायाफ्राम घुमावदार, कुंद कैंची का उपयोग कर में एक चीरा बनाने के द्वारा फुफ्फुस गुहा बेनकाब और फिर रिब पिंजरे की पूरी लंबाई के साथ चीरा का विस्तार । contralateral ओर एक समान कट बनाओ जब तक उरोस्थि ध्यान से दूर उठाया जा सकता है ।
  4. दिल और प्रमुख जहाजों की एक स्पष्ट दृश्य के साथ, एक तितली 23 ¾ गेज सुई, एक ५० मिलीलीटर बर्फ ठंडे पंजाबियों से भरा सिरिंज, दिल के बाएं चैंबर में डालें ।
  5. आईरिस कैंची का उपयोग कर के रूप में संभव के रूप में अवरोही महाधमनी को नुकसान पहुंचाए बिना एक दुकान के बड़े बनाने के लिए दिल का सही atrium के लिए एक चीरा बनाओ, और फिर धीरे से दबाना के माध्यम से धक्का सिरिंज लगभग 30 पंजाब के मिलीलीटर । रिसाव स्पष्ट चलना चाहिए । जिगर और/या गुर्दे के समाशोधन एक अच्छा छिड़काव के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. Sciatic तंत्रिका और डीआरजी का विच्छेदन

नोट: sciatic नसों के विच्छेदन के लिए, gluteus maximus के ऊपर त्वचा को हटा दिया जाता है और माउस नीचे निचले अंगों खींच whilst नीचे ventral पक्ष तैनात है ।

  1. द्विपक्षीय ऊपरी पृष्ठीय जांघ से मांसपेशियों के ऊतकों को अलग करके पूरे sciatic नसों टुकड़े, और रीढ़ की हड्डी कॉलम के साथ तंत्रिका का पालन करें । यह रीढ़ की हड्डी के कॉलम से बाहर निकलता है और दूसरे छोर पर घुटने के तुरंत ऊपर जहां तंत्रिका काट ।
    नोट: इस तरह के कुचल या संदंश के साथ खींच के रूप में तंत्रिका की अत्यधिक हैंडलिंग से बचें ।
  2. संदंश का प्रयोग, उत्पादेड तंत्रिका (एस) हस्तांतरण, लगभग 2 सेमी प्रति तंत्रिका, एक १.५ मिलीलीटर बर्फ की 1 मिलीलीटर-ठंडा पंजाबियों और बर्फ पर स्टोर ट्यूब से युक्त ।
    नोट: तंत्रिका बर्फ पर रातोंरात संग्रहीत किया जा सकता है ।
    नोट: डीआरजी विच्छेदन के लिए, संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग कर, धीरे से दूर शेष वापस त्वचा छीलने द्वारा अंतर्निहित कोमल ऊतक से त्वचा को अलग करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा, वक्ष, और काठ का रीढ़ क्षेत्रों बेनकाब । कैंची की एक कुंद जोड़ी का उपयोग खोपड़ी के आधार पर काटने से सिर को हटा दें ।
  3. पसलियों के साथ समानांतर कट और रीढ़ की हड्डी के कॉलम के दोनों तरफ से जुड़े आंत को अलग करने से पहले, दोनों तरफ के स्पाइनल कॉलम में । femurs को काटें और femurs के स्तर पर एक अनुप्रस्थ कट द्वारा स्पाइनल कॉलम को हटा दें । आइरिस कैंची का प्रयोग, रीढ़ की हड्डी से किसी भी मांसपेशी, वसा, और अन्य कोमल ऊतकों को काट लें ।
  4. ऊपर का सामना करना पड़ रहा है और इसे खोलने के लिए पृष्ठीय पक्ष के साथ रीढ़ की हड्डी कॉलम प्लेस, caudal अंत में शुरू, तीन बजे की स्थिति और अस्थि snipped में कशेरुका नहर में कैंची के एक टिप फिसलने से । नौ बजे की स्थिति में प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    नोट: यह डीआरजी को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए केंद्र में बिल्कुल कटौती करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  5. rostral खत्म होने तक साइड-साइड से कटिंग को दोहराएं और रीढ़ की हड्डी पूरी तरह से सामने आ जाए । एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, रीढ़ की हड्डी को हटाने के रीढ़ की हड्डी को उजागर करने के लिए नसों, जो DRGs के भीतर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. डीआरजी को कशेरुका नहरों में खींचने के लिए पृष्ठीय रूट पर धीरे से tugging करके काठ का DRGs निकालें, फिर DRGs को निकालने के लिए आइरिस कैंची से तंत्रिकाओं और संयोजी ऊतक कतरना.
    नोट: यह L4-L6 डीआरजी, जो sciatic तंत्रिका में योगदान दे रहे हैं करने के लिए संग्रह को प्रतिबंधित करने के लिए संभव है ।
  7. संदंश का प्रयोग, एक १.५ मिलीलीटर बर्फ ठंडा पंजाबियों के लगभग 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब, और बर्फ पर स्टोर करने के लिए DRGs हस्तांतरण ।
    नोट: तंत्रिका बर्फ पर रातोंरात संग्रहीत किया जा सकता है ।

3. Sciatic तंत्रिका और डीआरजी के पाचन

  1. पाचन मीडिया तैयार (DMEM, 10 मिमी HEPES, 5 मिलीग्राम/एमएल BSA, १.६ मिलीग्राम/एमएल collagenase प्रकार 4) १०० µ जी के साथ पूरक/deoxyribonuclease के एमएल, और बर्फ पर स्टोर ।
    नोट: प्रति माउस आवश्यक पाचन मध्यम की मात्रा (sciatic नसों + DRGs) 1 मिलीलीटर है । एक बार तैयार, पाचन मीडिया के aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. sciatic नसों और DRGs एक माउस से अलग १.५ मिलीलीटर ५०० पाचन मीडिया के µ एल युक्त ट्यूबों में स्थानांतरण । sciatic नसों के लिए, 15-20 टुकड़े वसंत कैंची का उपयोग कर में सामग्री काटना और फिर एक मिलाकर मशीन में ऊतक निलंबन के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन (≤ ४५० rpm) के साथ 20 मिनट के लिए मशीन ।
  3. triturate १,००० µ l पिपेट टिप के माध्यम से सेल सस्पेंशन को किसी भी पूरी तरह से पचाने वाले ऊतकों को अलग खिंचने के लिए ।
    नोट: अगर सस्पेंशन को अनुमापन करना मुश्किल है तो कुंदा खत्म करने के लिए पिपेट टिप को कैंची से काट लें । कोमल आंदोलन (≤ ४५० rpm) के साथ 20 मिनट के लिए ३७ ° c पर ऊतक निलंबन की मशीन ।
  4. एक १,००० µ एल पिपेट टिप और कोमल आंदोलन (≤ ४५० rpm) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट के लिए मशीन के माध्यम से trituration दोहराएं ।
  5. FACS बफर तैयार (पंजाब 10% FCS और 1 मिमी EDTA के साथ पूरक) और बर्फ पर दुकान. कुल्ला और बर्फ पर ६० x 15 मिमी पेट्री डिश में FACS बफर के साथ १४० µm के एक जाल आकार के साथ एक स्टेनलेस स्टील स्क्रीन सोख ।
    नोट: नायलॉन स्क्रीन फिल्टर से बचना चाहिए के रूप में यह nucleated कोशिकाओं की उपज में एक महत्वपूर्ण नुकसान की ओर जाता है ।
  6. बार १४० µm स्क्रीन फिल्टर के माध्यम से ऊतक सस्पेंशन पास, के रूप में यह पेट्री डिश पर आयोजित किया जाता है, कुंद संदंश के साथ, बर्फ पर । पेट्री डिश से सेल सस्पेंशन लीजिए और इसे एक नया १.५ एमएल ट्यूब बर्फ पर संग्रहित करने के लिए स्थानांतरण ।
  7. एक १,००० µ l पिपेट टिप के साथ दोहराया trituration द्वारा फिल्टर पर रहता है कि किसी भी पूरी तरह से पचा ऊतक पुश. FACS बफर के ५०० µ एल के साथ दो बार स्क्रीन फिल्टर कुल्ला और पेट्री डिश में परिणामी सेल निलंबन कदम ३.६ से सेल निलंबन के साथ गठबंधन करने के लिए इकट्ठा ।
    नोट: यदि प्रवाह cytometer उपयोग मलबे के प्रति संवेदनशील है, तो चरण ३.७ से कक्ष निलंबन को ७० µm स्क्रीन फ़िल्टर के माध्यम से पारित किया जा सकता है; हालांकि, इससे nucleated कोशिकाओं की पैदावार में नुकसान हो सकता है ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल सस्पेंशन के केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और FACS बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । इस वाशिंग स्टेप को एक बार दोहराएं ।
  9. FACS बफर के 150-350 µ एल में सेल गोली reसस्पेंड, दाग है कि (१५० µ एल धुंधला पैनल प्रति FACS बफर) की आवश्यकता है की संख्या पर निर्भर करता है ।

4. Sciatic तंत्रिका और डीआरजी प्रवाह Cytometry के लिए फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ धुंधला

  1. sciatic तंत्रिका या डीआरजी सेल निलंबन के १०० µ एल स्थानांतरण एक वी के आकार में अच्छी तरह से बर्फ पर एक ९६ अच्छी तरह से थाली में ।
    नोट: एकल सना हुआ कोशिकाओं सभी एंटीबॉडी के लिए आवश्यक के रूप में वे photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज लाभ और क्षतिपूर्ति के लिए संमान के साथ cytometry प्रवाह स्थापित करने के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रदान करेगा, साथ ही मदद करने के लिए विशिष्ट भेद गैर-विशिष्ट बाइंडिंग । कारण sciatic तंत्रिका और DRGs से उपलब्ध सीमित सामग्री, रक्त ल्यूकोसाइट्स और मैक्रोफेज से PCL (कदम 1.1-1.2) एकल दाग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, धुंधला जो के लिए sciatic के दाग के साथ समानांतर में प्रदर्शन किया जाना चाहिए तंत्रिका और DRGs ।
  2. पूल शेष कोशिकाओं निलंबन (लगभग ५० µ एल नमूना प्रति) या तो sciatic नसों या डीआरजी नमूनों से, एक दाग नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक । एक बिन पर प्लेट औंधा और कलाई की एक तेज झटका लगाने के द्वारा supernatant त्यागें, और धीरे कागज तौलिए पर सूखी नल ।
  4. सतह धुंधला के लिए, FACS बफर के 20 µ एल में सेल छर्रों में से प्रत्येक reसस्पेंड ब्याज की एंटीबॉडी युक्त (CD45-A647, CD11b-PerCP/cy 5.5, और MHC कक्षा द्वितीय-बायोटिन) और मशीन, प्रकाश से संरक्षित, बर्फ पर 30 मिनट के लिए ।
    नोट: (1) इष्टतम एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए निर्माता के उत्पाद की जानकारी के अनुसार एक कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रदर्शन द्वारा उपयोग करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए; (2) गैर विशिष्ट दाग एफसी के साथ मशीन द्वारा कम किया जा सकता है इस कदम पर ब्लॉक, निर्माता के निर्देश के अनुसार; और (3) Isotype नियंत्रण दाग आम तौर पर आवश्यक नहीं है जब प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग सीधे एक fluorophore के साथ संयुग्मित और/या जब ब्याज की प्रतिजन (ओं) अलग आबादी का उत्पादन ।
  5. FACS बफर के १३० µ एल जोड़ें प्रत्येक अच्छी तरह से और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक । पहले वर्णित के रूप में supernatant त्यागें (चरण ४.३) और FACS बफ़र के १५० µ l के साथ दो बार कक्ष छर्रों धो ।
    नोट: एक unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी या बायोटिन के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग करते हैं, तो एक उपयुक्त द्वितीयक रिएजेंट, एक संयुग्मित करने के लिए fluorophore, इस बिंदु पर जोड़ा जा सकता है और कदम 4.4-4.5 दोहराया जाता है । इस प्रोटोकॉल के मामले में, streptavidin-pe/Cy7 या streptavidin-PerCP MHC-CD45/A647-CD11b/PerCP 5.5 के साथ संयोजन में cy वर्ग द्वितीय का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था, या CD68 के साथ संयोजन-APC और F4/80-PE/Cy7, क्रमशः ।
  6. निर्धारण के लिए, पिछले धुलाई कदम के बाद, पंजाब (पीएच ७.४) में 4% paraformaldehyde के १०० µ एल में सेल छर्रों reसस्पेंड । 10 मिनट के लिए बर्फ पर थाली मशीन और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक । पहले वर्णित के रूप में supernatant त्यागें (चरण ४.३) और FACS बफ़र के १५० µ l के साथ एक बार कक्ष छर्रों धो ।
    सावधानी: Paraformaldehyde विषाक्त है; दस्ताने और चश्मा, आदिजैसे उचित सुरक्षा पहनें ।
    नोट: FACS बफर और प्रकाश से संरक्षित स्टोर के १५० µ एल में सेल छर्रों reसस्पेंड, 4 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए । यदि कोई intracellular धुंधला आवश्यक है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक के बाद ४.११ कदम आगे बढ़ना ।
  7. intracellular धुंधला के लिए, FACS बफर के १५० µ एल में सेल छर्रों reसस्पेंड + 0.5% डिटर्जेंट, और कमरे के तापमान पर गर्मी, 15 मिनट के लिए प्रकाश से संरक्षित 5 मिनट के लिए ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस । त्यागें supernatant के रूप में पहले वर्णित (चरण ४.३) और FACS बफर के १५० µ एल के साथ एक बार सेल गोली धोने + 0.5% डिटर्जेंट । FACS बफर के 20 µ एल में सेल गोली reसस्पेंड + 0.5% ब्याज के एंटीबॉडी युक्त डिटर्जेंट (CD68-APC, CD206-पीई) और गर्मी, प्रकाश से सुरक्षित, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ।
  8. FACS बफर के १३० µ एल जोड़ें + प्रत्येक अच्छी तरह से 0.5% डिटर्जेंट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक । पहले वर्णित के रूप में supernatant त्यागें (चरण ४.३) और FACS बफर के १५० µ एल के साथ दो बार सेल छर्रों धो + 0.5% डिटर्जेंट ।
    नोट: यदि एक unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी या बायोटिन के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी संयुग्मित का उपयोग कर, तो एक उपयुक्त माध्यमिक एजेंट, संयुग्मित एक fluorophore के लिए, इस बिंदु पर जोड़ा जा सकता है और कदम 4.9-4.10 दोहराया ।
  9. FACS बफर के १५० µ एल में सेल छर्रों reसस्पेंड + 0.5% डिटर्जेंट और स्टोर, प्रकाश से रक्षा की, 4 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों तक के लिए ।
  10. १५० µ एल FACS बफर के साथ सेल छर्रों reसस्पेंड + 0.5% 5 µ जी के साथ पूरक डिटर्जेंट/एमएल DAPI और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गर्मी, प्रकाश से सुरक्षित । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ४०० x g पर थाली केंद्रापसारक । पहले वर्णित के रूप में supernatant को छोड़ें (चरण ४.३) ।
  11. पंजाब के १५० µ एल में सेल छर्रों reसस्पेंड और एक उचित लेबल FACs ट्यूब के लिए स्थानांतरण । कमरे के तापमान पर स्टोर, प्रकाश से सुरक्षित, विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक ।
    नोट: पंजाब में पुनर्निलंबन के बाद, कोशिकाओं के घंटे के भीतर विश्लेषण किया जाना चाहिए, के बाद से DAPI धीरे डीएनए से अलग होगा, संकेत में एक नुकसान के लिए अग्रणी.

5. प्रवाह Cytometry के सेटअप और नमूनों की चल

  1. सुनिश्चित करें कि प्रवाह cytometer उपयुक्त पराबैंगनीकिरण और/या फिल्टर सेट के साथ सुसज्जित है fluorophores कोशिकाओं दाग करने के लिए इस्तेमाल को मापने के लिए । यह सिस्टम पर डिफ़ॉल्ट cytometer कॉंफ़िगरेशन के अंतर्गत निर्धारित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के मामले में, कोशिकाओं ≤ 5 fluorophores का पता लगाने के लिए अनुमति देने के तीन पराबैंगनीकिरण (४०५ एनएम, ४८८ एनएम, और ६३३ एनएम) के साथ सुसज्जित एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर विश्लेषण किया गया ।
  2. ब्याज की fluorophores का पता लगाने के लिए उपयुक्त चैनल का चयन करें । सभी फ्लोरोसेंट संकेतों सबसे अच्छा लघुगणक प्रवर्धन के साथ पाया जाता है ।
  3. नमूने के लिए एक उपयुक्त प्रवाह दर का चयन करें । इस पैरामीटर का उपयोग सिस्टम के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल के मामले में, मेड के लिए एक प्रवाह दर-हाय (35-60 µ एल मिनट) सुई के कॉलेस्ट्रॉल को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
  4. प्रति नमूना एकत्रित करने के लिए घटनाओं/कक्षों की कुल संख्या का चयन करें । घटनाओं की ंयूनतम संख्या १,०००,००० होना चाहिए ।
  5. एसएससी की एक वैश्विक वर्कशीट के तहत तितर बितर भूखंडों बनाएं-a बनाम FSC-a, के रूप में अच्छी तरह से ब्याज की प्रत्येक fluorophore बनाम FCS-a । एक सांख्यिकीय दृश्य है कि घटनाओं की संख्या और चयनित fluorophores के लिए मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFI) प्रदर्शित करेगा बनाएं ।
  6. FSC-a और SSC-एक चैनल का वोल्टेज सेट करें, इस तरह कि छोटी कोशिकाओं को तितर बितर भूखंड के निचले छोड़ दिया 10% में फिट । या तो sciatic नसों या DRGs से दाग नियंत्रण से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और ंयूनतम नमूना प्रतिदीप्ति निर्धारित करें । DAPI-केवल धुंधला नियंत्रण से तितर बितर भूखंड पर आधारित पैरेंट (P1) फाटक का निर्धारण ।
    नोट: यह एक संग्रह फाटक, भाग में कारण नहीं है, DAPI की विषम प्रकृति + जनसंख्या पीएन में ।
  7. ब्याज की fluorophores में से प्रत्येक के लिए FSC तितर बितर भूखंडों का प्रयोग, वोल्टेज को समायोजित करें ताकि दाग नियंत्रण की कोशिकाओं को उनके संबंधित तितर बितर भूखंडों की निचली तिमाही के भीतर गिर जाते हैं । गेट्स तो इस क्षेत्र के ऊपर बनाया के लिए उन कोशिकाओं है कि संबंधित मार्करों/fluorophores में से प्रत्येक के लिए सकारात्मक है परिभाषित कर रहे हैं । एक गेट के स्थान पर एक दाग नियंत्रण (४.१ कदम) के चलने से पुष्टि की है ।
    नोट: इस बिंदु पर अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए मुआवजा किया जा सकता है या उपयुक्त विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ पूर्वव्यापी रूप से लागू किया ।
  8. एक बार फ्लो cytometer को सेट कर दिया गया है, जैसा कि बताया गया है, नमूनों को चलाया जा सकता है ।
  9. चलाने के बाद, शेष नमूना सामग्री छोड़ दिया जा सकता है और FCS फ़ाइलें और विश्लेषण के लिए निर्यात किया जा सकता है ।

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Representative Results

दोनों पूर्ण लंबाई sciatic नसों और सभी प्रमुख डीआरजी से सेल सस्पेंशन तैयार किया गया, प्रोटोकॉल के अनुसार, छह स्वस्थ C57BL से/6 चूहों और धुंधला के लिए तीन बराबर aliquots में विभाजित । काउंटर DAPI, जो डीएनए दाग के साथ धुंधला, एक एकल सेल जनसंख्या का पता लगाने के लिए अनुमति देता है (चित्र 1a-बी, ऊपरी पैनल) । बाहर DAPI धुलाई, प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण करने से पहले, एक हद तक गैर की फ्लोरोसेंट तीव्रता-nucleated मलबे, जो FSC पर एक असतत जनसंख्या के चयन के लिए अनुमति देता है एक-nucleated घटनाओं या singlets की धुरी की कमी हुई । पीएन से singlets FSC और एसएससी (चित्रा 1C) की एक बड़ी रेंज पर वितरित कर रहे हैं के रूप में कोई संग्रह गेट लागू किया जाता है । FSC अक्ष के उच्च छोर पर मौजूद सामग्री, जिसमें पूर्णतः पच ऊतक होते हैं, को स्वेटर जनसंख्या (चित्र 1a-B) के चयन में शामिल नहीं किया जाना चाहिए । एक घनत्व भूखंड का प्रयोग (निचले पैनल) परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए बड़े मलबे के अपवर्जन में सुविधा हो सकती है (कम पैनल) । कुल ≥ ३०,००० singlets में से दो पूर्ण sciatic नसों से नियमित रूप से प्राप्त किया जा सकता है और ≥ २००,००० singlets DRGs (चित्रा 1 डी) से प्राप्त किया जा सकता है । sciatic नसों से, singlets के लगभग 5% अपनी सतह पर CD45 व्यक्त की है, जबकि लगभग 5-10% DRGs में पाए गए, जिससे ल्यूकोसाइट्स मूल के टेम के रूप में इन कोशिकाओं को परिभाषित (चित्र 2a) ।

CD45+ singlets के बहुमत भी MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त, एक क्रमिक तरीके से (चित्रा2) । DRGs में, CD11b microglial की तरह कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (CD45मंद, MHCII+ और CD11b+) (चित्रा ए बी, ऊपरी पैनल). हालांकि, इस microglia जनसंख्या sciatic नसों (चित्रा बी, लोअर पैनल) से नदारद है । पीएन में singlets व्यक्त CD45 के बहुमत CD68+ मैक्रोफेज हैं । sciatic तंत्रिका और डीआरजी में, 2-5% singlets व्यक्त की CD68 (चित्रा 3) । CD68 व्यक्त सभी कोशिकाओं को भी CD45 (डेटा नहीं दिखाया गया है) व्यक्त की है । DRGs में, CD68+ मैक्रोफेज दोनों MHC वर्ग द्वितीय और CD206, M2 मैक्रोफेज के लिए एक मार्कर, sciatic नसों (चित्र बी-डी) की तुलना में उनकी अभिव्यक्ति में अधिक विषम थे । sciatic नसों में, सबसे मैक्रोफेज सह व्यक्त MHC वर्ग द्वितीय और CD206 (चित्र बी-डी, लोअर पैनलों); आमतौर पर, CD68 के लगभग 60-80%+ मैक्रोफेज व्यक्त CD206, जबकि CD68 के एक छोटे अनुपात+ सह CD206 में व्यक्त DRGs (चित्र बी) । दिलचस्प बात यह है कि एम 1 macrophage मार्कर CD86 तंत्रिका से न तो मैक्रोफेज पर कोई सकारात्मक दाग उत्पन्न नहीं किया था और न ही PCL से (दिखाया गया डेटा). macrophage मार्कर, F4/80, दोनों डीआरजी में और sciatic नसों में एक विषम अभिव्यक्ति दिखाया (चित्रा बी-सी), CD68 और MHCII- कोशिकाओं का अनुपात धुंधला । इसके अलावा, F4/80 अभिव्यक्ति पूरी तरह से CD68 अभिव्यक्ति के साथ ओवरलैप नहीं किया ।

Figure 1
चित्रा 1: डीआरजी और sciatic तंत्रिका से DAPI-सना हुआ nucleated कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण से प्रतिनिधि डेटा. सभी घटनाओं, scatterplots (ऊपरी पैनल) या घनत्व भूखंडों (कम पैनल), (ए) डीआरजी या (ख) sciatic तंत्रिका (SN) के एक प्रतिनिधि माउस से के रूप में दिखाया । निचले पैनलों में तीर फाटक, शीर्ष FCS अक्ष पर सामग्री को छोड़कर इंगित करते हैं । (ग) DAPI-गेट (singlets) में एकत्र कोशिकाओं का बैक-गेटिंग, एसएससी बनाम FSC कैटरिंग प्लाट पर पैनल (ए) में दिखाया गया. (D) SN और सभी प्रमुख डीआरजी से छह स्वस्थ C57BL/6 चूहों से singlets की संख्या । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसडी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: CD45, MHC वर्ग द्वितीय की सतह अभिव्यक्ति का प्रवाह cytometry विश्लेषण, और singlets और डीआरजी तंत्रिका से sciatic पर CD11b । चित्र 1 में दर्शाए गए DAPI-gate (singlets) में चयनित ईवेंट्स का विश्लेषण किया गया । (क) sciatic तंत्रिका (SN) में singlets व्यक्त CD45 का अनुपात और छह नियंत्रण चूहों से डीआरजी. (B) डीआरजी (ऊपरी फलक) और SN (निचला फलक) से singlets के प्रतिनिधि तितर बितर भूखंड । CD11b एक्सप्रेस कोशिकाओं नीले रंग के साथ संकेत कर रहे हैं । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसडी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: CD68, MHC वर्ग द्वितीय की सतह अभिव्यक्ति का प्रवाह cytometry विश्लेषण, और singlets और डीआरजी तंत्रिका से sciatic पर CD206 । चित्र 1 में दर्शाए गए DAPI-gate (singlets) में चयनित ईवेंट्स का विश्लेषण किया गया । (क) sciatic नर्व (SN) में singlets व्यक्त CD68 के अनुपात और DRGs से छह स्वस्थ C57BL/ (ख) CD68 के अनुपात+ मैक्रोफेज सह एक्सप्रेस CD206 में एसएन और डीआरजी से छह स्वस्थ C57BL/ (ग) CD68 और MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति दिखा डीआरजी (ऊपरी पैनल) और SN (लोअर पैनल) से singlets के प्रतिनिधि तितर बितर भूखंडों । (घ) CD68 और CD206 अभिव्यक्ति दिखा डीआरजी (ऊपरी फलक) और SN (लोअर पैनल) से singlets के प्रतिनिधि तितर बितर भूखंडों । F4/80 व्यक्त कोशिकाओं रानी रंग के साथ संकेत दिया है । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसडी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

Sciatic नसों लिपिड के एक बड़े अनुपात होते हैं, जैसे कोलेस्ट्रॉल, axons के आसपास myelin की सामग्री के कारण. तापमान के साथ लिपिड परिवर्तन के गुण के बाद से विभिन्न तापमान पर विभिन्न परिणाम प्राप्त किया जा सकता है । सेल संरक्षण सुनिश्चित करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सभी कदम पाचन के बाद बर्फ पर प्रदर्शन किया गया । Whilst स्थिरता परिणामों के reproducibility के लिए सिफारिश की है, यह कदम ३.६ और ३.७ कमरे के तापमान पर प्रदर्शन से उपज को बढ़ाने के लिए संभव हो सकता है । यदि ३.८ कदम पर नसों पर्याप्त पचा नहीं किया गया है, तंत्रिका के छोटे टुकड़े जाल पर दिखाई जाएगी । अपर्याप्त पाचन के मामले में, सामग्री मेष पर बनाए रखा फिर से पचा जा सकता है एक नया १.५ मिलीलीटर पाचन मीडिया के २५० µ एल ट्यूब और दोहरा कदम 3.2-3.6 से युक्त करने के लिए स्थानांतरित करके । यदि उपज गरीब है, तो सेल निलंबन का एक नमूना, जाल स्क्रीन (चरण ३.६) के माध्यम से गुजर के बाद trypan नीले रंग के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाना चाहिए । व्यवहार्य, गैर नीले, कोशिकाओं छड़ी के साथ दिखाई जानी चाहिए संरचनाओं की तरह है, जो axons के टुकड़े कर रहे हैं । यदि कोई व्यवहार्य कोशिकाओं मौजूद हैं, तो पाचन की स्थिति और/या सामग्री के गलत हाथ में परिगलन का कारण बना है । यदि केवल बड़े समुच्चय दिखाई दे रहे हैं, तो यह केंद्रापसारक द्वारा सामग्री इकट्ठा और पाचन दोहराने की सिफारिश की है (3.2-3.6 कदम) ।

murine sciatic नसों और DRGs के प्रवाह cytometer विश्लेषण की विधि पूरी नसों और कई DRGs को शामिल सवालों के लिए उपयोगी है । हाल ही में वहां प्रवाह पीएन का उपयोग कर cytometry के विश्लेषण में एक वृद्धि हुई ब्याज11,12 . लियू एट अल. एक papain और sciatic नसों और DRGs 21G और 23G का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से तंत्रिका की 1 सेमी अनुभाग के रूप में छोटे विश्लेषण के लिए प्रयोग विधि विकसित की है, जिससे विशिष्ट साइटों से तंत्रिका सामग्री के विश्लेषण के लिए अनुमति की चोट11. यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है जब पीएन पर प्रभाव प्रणालीगत होने की उंमीद है, के रूप में न्यूरोपैथी के neurotoxicology और आनुवंशिक मॉडल में या मधुमेह जैसे पुराने रोगों में । sciatic तंत्रिका से प्राप्त nucleated कोशिकाओं की कम उपज के कारण, यह एक व्यक्ति माउस से ≤ १०० gated घटनाओं के साथ छोटी आबादी का अध्ययन करने का प्रयास करने के लिए अनुशंसित नहीं है । हालांकि, कई चूहों से सामग्री का पूलिंग तंत्रिका के भीतर ऐसी छोटी आबादी के अध्ययन की सुविधा होगी । फिर भी, यह ब्याज की जांच करने के लिए होगा कि क्या एंजाइमी ऊतक papain और 21G का उपयोग कर पृथक्करण/23G सुई लियू एट अल द्वारा वर्णित है । 11 नाभिक के धुंधला cytometry प्रवाह के साथ जोड़ा जा सकता है, के रूप में इस अध्ययन में वर्णित है, एकल कोशिकाओं की उपज बढ़ाने के लिए । ऊतक की बहुत छोटी मात्रा का विश्लेषण करने की क्षमता ipsi के बीच तुलना प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है-और contralateral DRGs एकतरफा sciatic तंत्रिका axotomy के बाद । हालांकि, यह इस अध्ययन के दायरे से बाहर है । दिलचस्प है, मैक्रोफेज की पहचान के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्करों चूहों के पीएन में एक अप्रत्याशित विषम अभिव्यक्ति है पाया गया । उदाहरण के लिए, CD11b और F4/80 दोनों sciatic तंत्रिका और DRGs में गैर-टेम, गैर प्रतिजन कोशिकाओं को पेश करने का एक बड़ा अनुपात पर व्यक्त किया जा पाया गया । इसके अलावा, sciatic नसों में नहीं, सभी CD68+ मैक्रोफेज व्यक्त CD11b और F4/80, के रूप में अंय अंगों के अध्ययन से उंमीद की गई होगी । इसलिए यह सिफारिश की है कि सावधानी जब पीएन में मैक्रोफेज के अध्ययन के लिए इन मार्करों का उपयोग कर लिया है और उस CD163 के रूप में अंय मार्करों, जांच की जानी चाहिए । इसके अलावा, एंजाइमी पृथक्करण के लिए अलग मार्कर की संवेदनशीलता भी इस शायद अभिव्यक्ति में मनाया मतभेदों के लिए एक स्पष्टीकरण के रूप में स्थापित किया जाना चाहिए, जैसे CD11b या F4/80 के साथ के रूप में ।

इस प्रोटोकॉल पहले streptozotocin (STZ) के साथ विषाक्त चुनौती के बाद पीएन में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है13, एक रासायनिक आमतौर पर मॉडल कुतर जीवों में मधुमेह के प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया । यह दिखाया गया है कि STZ, जो दोनों TRPV1 और TRPA1 सक्रिय, शुरू में दोनों sciatic तंत्रिका और DRGs में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कमी का कारण बनता है, जबकि तंत्रिका में कोई सूजन पैदा नहीं । हालांकि DRGs बरामद में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और विशेष रूप से मैक्रोफेज अभी भी काफी तीन सप्ताह के बाद विषाक्त चुनौती समाप्त हो गया । यह बाद में कल्पना की थी कि तंत्रिका मलबे के macrophage phagocytosis, आयन चैनल hyperexcitability द्वारा चोट से उत्पन्न मैक्रोफेज के apoptosis के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, सामान्य कोशिका जनसंख्या से उनके घट में जिसके परिणामस्वरूप. यह ज्ञात नहीं है कि कैसे अंय परिधीय तंत्रिका विषाक्त पदार्थों तंत्रिका निवासी मैक्रोफेज को प्रभावित । यदि मैक्रोफेज की कमी ऐसे एजेंटों इस उपचार के लिए निहितार्थ हो सकता है की एक आम परिणाम है ।

यह पाया गया कि तंत्रिका से nucleated कोशिकाओं के केवल 5-10% टेम मूल के ल्यूकोसाइट्स थे । शेष कोशिकाओं संभवतः अंय तंत्रिका कोशिका प्रकार, अर्थात् Schwann कोशिकाओं, pericytes, fibroblasts, और endothelial कोशिकाओं का एक मिश्रण है । कारण प्रवाह cytometry प्रणालियों की क्षमता के लिए कई मापदंडों को मापने और प्रदान कि वहां विशिष्ट मार्करों और/या एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, यह कल्पना है कि इन कोशिकाओं के प्रकार भी इस पद्धति का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । इस विधि murine सामग्री के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि, कुछ संशोधनों के साथ, यह भी सुअर से और मानव से पीएन सामग्री के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह पूर्वानुमानित है कि यह विधि, भविष्य में, चूहों से बड़ी प्रजातियों से सामग्री के विश्लेषण के लिए अधिक उपयोगी होगी ।

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Disclosures

इस अध्ययन के संबंध में लेखकों के हित का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था (DFG; SFB1118) । लेखक विच्छेदन के सबसे प्रदर्शन और सहायक इस ज्ञान संचारण के लिए एक्सल Erhardt शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और प्रवाह cytometer के तकनीकी पहलू में सहायता के लिए डॉ Volker Eckstein ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Mouse Charles River C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) Thermo 31885023 The source of this material is not important
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Collagenase Type 4 Worthington Biochemical Corp., US LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I Sigma-Aldrich DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated Sigma-Aldrich F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 Biolegend 101228 Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated Biolegend 107603 Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647 Biolegend 107603 Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC Biolegend 137007 Clone FA/11
Antibody against CD206-PE Biolegend 141706 Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7 Biolegend 123113 Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7 Biolegend 405206 Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP Biolegend 405213 Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100 Sigma-Aldrich T8787
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve - tissue grinder kit Sigma-Aldrich CD1
V-Shaped, 96-well plates Greiner/Sigma M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm BD Biosciences 352008
60x15mm petri dish Greiner/Sigma Z643084
BD LSR II Flow Cytometer BD Biosciences

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३० प्रवाह cytometry माउस sciatic तंत्रिका macrophage सूजन ल्यूकोसाइट्स न्यूरोपैथी
एकल Sciatic नसों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विश्लेषण और एक एकल माउस से पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि प्रवाह का उपयोग कर Cytometry
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Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (130), e56538, doi:10.3791/56538 (2017).

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