Analyse av immunceller i enkelt Sciatic nerver og Dorsal Root Ganglion fra en enkelt mus med flowcytometri

Summary

Kvantitativ analyse av celleinnholdet i murine sciatic nerve er vanskelig på grunn av knapphet på vevet. Denne protokollen beskriver en metode for vev fordøyelsen og forberedelse som gir nok celler for flyt cytometri analyse av immun celle populasjoner fra nerver av personlige mus.

Abstract

Nerve-resident immunceller i perifere nervesystemet (PNS) er avgjørende for å opprettholde nevronale integritet i en sunn nerve. Immunceller av PNS påvirkes av skader og sykdom, påvirker nerve funksjon og kapasiteten for gjenfødelse. Neuronal immunceller analyseres vanligvis av immunofluorescence (hvis). Mens hvis er viktig for å bestemme plasseringen av immunceller i nerve, hvis er bare semi kvantitative og metoden er begrenset til antallet indikatorer som kan analyseres samtidig og graden av overflaten uttrykk. I denne studien ble flowcytometri brukt kvantitativ analyse av leukocytter infiltrasjon i sciatic nerver eller dorsal root ganglions (DRGs) av personlige mus. Enkelt celle analyse var utført ved hjelp av DAPI og flere proteiner ble analysert samtidig overflate eller intracellulær uttrykk. Begge sciatic nerver fra en mus som ble behandlet i henhold til denne protokollen generert ≥ 30.000 enkelt kjerne hendelser. Andelen av leukocytter i sciatic nerver, bestemmes av uttrykk for CD45, var ca 5% av totale celleinnholdet i sciatic nerve og ca 5-10% i DRG. Selv om denne protokollen fokuserer primært på immun celle befolkningen i PNS, betyr fleksibiliteten til flowcytometri måle en rekke indikatorer samtidig at de andre celler populasjonene stede i nerve, som Schwann celler, pericytes , fibroblaster og endotelceller, kan også analyseres ved hjelp av denne metoden. Denne metoden gir derfor en ny måte for å studere systemiske effekter på PNS, som neurotoxicology og genetisk modeller av neuropathy eller kroniske sykdommer som diabetes.

Introduction

Immunceller som angir PNS fra sirkulasjonen, bidra som definert av uttrykk for CD45 og CD11b, til å opprettholde integriteten til nerve og spille en rolle både i gjenfødelse og degenerasjon¹. Makrofager (definert av deres uttrykk for CD68 i mus) kan være forskjøvet mot en inflammatorisk fenotype, uttrykke mer MHC klasse II og CD86 på overflaten deres (M1) eller mot en anti-inflammatorisk fenotype, uttrykke mer intracellulær CD206 (M2)² . Forvrenger av macrophage fenotypen er en dynamisk prosess regulert gjennom Akt signalering³, som reflekterer ulike oppgaver makrofager i forsvar mot patogener (M1) og rolle i vev gjenfødelse (M2). Regenerering av en skadet nerve først krever fagocytose av myelin rusk makrofager i nerve^4,5, og anti-inflammatorisk (CD68⁺CD206⁺) M2 makrofager har vist seg å fremme axon utvekst i den PNS⁶. Redusert rekruttering eller makrofager til PNS, eller nedsatt evne til fagocytose kan føre til nedsatt regenerasjon og vedlikehold av nerve integritet. Inflammatorisk M1 makrofager, uttrykke MHC, klasse II er mindre i stand til fagocytose enn M2 makrofager og neuronal betennelse er involvert i patogenesen av flere nevrodegenerative sykdommer⁷.

Endringene skje til nerve bosatt immunsystem at skader kan være kvantitativ, manifestert i tap av CD45⁺ leukocytter (eller økt infiltrasjon av CD45⁺ leukocytter i tilfelle betennelse), eller kvalitative, som endring av macrophage fenotypen fra M2 til M1 fenotypen. Immunceller av PNS er tradisjonelt analysert ved hvis frosne snitt eller parafin-embedded materiale⁸. Hvis er nødvendig for å avgjøre lokaliseringen av cellene rundt. Imidlertid bruker kvantifisering bruker hvis ofte teller et relativt lite antall celler i en smal del av vev, gjør kvantifisering upålitelig og sårbare for utvalget bias. Identifikasjon av bestemte undergrupper av immunceller kreves samtidig påvisning av ekstracellulære og/eller intracellulær markører, mens fastsettelse av macrophage fenotypen krever minst to markører, spesielt CD206 og MHC klasse II. Som oftest tilgjengelige mikroskop er begrenset til minst to-farge kanaler, som fluorescein isothiocyanate (FITC) og phycoerythrin (PE), kan karakterisering av de spesifikke delsettene av immunceller hvis være restriktiv og ufullstendig, krever behovet for å ha flere lysbilder, avledet fra samme område av interesse, som er farget og analysert parallelt. Dette tidkrevende aspektet derfor ikke nødvendig egner seg til analyse av store Prøvesett. Videre, som de fleste av markørene av interesse er ekstracellulære, gjenkjenningen i vev, som enten er innebygd i parafin eller cryoconserved, kan være problematisk avbrudd i membranen integritet og maskering av epitoper og tap av antigener interesse fra bruk av løsemidler, for eksempel aceton eller metanol⁹.

Derimot flow cytometri, som måler optisk og fluorescens kjennetegner enkeltceller i suspensjon idet de passerer gjennom en stråle av lys, gir en mer praktisk og omfattende hjelp for analyse av celle populasjoner. Flowcytometri, i stedet for å produsere et digitalt bilde av vevet, gir en automatisert kvantifisering av angi parametere, som inkluderer en Celles relative størrelsen og reflekterende indeksen, kalles frem scatter (FSC), detaljnivå/intern kompleksitet eller side-xy (SSC) og relativ fluorescens intensitet, gir at cellen har blitt merket med en riktig fluorophore, for eksempel et konjugert antistoff. En typisk flyt cytometer består av to, luftkjølt lasere; en argon laser produserer blått lys på 488 nm og en helium-neon laser produserer lys i 633 nm. Denne kombinasjonen muliggjør av måling, samtidig, minst fem mål på overflaten eller innen til intracellulær kupeen. Mer avanserte flyt cytometers kan bestå av flere lasere, som tillater påvisning av opptil åtte ulike fluorochromes samtidig, gir at peak utslipp bølgelengder av de valgte fluorochromes ikke overlapper betydelig.

For analyse av flowcytometri, må vevet rundt først være enzymatisk fordøyd, vanligvis med collagenase, generere en enkeltcelle suspensjon. Analyse av murine sciatic nerver har tidligere vært vanskelig på grunn av den lille mengden av vev innhentes fra hver musen. I tillegg til høyt fettinnhold av myelin rundt axons hemmer celle utvinning og produserer store mengder avfall. Metoden beskrevet her for ischias nerven forberedelse og fordøyelsen ble tilpasset fra Schwann celle isolasjon protokollen for Barrette et al. ⁷og har som mål å isolere nok celler fra nerver av personlige mus for flyt cytometri analyse, for å redusere variasjon mellom mus. Bruke DAPI til å identifisere enkeltceller i rå vev fordøye omgår måtte fjerne axon rusk, som ofte fører til tap av cellen. Vask flere ganger med en detergent-rik buffer aids i utgivelsen av celler fanget i fet rusk, og dermed øke avkastningen. Fordøyelsen av både full lengde sciatic nerver fra et enkelt museklikk etter denne protokollen genererer ≥30, 000 enkelt kjerne hendelser og 3 ganger dette nummeret hentes fra DRG. Andelen CD45⁺ leukocytter var ca 5% av totale celleinnholdet i sciatic nerve fordøye og ca 5-10% i DRG fordøye. Fleste av CD45⁺ celler i sciatic nerve uttrykt macrophage markører, CD68 og CD206.

Protocol

Vill-type C57BL/6 mus (menn, 10-12 uker) ble holdt i standard 12t lys/mørke syklus og ble gitt standard chow kosthold og vann. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante retningslinjene av lokale Animal Care og bruk komité og godkjent av lokale Animal Care og bruk komiteen på det regional myndigheten i Karlsruhe, Tyskland (G216/10).

1. perfusjon av musen

1. Ofre musen (C57BL/6; Menn; 10-12weeks) med CO₂ eller i samsvar med lokale bestemmelser.
   Merk: Retro-orbital blødning kan utføres for å få kontroll leukocytter, med EDTA-belagt 1,5 mL rør. Denne metoden for blødning er bare effektiv umiddelbart etter offer. Videre, peritoneal hulrom lavage (PCL) kan utføres for å få kontroll makrofager, bruker forvarmet PBS på 37 ° C for å unngå kalde agglutinerende blod, som kan hemme perfusjon.
2. Desinfiser musen ved sprøyting pels på magen rikelig med 70% v/v etanol og gjentatte ganger tørke med en vev med bomull gasbind. Bruke sløv saks, kuttet åpner abdominal huden med en langsgående snitt.
3. Utsett pleural hulrommet ved først å gjøre et snitt i mellomgulvet med buet, sløv saks og deretter utvide i snitt langs hele lengden av ribbe buret. Gjøre en lignende kutt på kontralateral side til sternum kan være forsiktig løftet bort.
4. Med et klart syn på hjertet og store fartøyene, setter en sommerfugl 23¾ måle nål, koblet til en 50 mL sprøyte fylt med iskald PBS, i venstre kammeret av hjertet.
5. Gjør et snitt til høyre atriet av hjertet med iris saks for å opprette i en stikkontakt som mulig uten å skade den synkende aortabuen, og deretter trykker forsiktig sprøyten for å presse gjennom ca 30 mL PBS. Sårvæske bør kjøre klart. Clearing av leveren eller nyrene kan brukes som en indikator på en god perfusjon.

2. Disseksjon av ischias nerven og DRG

Merk: For dissection på sciatic nerver, huden over gluteus maximus fjernes og musen er plassert ventral side ned mens strekker ut beinlidelser.

1. Bilateralt dissekere hele sciatic nerver ved å skille muskelvev fra den øvre rygg lår og oppfølging nerve langs ryggraden. Kuttet nerve der den kommer ut fra ryggraden og umiddelbart ovenfor kneet i den andre enden.
   Merk: Unngå overdreven håndtering av nerve som knusing eller trekke med tang.
2. Bruke pinsett, overføre forbrukeravgift nerve(s), ca 2 cm per nerve, til en 1,5 mL tube som inneholder 1 mL av iskalde PBS og butikk på is.
   Merk: Nerve kan lagres over natten på is.
   Merk: For DRG dissection, tang og skalpell, løsne huden fra underliggende bløtvev ved forsiktig peeling av gjenværende tilbake huden å avsløre cervical thorax og lumbale spinal regionene. Fjerne hodet ved å klippe ved foten av skallen med en stump saks.
3. Kuttet ribbeina parallelt med og ryggraden på begge sider, før frakobling viscera koblet til den fremre siden av ryggraden. Kutt femurs og fjerne ryggraden ved en tverrgående kuttet på nivå med femurs. Bruker iris saks, kuttet bort noen muskler, fett og andre myke vev fra ryggraden.
4. Plasser ryggraden med dorsal side vendt oppover, og åpne den, fra caudal slutten, ved å skyve et tips av saksen inn i vertebral kanalen på tre o'clock posisjon og bein snipped. Gjenta på 9 o'clock posisjon.
   Merk: Det er viktig å kutte nøyaktig i sentrum for å unngå å skade DRG.
5. Gjenta kutte fra side til side til til rostral slutten og ryggmargen er fullt eksponert. Bruker disseksjon mikroskop, fjerne ryggmargen å avsløre spinalnerver, som kan brukes til å finne DRGs i ryggraden.
6. Fjerne de lumbal DRGs ved forsiktig dra på dorsal root å trekke DRG inn vertebral kanalene, deretter klipping nerver og bindevev med iris saks å fjerne DRGs.
   Merk: Det er mulig å begrense samlingen til L4-L6-DRG som bidrar til sciatic nerve.
7. Ved hjelp av pinsett, overføre DRGs til en 1,5 mL tube som inneholder ca 1 mL av iskalde PBS og lagre på is.
   Merk: Nerve kan lagres over natten på is.

3. fordøyelsen av ischias nerven og DRG

1. Forberede fordøyelsen media (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL collagenase Type 4) med 100 µg/mL av deoxyribonuclease og lagre på is.
   Merk: Mengden fordøyelsen medium må etter musen (sciatic nerver + DRGs) er 1 mL. Når forberedt, kan dele fordøyelsen media lagres på 20 ° C.
2. Overføre sciatic nerver og DRGs fra en mus i separate 1,5 mL rør som inneholder 500 µL av fordøyelsen media. Sciatic nerver, hogge materialet i 15-20 biter med våren saks og deretter ruge av vev suspensjon i en risting inkubator på 37 ° C for 20 min med mild agitasjon (≤ 450 rpm).
3. Gjentatte triturate celle suspensjon gjennom 1000 µL pipette tips til mekanisk distansere noen ufullstendig fordøyd vev.
   Merk: Hvis suspensjon er vanskelig å sjarmere, deretter kuttet pipette spissen med saks til å opprette en stump slutt. Inkuber vev suspensjon på 37 ° C for 20 min med mild agitasjon (≤ 450 rpm).
4. Gjenta føden gjennom et 1000 µL pipette tips og ruge for ytterligere 10 min på 37 ° C med mild agitasjon (≤ 450 rpm).
5. Forberede FACS bufferen (PBS med 10% FCS og 1 mM EDTA) og lagre på is. Skyll og suge en rustfritt stål skjerm maske størrelse på 140 µm med FACS buffer i 60 x 15 mm Petriskål på is.
   Merk: Nylon skjermen filtre bør unngås som det fører til en betydelig tap i avkastningen fra kjerne celler.
6. Gjentatte ganger passere vev suspensjoner 140 µm skjermen filteret, som ble holdt over Petriskål, med sløv tang, på is. Samle celle suspensjon fra Petriskål og overføre den til en ny 1,5 mL tube lagret på is.
7. Trykk en ufullstendig fordøyd vev som gjenstår på filteret gjennom av gjentatte føden med 1000 µL pipette tips. Skyll skjermen filteret to ganger med 500 µL FACS bufferen og samle resulterende celle suspensjon i Petriskål kombinere med cellen suspensjon fra trinn 3.6.
   Merk: Hvis flyt cytometer brukt er følsomme for rusk, celle suspensjon fra trinn 3.7 kan sendes gjennom en 70 µm skjermen filter; Dette kan imidlertid føre til tap i avkastningen fra kjerne celler.
8. Virvel av cellen suspensjon på 300 x g i 5 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i 1 mL av FACS buffer. Repeter dette vask en gang.
9. Resuspend celle pellet i 150-350 µL av FACS buffer, avhengig av antall flekker som er nødvendig (150 µL FACS buffer per flekker panel).

4. farging av ischias nerven og DRG med Fluorescently merket antistoffer for flowcytometri

1. Overføre 100 µL av ischias nerven eller DRG celle suspensjon i en V-formet i en 96-brønns plate på is.
   Merk: Single-farget celler er nødvendig for alle antistoffer brukt som de vil gi nødvendig kontrollene for å sette opp flowcytometri med hensyn til photomultiplier tube (avdrag) spenning gevinster og kompensasjon, samt å hjelpe skille bestemt fra Uspesifisert binding. På grunn av begrenset materialet tilgjengelig fra ischias nerven og DRGs, blod leukocytter og makrofager fra PCL (trinn 1.1-1.2) kan brukes som single-farget kontrollene, den flekker for som skal utføres parallelt med den flekker av i sciatic nerve og DRGs.
2. Bassenget gjenværende celler suspensjoner (ca 50 µL per prøve) fra enten sciatic nerver eller DRG prøver, som en unstained kvinne kontroll.
3. Sentrifuge platen på 400 x g i 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting av snu platen over en hylle og bruke en skarp flick av håndleddet, og forsiktig trykk tørr på papirhåndklær.
4. Overflate flekk, resuspend hver celle pellets i 20 µL FACS bufferen som inneholder antistoffer rundt (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 og MHC klasse II-Biotin) og ruge, beskyttet fra lys, på is 30 min.
   Merk: (1) optimale antistoff fortynning bør være bestemt før bruk ved å utføre en fortynning serie etter produsentens produktinformasjon; (2) Non-spesifikke stainings reduseres ved inkubasjon Fc-blokk på dette trinnet i henhold til produsentens instruksjoner; og (3) Isotype kontroll stainings er vanligvis ikke nødvendig ved primære antistoffer direkte konjugert med et fluorophore og/eller når antigen(s) rundt produsere forskjellige populasjoner.
5. Legge til 130 µL FACS bufferen i hver brønn og sentrifuge platen på 400 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting som beskrevet tidligere (trinn 4.3) og vaske celle pellets to ganger med 150 µL FACS bufferen.
   Merk: Hvis du bruker et unconjugated primære antistoff eller en primær antistoff konjugert til biotin, deretter en passende sekundære reagens, konjugert til en fluorophore, kan legges på dette punktet og trinnene 4.4-4.5 gjentas. I denne protokollen, ble streptavidin-PE/Cy7 eller Streptavidin-PerCP brukt til å oppdage MHC klasse II i kombinasjon med CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 eller i kombinasjon med CD68-APC og F4/80-PE/Cy7, henholdsvis.
6. For fiksering, etter siste vask trinn, resuspend celle pellets i 100 µL av 4% paraformaldehyde i PBS (pH 7.4). Ruge plate is 10 min og deretter virvel 400 x g i 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting som beskrevet tidligere (trinn 4.3) og vask celle pellets gang med 150 µL FACS bufferen.
   Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig; Bruk passende beskyttelse som hansker og briller, etc.
   Merk: Resuspend cell pellets i 150 µL av FACS buffer og store beskyttet mot lyset, på 4° C i opptil to dager. Hvis ingen intracellulær flekker, går videre til trinn 4.11 etter sentrifugering platen på 400 x g i 5 min på 4 ° C.
7. Intracellulær flekker, resuspend celle pellets i 150 µL av FACS buffer+0.5% vaskemiddel og ruge i romtemperatur, beskyttet mot lyset for 15 min. sentrifuge platen på 400 x g for 5 min på 4 ° C. Forkaste nedbryting som beskrevet tidligere (trinn 4.3) og vask celle pellet gang med 150 µL av FACS buffer + 0,5% vaskemiddel. Resuspend celle pellet i 20 µL av FACS buffer+0.5% vaskemiddel som inneholder antistoffer rundt (CD68-APC, CD206-PE) og ruge, beskyttet fra lys, ved romtemperatur for 30 min.
8. Legge til 130 µL av FACS buffer+0.5% vaskemiddel i hver brønn og sentrifuge platen på 400 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting som beskrevet tidligere (trinn 4.3) og vaske celle pellets to ganger med 150 µL av FACS buffer + 0,5% vaskemiddel.
   Merk: Hvis du bruker et unconjugated primære antistoff eller en primær antistoff konjugert til biotin, deretter en passende sekundære reagens, konjugert til en fluorophore, legges på dette punktet og trinnene 4.9-4.10 gjentatt.
9. Resuspend celle pellets i 150 µL av FACS buffer + 0,5% vaskemiddel og store, beskyttet mot lyset, på 4 ° C i opptil to dager.
10. Resuspend celle pellets med 150 µL FACS buffer + 0,5% vaskemiddel med 5 µg/mL DAPI og ruge i 5 min i romtemperatur, beskyttet mot lyset. Sentrifuge platen på 400 x g i 5 min på 4 ° C. Kast nedbryting som beskrevet tidligere (trinn 4.3).
11. Resuspend celle pellets i 150 µL av PBS og overføre til en hensiktsmessig merket FACs rør. Lagre i romtemperatur, beskyttet mot lyset, til du er klar for analyse.
    Merk: Etter rørets i PBS, cellene bør analyseres innen timer siden av DAPI vil sakte dissociate fra DNA, fører til tap i signal.

5. oppsett av flowcytometri og kjører av prøver

1. Kontroller at flyt-cytometer er utstyrt med de aktuelle lasere og/eller filter angir måle fluorophores brukt stain cellene. Dette kan fastsettes under cytometer standardkonfigurasjonen på systemet. I denne protokollen, celler ble analysert ved hjelp av en flyt cytometer utstyrt med tre lasere (405 nm, 488 nm og 633 nm) tillater for påvisning av ≤ 5 fluorophores.
2. Velg den aktuelle kanaler for gjenkjenning av fluorophores rundt. Alle fluorescerende signaler oppdages best med logaritmisk forsterkning.
3. Velg en passende infusjonshastigheten for prøvene. Denne parameteren kan variere avhengig av systemet brukes og bør fastsettes empirisk. I denne protokollen, ble en strømningshastighet på MED å HI (35-60 µL/min) brukt til å forhindre tilstopping av nålen.
4. Velg antall hendelser/celler inn per prøve. Minimum antall hendelser skal 1,000,000.
5. Opprette scatter tomter under en globale regnearket av SSC-A versus FSC-en, også for hver fluorophore rundt versus FCS-A. Opprette en statistisk visning som viser antall hendelser og mener fluorescerende intensiteten (MFI) for den valgte fluorophores.
6. Sett spenningen av FSC-A og SSC-A kanalene, slik at de minste cellene passer inn i nedre venstre 10% av spredningsdiagram. Fastslå bakgrunn fluorescens og minimum eksempel fluorescens fra unstained kvinne kontrollene fra enten sciatic nerver eller DRGs. Bestem overordnede (P1) porten basert på scatter plot fra DAPI-bare flekker kontroller.
   Merk: Dette er ikke en samling gate, skyldes delvis til heterogene natur befolkningen DAPI + i PNS.
7. Bruke FSC scatter tomter for hver av fluorophores rundt, justere spenninger slik at cellene i kontrollen unstained kvinne faller innenfor den nedre kvarteret i sine respektive scatter tomter. Gates opprettes deretter over dette området til å definere celler som er positivt for hver av de respektive markører/fluorophores. Plasseringen av en gate er bekreftet ved å kjøre i kontrollen single-farget (trinn 4.1).
   Merk: Kompensasjon for overlappende utslipp spectra kan utføres på dette punktet eller brukt ettertid med riktig analyseprogramvare.
8. Når flyten cytometer har blitt satt opp, som beskrevet, kan prøvene kjøres.
9. Etter kjøre, resterende utvalget materialet kan kastes og FCS filene kan eksporteres for videre analyse.

Representative Results

Cellen suspensjoner fra både full lengde sciatic nerver og alle større DRG ble forberedt, i henhold til protokollen, fra seks sunn C57BL/6 mus og delt inn i tre like dele til farging. Counter farging med DAPI, som flekker DNA, tillater påvisning av en enkelt celle befolkningen (figur 1A-B, øvre panel). Vaske ut DAPI, før analyse av flowcytometri, redusert grad fluorescerende intensiteten av ikke-nucleated rusk, som tillater valget av en diskret befolkning over den FSC-aksen enkelt-nucleated hendelser eller singleter. Ingen samling porten brukes som singleter fra PNS distribueres over et stort utvalg av FSC og SSC (figur 1 c). Materialet på den høye enden av FSC aksen, som inneholder ufullstendig fordøyd vev, utelates i valg av befolkningen singlet (figur 1A-B). Bruke en tetthet tomt (nedre panel) vise resultatene kan lette i utelukkelse av store rusk (nedre panel). Totalt ≥ 30.000 singleter regelmessig kan fås fra to full sciatic nerver og ≥200, 000 singleter kan fås fra DRGs (figur 1 d). Fra sciatic nerver uttrykt ca 5% av singleter CD45 på overflaten deres, mens ca 5-10% ble funnet i DRGs, og dermed definere disse cellene som leukocytter blodkreft opprinnelse (figur 2A).

Et flertall av CD45⁺ singleter også uttrykt MHC, klasse II, i en gradvis måte (figur 2B). I DRGs, kan CD11b brukes til å oppdage microglial-lignende celler (CD45^dimMHCII⁺ og CD11b⁺) (figur 2B, øvre panel). Imidlertid denne microglia befolkningen er fraværende fra sciatic nerver (figur 2B, nedre panel). Et flertall av singleter uttrykke CD45 i PNS er CD68⁺ makrofager. Den ischias nerven og DRG, 2-5% av singleter uttrykt CD68 (figur 3A). Alle celler som uttrykker CD68 også uttrykt CD45 (data ikke vist). I DRGs, CD68⁺ makrofager ble stadig mer uensartet i sitt uttrykk av både MHC klasse II og CD206, en markør for M2 makrofager, enn i sciatic nerver (figur 3B-D). I sciatic nerver, de fleste makrofager co uttrykt MHC klasse II og CD206 (figur 3B-D, nedre paneler); vanligvis ca 60-80% av CD68⁺ makrofager uttrykt CD206, mens en mindre andel av CD68⁺ co-uttrykkes CD206 i DRGs (figur 3B). Interessant, M1 macrophage markøren CD86 ikke generere noen positiv flekker verken på makrofager fra nerve eller fra PCL (data ikke vist). Den macrophage markøren, F4/80, viste en heterogen uttrykk i DRG og i sciatic nerver (figur 3B-C), flekk en andel av CD68^- og MHCII^- celler. Videre F4/80 uttrykk ikke fullt overlapper med CD68 uttrykk.

Figur 1: representant data fra flyt cytometri analyse av DAPI-farget nucleated celler fra DRG og ischias nerven. Alle hendelser samlet, vises som scatterplots (øvre panel) eller tetthet tomter (nedre panel), fra (A) DRG eller (B) ischias nerven (SN) av en representant musen. Pilene i den nedre paneler angir porten, unntatt materialet øverst FCS aksen. (C) tilbake-gating cellene samles i DAPI-porten (singleter), vist i panel (A) på SSC vs FSC spredningsdiagram. (D) antall singleter fra både SN og alle større DRG fra seks sunn C57BL/6 mus. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: flyt cytometri analyse av overflaten uttrykk for CD45, MHC, klasse II, og CD11b på singleter DRG og ischias nerven. Hendelser som er valgt i den DAPI-gate (singleter) som vist i figur 1 ble analysert. (A) andelen singleter uttrykke CD45 i sciatic nerve (SN) og DRG fra seks kontroll mus. (B) representant scatter tomter av singleter DRG (øvre panel) og SN (nedre panel). Celler som uttrykker CD11b angis med blått. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Flow cytometri analyse av overflaten uttrykk for CD68, MHC, klasse II, og CD206 på singleter DRG og ischias nerven. Hendelser som er valgt i den DAPI-gate (singleter) som vist i figur 1 ble analysert. (A) andelen singleter uttrykke CD68 i sciatic nerve (SN) og DRGs fra seks sunn C57BL/6 mus. (B) andel av CD68⁺ makrofager co uttrykke CD206 i SN og DRG fra seks sunn C57BL/6 mus. (C) representant scatter tomter singleter DRG (øvre panel) og SN (nedre panel) viser CD68 og MHC klasse II uttrykk. (D) representant scatter tomter singleter DRG (øvre panel) og SN (nedre panel) viser CD68 og CD206. Celler som uttrykker F4/80 angis med magenta farge. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Sciatic nerver inneholder en stor andel av lipider, som kolesterol, på grunn av innholdet i myelin rundt axons. Siden Egenskaper for lipider endrer seg med temperaturen, kan ulike resultater oppnås ved forskjellige temperaturer. For å sikre cellen bevaring, ble alle trinn i denne protokollen etter fordøyelsen utført på isen. Mens konsistens anbefales for reproduserbarhet resultatene, kan det være mulig å øke avkastningen ved å utføre trinn 3.6 og 3.7 ved romtemperatur. Hvis nervene trinn 3.8 ikke har vært tilstrekkelig fordøyd, vil små biter av nerve være synlig på nettet. Hvis mangelfull fordøyelsen, kan materialet beholdt på nettet være nytt fordøyd ved å overføre til en ny 1,5 mL tube med 250 µL av fordøyelsen medier og gjentatt trinn 3.2-3.6. Hvis avkastning er dårlig, og et utvalg av cellen suspensjon, etter passerer gjennom mesh skjermen (trinn 3.6) skal vises under et lys mikroskop med trypan blå. Levedyktig, ikke-blå celler skal vises sammen med stang-lignende strukturer, som er fragmenter av axons. Hvis det finnes noen levedyktig celler, har deretter fordøyelsen forhold og/eller feil deler av materialet forårsaket nekrose. Hvis bare store aggregater er synlig, så anbefales det å samle materiale med sentrifugering og gjenta fordøyelsen (trinn 3.2-3.6).

Flow cytometer analyse av murine sciatic nerver og DRGs er nyttig for spørsmål som involverer hele nerver og flere DRGs. nylig har det vært en økt interesse i analysen av PNS bruker flow cytometri^11,12 . Liu et al. utviklet en metode som bruker papain og mekanisk dissosiasjon sciatic nerver og DRGs bruker 21 G og 23 G spesielt analysere så lite som 1 cm delen av nerve, og dermed slik at analyse av nerve materiale fra bestemte nettsteder skade¹¹. Metoden som presenteres her er anbefalt for bruk når effekten på PNS forventes å bli systemisk, neurotoxicology og genetisk modeller av neuropathy eller kroniske sykdommer som diabetes. På grunn av lav avkastning av kjerne celler fra ischias nerven, anbefales det ikke å forsøke å studere små bestander med ≤ 100 gated hendelser fra en enkelt mus. Imidlertid vil av materiale fra flere mus lette studiet av slike små bestander i nerve. Likevel, det ville være av interesse å undersøke om enzymatisk vev dissosiasjon over papain og 21G / 23G pinner beskrevet av Liu et al. ¹¹ kan kombineres med den flyten cytometri flekker av kjerner, som beskrevet i denne studien å forbedre avkastningen av enkeltceller. Muligheten til å analysere svært små mengder vev er avgjørende for å utføre sammenligning mellom ipsi- og kontralateral DRGs etter ensidige sciatic nerve axotomy. Men er dette utenfor omfanget av denne studien. Interessant, ble brukte markører for identifisering av makrofager funnet for å ha et uventet heterogene uttrykk i PNS mus. For eksempel fant CD11b og F4/80 begge uttrykkes på en stor andel av ikke-blodkreft, ikke-antigen presentere celler både ischias nerven og DRGs. Videre i sciatic nerver, ikke alle CD68⁺ makrofager uttrykt CD11b og F4/80, som ville ha vært forventet fra studiet av andre organer. Det anbefales derfor at forsiktighet tas når du bruker disse markørene for studier av makrofager i PNS og at andre markører, som CD163, bør undersøkes. Videre bør følsomheten til de forskjellige merkene til enzymatisk dissosiasjon også opprettes som dette kanskje en forklaring på forskjellene observert i uttrykk, som med CD11b eller F4/80.

Denne protokollen har tidligere blitt brukt til å analysere immunceller i PNS etter giftige utfordringen med streptozotocin (STZ)¹³, et stoff som vanligvis brukes for induksjon av diabetes i modellen gnager organismer. Det ble vist at STZ, som aktiverer både TRPV1 og TRPA1, opprinnelig forårsaker en uttømming av immunceller i både ischias nerven og DRGs, mens ikke forårsaker noen betennelse i nerve. Selv om antall immunceller i DRGs gjenopprettet, immunceller og spesielt makrofager var fortsatt betydelig oppbrukt innlegg tre uker giftige utfordring. Senere var hypotesen at macrophage fagocytose av nerve rusk, som følge av skade av ion kanal hyperexcitability kan ha ført til apoptose av makrofager, som resulterer i utarming deres fra befolkningen generelt cellen. Det er ikke kjent hvordan andre eksterne nerve giftstoffer påvirker nerve bosatt makrofager. Hvis uttømming av makrofager er et vanlig resultat av slike midler har dette implikasjoner for behandling.

Det ble funnet at bare 5-10% av de kjerne cellene fra nerve var leukocytter blodkreft opprinnelsesland. De gjenværende cellene er antagelig en blanding av de andre nerve celletyper, nemlig Schwann celler, pericytes, fibroblaster og endotelceller. På grunn av kapasiteten til flowcytometri er systemer å måle flere parametere og forutsatt at det bestemt markører og/eller antistoffer tilgjengelig, det tenkelig at disse celletyper kan også analyseres ved hjelp av denne metoden. Denne metoden har blitt beskrevet for murine materiale. Men med noen endringer er det også brukt for analyse av PNS materiale fra gris og menneskelig. Det er forventet at denne metoden blir mer nyttig for analyse av materiale fra arter som er større enn mus, i fremtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)	Thermo	31885023	The source of this material is not important
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC	Biolegend	137007	Clone FA/11
Antibody against CD206-PE	Biolegend	141706	Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve - tissue grinder kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Shaped, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences