Summary
Kwantitatieve analyse van de inhoud van de cel binnen de nervus ischiadicus lymfkliertest is moeilijk te wijten aan de schaarste van het weefsel. Dit protocol beschrijft een methode voor de vertering van het weefsel en voorbereiding waarmee voldoende cellen voor stroom cytometry analyse van individuele muizen immuun cel populaties van zenuwen.
Abstract
Zenuw-ingezeten immune cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS) zijn essentieel voor het behoud van de integriteit van de neuronale in een gezonde zenuw. De immuun cellen van de PNS worden beïnvloed door letsel of ziekte, die de functie van de zenuw en de capaciteit voor regeneratie. Neuronale immuuncellen worden vaak geanalyseerd door immunofluorescentie (IF). Terwijl als is essentieel voor het bepalen van de locatie van de immuuncellen in de zenuw, of ligt op semi-kwantitatieve en de methode is beperkt tot het aantal markeringen die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd en de mate van expressie van de oppervlakte. In deze studie, werd stroom cytometry gebruikt voor de kwantitatieve analyse van infiltratie van de leukocyten in de ischiadicus zenuwen of achterwortelganglia ganglion (DRG) van individuele muizen. Eencellige analyse werd uitgevoerd met behulp van de DAPI en verschillende eiwitten gelijktijdig werden geanalyseerd voor oppervlakte of intracellulaire expressie. Beide ischiadicus zenuwen van een muis die werden behandeld volgens dit protocol gegenereerd ≥ 30.000 één genucleëerde gebeurtenissen. Het aantal leukocyten in de ischiadicus zenuwen, bepaald door de uitdrukking van CD45, was ongeveer 5% van de inhoud van de cel Totaal in de nervus ischiadicus en ongeveer 5-10% in de Deutsche Reichsbahn. Hoewel dit protocol richt zich vooral op het immuunsysteem celpopulatie binnen de PNS, betekent de flexibiliteit van cytometry van de stroom te meten een aantal markeringen gelijktijdig dat de andere cellen populaties aanwezig zijn binnen de zenuw, zoals de cellen van Schwann, pericytes , fibroblasten, endotheliale cellen, en kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van deze methode. Deze methode biedt daarom een nieuw middel voor de studie van systemische effecten op de PNS, zoals neurotoxicology en genetische modellen van neuropathie of in chronische ziekten, zoals diabetes.
Introduction
Immune cellen die de PNS uit de omloop genomen invoeren, bijdragen zoals gedefinieerd door de uitdrukking van CD45 en CD11b, tot de integriteit van de zenuw te behouden en spelen een rol, zowel in regeneratie en degeneratie1. Macrofagen (gedefinieerd door hun uitdrukking van CD68 in muis) kunnen worden scheefgetrokken naar een inflammatoire fenotype, uiten meer MHC klasse II en CD86 op hun oppervlakte (M1), of naar een anti-inflammatoire fenotype, uiting geven aan meer intracellulaire CD206 (M2)2 . Scheeftrekken van de macrofaag fenotype is een dynamisch proces geregeld via Akt3signalering, als gevolg van de verschillende taken van macrofagen in de verdediging tegen ziekteverwekkers (M1) en de rol in weefselregeneratie (M2). Regeneratie van een gewonde zenuw vereist eerst fagocytose van myeline puin door macrofagen in de zenuw4,5, en anti-inflammatoire (CD68+CD206+) macrofagen M2 is aangetoond dat het bevorderen van axon uitgroei in de PNS6. Aanwerving of macrofagen teruggebracht tot de PNS, of verminderde capaciteit voor fagocytose kan leiden tot verminderde regeneratie en handhaving van de integriteit van de zenuw. Inflammatoire M1 macrofagen, uitdrukken van de MHC klasse II, zijn minder geschikt voor fagocytose dan M2 macrofagen en neuronale ontsteking is betrokken bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten7.
De veranderingen die aan de resident zenuw-immuunsysteem als gevolg van schade optreden kunnen worden kwantitatieve, manifesteren in verlies van CD45+ leukocyten (of verhoogd infiltratie van CD45+ leukocyten in de zaak ontsteking), of kwalitatieve, zoals wijzigen van macrofaag fenotype van M2 in M1 fenotype. De immuun cellen van de PNS hebben traditioneel zijn geanalyseerd door middel van IF, met behulp van bevroren secties of paraffine-ingebedde materiële8. Indien nodig voor de bepaling van de lokalisatie van de cellen van belang is. Echter kwantificering met behulp van als vaak is gebaseerd op het tellen van een relatief klein aantal cellen in een smalle gedeelte van het weefsel, waardoor kwantificering onbetrouwbaar en kwetsbaar voor selectie bias. Voor de identificatie van specifieke deelverzamelingen van immune cellen is het gelijktijdige detecteren van merkers van extracellulaire en/of intracellulaire vereist, terwijl de vaststelling van het fenotype van de macrofaag vereist ten minste ten minste twee markers, specifiek CD206 en MHC klasse II. Zoals meestal beschikbaar microscopen zijn beperkt tot ten minste twee-kleurkanalen, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en phycoerythrin (PE), kunnen omvat de karakterisering van de specifieke subsets van immune cellen door als beperkend en onvolledig, waarvoor de noodzaak om meerdere dia's, afgeleid van het zelfde gebied van belang, die zijn gekleurd en geanalyseerd in parallel. Dit tijdrovende aspect daarom niet nodig zich leent voor de analyse van grote steekproef sets. Bovendien, zoals de meeste van de markers van belang zijn extracellulaire, de detectie in weefsel, dat is ofwel ingebed in paraffine of cryoconserved, kunnen problematisch vanwege de verstoring van de membraan integriteit en het maskeren van epitopes, alsmede het verlies van de antigenen van belang van het gebruik van oplosmiddelen, zoals aceton en methanol9.
Daarentegen stroom cytometry, die optische meet en fluorescentie kenmerken van afzonderlijke cellen in suspensie als ze passeren een lichtstraal, biedt een meer praktische en uitgebreide middelen voor analyse van de populaties van de cel. Stroom cytometry, in plaats van het produceren van een digitaal beeld van het weefsel, biedt een geautomatiseerde kwantificering van instellen van parameters, waaronder de relatieve omvang en reflecterende index, hierna aangeduid als de voorwaartse scatter (FSC), granulariteit/interne complexiteit van een cel of zijde-scatter (SSC), en de intensiteit van de relatieve fluorescentie, verstrekken dat de cel heeft het label met een geschikte fluorophore, zoals een geconjugeerd antilichaam. Een typisch stroom-cytometer bestaat uit twee, luchtgekoelde lasers; een laser argon produceert blauw licht op 488 nm en een helium neon laser produceert licht aan 633 nm. Deze combinatie kan voor de detectie en meting, gelijktijdig, van ten minste vijf doelstellingen op het oppervlak of binnen het intracellulaire compartiment. Meer geavanceerde flow cytometers kan bestaan uit meerdere lasers, die voorzien in de opsporing van maximaal acht verschillende fluorochromes tegelijk, bieden dat de piek emissie golflengten van de geselecteerde fluorochromes niet aanzienlijk overlappen.
Voor het analyseren van stroom cytometry, moet het weefsel van belang eerst worden enzymatisch verteerd, meestal met collagenase, voor het genereren van een eencellige schorsing. De analyse van lymfkliertest ischiadicus zenuwen eerder moeilijk geweest als gevolg van de kleine hoeveelheid weefsel verkregen elke muis. Bovendien, het hoge vetgehalte van de myeline rond de axonen cel herstel belemmert en produceert grote hoeveelheden puin. De methode voor de voorbereiding van de nervus ischiadicus en spijsvertering hierin beschreven werd aangepast van het protocol van de isolatie van Schwann cel van Barrette et al. 7en wil isoleren genoeg cellen uit zenuwen van individuele muizen voor stroom cytometry analyse, teneinde de variatie tussen muizen. Met behulp van de DAPI voor de identificatie van afzonderlijke cellen in de ruwe weefsel digest omzeilt de noodzaak om te verwijderen van axon puin, die vaak tot verlies van de cel leidt. Wassen meerdere malen met een wasmiddel-rijke buffer aids in de release van cellen gevangen binnen het vette puin, waardoor het rendement. Vertering van beide full-length ischiadicus zenuwen van een enkele muis volgens dit protocol genereert ≥30, 000 één genucleëerde evenementen en ten minste 3 keer dat nummer was ontvangen van de Deutsche Reichsbahn. Het aandeel van de CD45+ leukocyten was ongeveer 5% van de inhoud van de cel Totaal in de nervus ischiadicus digest en ongeveer 5-10% in de DRG-digest. De meerderheid van de CD45+ cellen in de nervus ischiadicus uitgedrukt de macrofaag markers, CD68 en CD206.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wild-type C57BL/6 muizen (mannetjes; 10-12 weken) hielden in standaard 12 h licht/donker cyclus en vrije toegang tot de standaard chow voeding en water werden verstrekt. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtsnoeren door het lokale Animal Care en gebruik Comité en goedgekeurd door het lokale Animal Care en gebruik Comité bij de regionale autoriteit in Karlsruhe, Duitsland (G216/10).
1. perfusie van de muis
- Offer de muis (C57BL/6; Males; 10-12weeks) met behulp van CO2 of in overeenstemming met lokale regelgeving.
Opmerking: Retro-orbitaal bloeden kan worden uitgevoerd om het verkrijgen van controle leukocyten, met behulp van 1,5 mL EDTA-gecoate buizen. Deze methode van bloeden is alleen efficiënt onmiddellijk na het offer. Verdere, peritoneale holte lavage (PCL) kan worden uitgevoerd om het verkrijgen van controle macrofagen, met voorverwarmde PBS bij 37 ° C te vermijden koude agglutinatie van het bloed, die perfusie belemmeren kan. - Desinfecteer de muis door de vacht spuiten op de buik royaal met 70% v/v ethanol en herhaaldelijk vegen met een weefsel met katoen gaas. Met behulp van botte schaar, opengesneden de buikhuid door een longitudinale incisie.
- De spouw van Pleurale bloot doordat een insnijding in het middenrif met behulp van gebogen, botte schaar en vervolgens uit te breiden de incisie langs de gehele lengte van de ribbenkast. Maak een soortgelijk knippen aan de contralaterale zijde tot het borstbeen kan zorgvuldig weg worden opgeheven.
- Met een duidelijk beeld van het hart en de grote schepen, invoegen een dagvlinder 23¾ meten naald, aangesloten op een 50 mL spuit gevuld met ijskoude PBS, in de linker kamer van het hart.
- Maken van een incisie aan de juiste atrium van het hart met iris schaar te maken zo groot van een stopcontact mogelijk zonder beschadiging van de aflopende aorta en dan zachtjes drukken de spuit te duwen door ongeveer 30 mL PBS. De afgescheiden moet duidelijk worden uitgevoerd. Het opruimen van de lever en/of de nieren kan worden gebruikt als een indicator van een goede perfusie.
2. dissectie van de nervus ischiadicus en DRG
Opmerking: Voor de dissectie van de ischiadicus zenuwen, de huid boven de gluteus maximus wordt verwijderd en de muis is gepositioneerd ventrale zijde omlaag terwijl het strekken van de onderste ledematen.
- Bilateraal ontleden de hele ischiadicus zenuwen door het scheiden van het spierweefsel van de dorsale bovenbeen, en volgen de zenuw langs de wervelkolom. Snijd de zenuw waar het verlaten van de wervelkolom en onmiddellijk boven de knie aan de andere kant.
Opmerking: Vermijd buitensporige behandeling van de zenuw zoals breken of trekken met een tang. - Met behulp van Tang, breng de verwijderde nerve(s), ongeveer 2 cm per zenuw, tot een 1,5 mL koker met 1 mL ijskoud PBS en winkel op ijs.
Opmerking: De zenuw kan worden opgeslagen 's nachts op het ijs.
Opmerking: Voor de DRG dissectie, gebruik pincet en een scalpel, loskoppelen de huid van de onderliggende weke delen door voorzichtig peeling uit de resterende terug huid bloot van de cervicale, thoracale en lumbale spinale regio's. Verwijder het hoofd door te snijden aan de onderkant van de schedel met behulp van een botte schaar. - Delen van de ribben parallel met en dicht bij de wervelkolom aan beide zijden, voordat de ingewanden loskoppelen op de voorste kant van de wervelkolom aangesloten. Knip het dijbeen en het verwijderen van de wervelkolom door een dwarse snede op het niveau van het dijbeen. Met behulp van iris schaar, knip weg elke spier, vet en andere zachte weefsels van de wervelkolom.
- Plaatsen van de wervelkolom met de dorsale zijde naar boven en opent u het, vanaf caudal eind, door een tip van de schaar te glijden naar het vertebral kanaal om de drie uur positie en het bot geknipt. Herhaal de procedure op de negen uur positie.
Opmerking: Het is belangrijk om te snijden precies in het midden om te voorkomen beschadiging van de Deutsche Reichsbahn. - Herhaal het snijden van links-naar-rechts totdat de rostraal einde is bereikt en het ruggenmerg is volledig blootgesteld. Met behulp van een Microscoop dissectie, verwijder het ruggenmerg om de spinale zenuwen, die kunnen worden gebruikt om te zoeken van de DRG binnen de wervelkolom bloot te stellen.
- De lumbale DRG verwijderen door zachtjes te trekken op de achterwortelganglia te trekken van de DRG in de vertebral grachten, vervolgens de zenuwen en bindweefsel met iris schaar te verwijderen van de DRG knippen.
Opmerking: Het is mogelijk om te beperken van de collectie aan de L4-L6 DRG, die een bijdrage leveren aan de nervus ischiadicus. - Met behulp van Tang, de DRG overbrengen in een tube van 1,5 mL met ongeveer 1 mL ijskoud PBS, en sla op ijs.
Opmerking: De zenuw kan worden opgeslagen 's nachts op het ijs.
3. de vertering van de nervus ischiadicus en DRG
- De spijsvertering media (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1,6 mg/mL collagenase Type 4) aangevuld met 100 µg/mL deoxyribonuclease, en winkel op ijs bereiden.
Nota: Het bedrag van spijsvertering medium nodig per muis (ischiadicus zenuwen + DRG) is 1 mL. Zodra voorbereid, kunnen aliquots van de spijsvertering-media worden opgeslagen bij-20 ° C. - De ischiadicus zenuwen en de DRG overbrengen van een muis in aparte 1,5 mL buizen met 500 µL van spijsvertering media. Voor de ischiadicus zenuwen, snijd het materiaal in 15-20 stukken met behulp van voorjaar schaar en vervolgens uit te broeden de schorsingen weefsel in een schudden incubator bij 37 ° C gedurende 20 minuten met zachte agitatie (≤ 450 rpm).
- Herhaaldelijk triturate de celsuspensie door 1.000 µL Pipetteer tip om mechanisch distantiëren van eventuele onvolledig verteerd weefsel.
Opmerking: Als de schorsing moeilijk is te Titreer, knip het uiteinde van de pipet met een schaar een botte uiteinde maken. Incubeer de opschorting van de weefsel bij 37 ° C gedurende 20 minuten met zachte agitatie (≤ 450 rpm). - Herhaal de verpulvering via een 1.000 µL pipette uiteinde en incubeer gedurende een verdere 10 minuten bij 37 ° C met zachte agitatie (≤ 450 rpm).
- De FACS buffer (PBS aangevuld met 10% FCS en 1 mM EDTA) voor te bereiden en op te slaan op het ijs. Spoel en geniet van een scherm van roestvrij staal met een maaswijdte van 140 µm met FACS buffer in 60 x 15 mm petrischaal op ijs.
Opmerking: Nylon scherm filters moeten worden vermeden omdat het leidt tot een aanzienlijk verlies in de oogst van genucleëerde cellen. - Herhaaldelijk passeren de schorsingen weefsel het 140 µm scherm filter, zoals het wordt gehouden over de petrischaal, met een botte Tang, op ijs. De celsuspensie van de petrischaal verzamelen en overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis op ijs opgeslagen.
- Duw een onvolledig verteerd weefsel dat op het filter via door herhaalde verpulvering met een 1.000 µL pipette uiteinde blijft. Spoel het scherm filter tweemaal met 500 µL van FACS buffer en verzamelen de resulterende celsuspensie in de petrischaal te combineren met de celsuspensie uit stap 3.6.
Opmerking: Als de cytometer van de stroom gebruikt gevoelig voor vuil is, kan de celsuspensie uit stap 3.7 worden doorgegeven door een 70 µm scherm filter; Dit kan echter leiden tot een verlies in de oogst van genucleëerde cellen. - Centrifugeer de schorsingen van de cel bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL FACS buffer. Deze wassen stap eenmaal herhaald.
- Resuspendeer de pellet cel in 150-350 µL van FACS buffer, afhankelijk van het aantal kleuring die zijn vereist (150 µL FACS buffer per kleuring paneel).
4. vlekken van de nervus ischiadicus en DRG met Fluorescently gelabelde antilichamen voor stroom Cytometry
- Pipetteer 100 µL van de nervus ischiadicus of DRG celsuspensie in een V-vormige goed in een 96-wells-plaat op ijs.
Opmerking: Single-gekleurde cellen nodig zijn voor alle antilichamen gebruikt als zij voor de nodige controles zorgt voor het instellen van de stroom cytometry ten aanzien van fotomultiplicator buizen (PMT) spanning winsten en compensatie, ook om te helpen onderscheiden van specifieke niet-specifieke binding. Als gevolg van de beperkte materiaal beschikbaar zijn vanaf de nervus ischiadicus en DRG, bloed leukocyten en macrofagen van de PCL (stappen 1.1-1.2) kunnen worden gebruikt als de single gebeitste besturingselementen, de kleuring voor die moet worden uitgevoerd in parallel met de kleuring van de ischialgie zenuwen en DRG. - Zwembad de resterende cellen schorsingen (ongeveer 50 µL per monster) uit de ischiadicus zenuwen of DRG monsters, om te dienen als een onbevlekt besturingselement.
- Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant door het omkeren van de plaat over een opslaglocatie en het toepassen van een scherpe beweging van de pols, en zachtjes Tik op keukenpapier droog.
- Voor oppervlakte kleuring, elk van de cel pellets resuspendeer in 20 µL van FACS buffer met de antilichamen van belang (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 en MHC Class II-Biotine) en uit te broeden, beschermd tegen licht, op ijs gedurende 30 minuten.
Opmerking: (1) de optimale antilichaam verdunning moet worden bepaald vóór gebruik door het uitvoeren van een verdunningsreeks volgens product-informatie van de fabrikant; (2) niet-specifieke technieken kan worden verminderd door incubatie met Fc-blok bij deze stap, volgens de instructies van de fabrikant; en (3) Isotype controle technieken zijn over het algemeen niet nodig bij gebruik van primaire antilichamen direct geconjugeerd met een fluorophore en/of wanneer de antigen(s) van belang verschillende populaties produceren. - 130 µL van FACS buffer toevoegen aan elk putje en centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zoals eerder beschreven (stap 4.3) en wassen van de cel pellets tweemaal met 150 µL van FACS buffer.
Opmerking: Als een unconjugated primair antilichaam of een primair antilichaam geconjugeerd met biotine, vervolgens een geschikt secundaire reagens, geconjugeerd met een fluorophore, op dit punt kan worden toegevoegd en stappen 4.4-4.5 worden herhaald. In het geval van dit protocol, werd streptavidine-PE/Cy7 of streptavidine-PerCP gebruikt voor het detecteren van MHC klasse II in combinatie met CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, of in combinatie met CD68-APC en F4/80-PE/Cy7, respectievelijk. - Voor fixatie, na de laatste stap van het wassen, resuspendeer de cel pellets in 100 µL van 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.4). Incubeer de plaat op het ijs gedurende 10 minuten en vervolgens Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant als eerder beschreven (stap 4.3) en wassen van de cel pellets eenmaal met 150 µL van FACS buffer.
Let op: Paraformaldehyde is giftig; Draag passende bescherming zoals handschoenen en bril, enz.
Opmerking: Resuspendeer de cel pellets in 150 µL van FACS buffer en winkel beschermd tegen het licht, bij 4° C voor maximaal twee dagen. Als geen intracellulaire kleuring vereist is, ga dan naar stap 4.11 na centrifugeren van de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. - Voor het intracellulaire kleuring, resuspendeer de cel pellets in 150 µL van FACS buffer+0.5% wasmiddel en Incubeer bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht voor 15 min. Centrifuge de plaat 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant als eerder beschreven (stap 4.3) en de cel pellet eenmaal met 150 µL van FACS buffer + 0,5% wasmiddel wassen. Resuspendeer de pellet cel in 20 µL van FACS buffer+0.5% detergenten die de antilichamen van belang (CD68-APC, CD206-PE) en uit te broeden, beschermd tegen licht, bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- 130 µL van FACS buffer+0.5% wasmiddel toevoegen aan elk putje en centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zoals eerder beschreven (stap 4.3) en de cel pellets tweemaal met 150 µL van FACS buffer + 0,5% wasmiddel wassen.
Opmerking: Als een unconjugated primair antilichaam of een primair antilichaam geconjugeerd met biotine, vervolgens een geschikt secundaire reagens, geconjugeerd met een fluorophore, kan worden toegevoegd op dit punt en stappen 4.9-4.10 herhaald. - Resuspendeer de cel pellets in 150 µL van FACS buffer + 0,5% wasmiddel en winkel, beschermd tegen het licht, bij 4 ° C voor maximaal twee dagen.
- Resuspendeer de cel pellets met 150 µL FACS buffer + 0,5% wasmiddel aangevuld met 5 µg/mL DAPI en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht. Centrifugeer de plaat bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zoals hiervoor is beschreven (stap 4.3).
- Resuspendeer de cel pellets in 150 µL van PBS en overdracht aan een adequaat gelabelde FACs buis. Bewaren bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht, tot klaar voor analyse.
Opmerking: Na hersuspensie in PBS, de cellen moeten worden geanalyseerd binnen enkele uren, aangezien de DAPI langzaam van het DNA distantiëren zal, wat leidt tot een verlies van signaal.
5. installatie van Cytometry van de stroom en de werking van monsters
- Zorgen dat de stroom cytometer is uitgerust met het passende lasers en/of filter ingesteld voor het meten van de fluorophores gebruikt om de cellen vlek. Dit kan worden bepaald onder de standaardconfiguratie van de cytometer op het systeem. In het geval van dit protocol, werden cellen geanalyseerd met behulp van een cytometer van de stroom uitgerust met drie lasers (405 nm, 488 nm en 633 nm) waardoor voor de detectie van ≤ 5 fluorophores.
- Selecteer de passende kanalen voor de detectie van de fluorophores van belang. Alle fluorescerende signalen zijn best met logaritmische amplificatie ontdekt.
- Selecteer een geschikte debiet voor de monsters. Deze parameter kan variëren afhankelijk van het gebruikte systeem en empirisch moet worden bepaald. In het geval van dit protocol, werd een debiet van MED-aan-HI (35-60 µL/min) gebruikt om te voorkomen dat de verstopping van de naald.
- Selecteer het totale aantal gebeurtenissen/cellen worden verzameld per monster. Het minimum aantal gebeurtenissen moet 1.000.000.
- Maken van scatter percelen onder een globale werkblad van het SSC-A versus FSC-A, alsmede voor elke fluorophore van belang versus FCS-A. Een statistische weergave maken waarmee het aantal gebeurtenissen en de gemiddelde TL intensiteit (MFI's) voor de geselecteerde fluorophores wordt weergegeven.
- De spanning van de FSC-A en WS-A kanalen, zo ingesteld dat de kleinste cellen in de onderste linker 10% van de scatterplot passen. Bepalen de achtergrond fluorescentie en minimaal een steekproef fluorescentie van de onbevlekt besturingselementen uit de ischiadicus zenuwen of DRG. bepalen de ouders (P1)-poort op basis van de scatter van alleen-DAPI plot kleuring besturingselementen.
Opmerking: Dit is niet een collectie gate, die gedeeltelijk aan de heterogene aard van de DAPI + bevolking in de PNS. - Met behulp van het FSC-scatter percelen voor elk van de fluorophores van belang, de spanningen aan te passen, zodat de cellen van het Onbevlekt besturingselement vallen binnen het lagere kwartaal van hun respectieve scatter percelen. Poorten worden dan gemaakt boven deze regio te definiëren van de cellen die positief voor elk van de respectieve markeringen/fluorophores zijn. De plaatsing van een poort wordt bevestigd door het uitvoeren van het besturingselement één gebeitste (stap 4.1).
Opmerking: Compensatie voor overlappende emissie spectra kan worden uitgevoerd op dit punt of met terugwerkende kracht toegepast met de juiste analysesoftware. - Nadat de stroom cytometer heeft ingesteld, zoals wordt beschreven, kunnen de monsters worden uitgevoerd.
- Na de run, de resterende monstermateriaal kan worden afgevoerd en de FCS-bestanden kunnen worden geëxporteerd voor nadere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cel schorsingen van zowel full-length ischiadicus zenuwen en alle belangrijke DRG waren voorbereid, volgens het protocol van zes gezonde C57BL/6 muizen en onderverdeeld in drie gelijke porties voor kleuring. Teller kleuring met DAPI, die vlekken van DNA, zorgt voor de detectie van een enkele cel bevolking (figuur 1A-B, bovenste deelvenster). Spoelen van de DAPI, vóór de analyse door stroom cytometry, daalde tot op zekere hoogte de fluorescerende intensiteit van het puin van niet-nucleated, die het mogelijk voor de selectie van een discrete bevolking over de FSC-as van single-nucleated gebeurtenissen of onderhemden maakt. Geen collectie gate wordt toegepast als de onderhemden van PNS zijn verdeeld over een groot bereik van FSC en SSC (Figuur 1 c). Het materiaal op de high-end van de FSC-as, waarin onvolledig verteerd weefsel, moeten worden uitgesloten bij de selectie van de singlet bevolking (figuur 1A-B). Met een dichtheid perceel (lagere paneel) weer te geven van de resultaten kan vergemakkelijken in de uitsluiting van de grote brokstukken (lagere paneel). Een totaal van ≥ 30.000 onderhemden regelmatig kan worden verkregen uit twee volledige ischiadicus zenuwen en ≥200, 000 onderhemden DRG (Figuur 1 d) kunnen worden verkregen. Uit de ischiadicus zenuwen, ongeveer 5% van onderhemden uitgedrukt CD45 op hun oppervlak, overwegende dat ongeveer 5-10% werd gevonden in de DRG, waardoor deze cellen te definiëren als leukocyten van hematopoietische oorsprong (figuur 2A).
Een meerderheid van de CD45+ onderhemden eveneens MHC klasse II, uitgedrukt in een geleidelijke manier (figuur 2B). In de DRG, CD11b kan worden gebruikt voor het detecteren van microglial-achtige cellen (CD45dim, MHCII+ en CD11b+) (figuur 2B, bovenste deelvenster). Deze microglia bevolking is echter afwezig van de zenuwen van de ischiadicus (figuur 2B, lagere paneel). Een meerderheid van de uiting van de CD45 in de PNS onderhemden zijn CD68+ macrofagen. De nervus ischiadicus en de Deutsche Reichsbahn, 2-5% van de onderhemden uitgedrukt CD68 (figuur 3A). Alle cellen uiten CD68 ook uitgedrukt CD45 (gegevens niet worden weergegeven). In de DRG, de CD68+ macrofagen waren meer heterogene in hun expressie van beide MHC klasse II en CD206, een marker voor M2 de macrofagen, dan in de ischiadicus zenuwen (figuur 3B-D). In de ischiadicus zenuwen, meeste macrofagen mede uitgedrukt MHC klasse II en CD206 (figuur 3B-D, lagere panelen); meestal ongeveer 60-80% van de CD68+ macrofagen uitgedrukt CD206, terwijl een kleiner deel van de CD68+ uitgedrukt mede CD206 in de DRG (figuur 3B). Interessant is dat deed de M1 macrofaag markering CD86 niet genereren elke positieve kleuring, noch op de macrofagen van zenuw noch van PCL (gegevens niet worden weergegeven). De macrofaag marker, F4/80, toonde een heterogene expressie zowel in DRG ischiadicus zenuwen (figuur 3B-C), een deel van de CD68 kleuring- en MHCII- cellen. Bovendien deed F4/80 expressie niet volledig overlappen met de CD68 expressie.
Figuur 1: representatieve gegevens uit stroom cytometry analyse van de DAPI gebeitste nucleated cellen van de Deutsche Reichsbahn en nervus ischiadicus. Alle gebeurtenissen verzameld, weergegeven als scatterplots (bovenste deelvenster) of dichtheid (lagere paneel), van de DRG (A) of (B) nervus ischiadicus (SN) van één vertegenwoordiger muis percelen. Pijlen in de onderste panelen geven de poorten, met uitzondering van het materiaal bij de bovenkant van de FCS-as. (C) rug-gating van de cellen in de DAPI-poort (onderhemden), weergegeven in het deelvenster (A) op de SSC vs. FSC scatterplot verzameld. (D) aantal onderhemden uit zowel SN en alle belangrijke DRG van zes gezonde C57BL/6 muizen. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: stroom cytometry analyse van oppervlakte uitdrukking van CD45, MHC klasse II, en CD11b op onderhemden van DRG en nervus ischiadicus. Gebeurtenissen die zijn geselecteerd in de DAPI-poort (onderhemden) afgebeeld in Figuur 1 zijn geanalyseerd. (A) deel van de onderhemden uiting van CD45 in de nervus ischiadicus (SN) en de Deutsche Reichsbahn van zes muizen van het besturingselement. (B) vertegenwoordiger scatter percelen van onderhemden van DRG (bovenste deelvenster) en SN (lagere paneel). Cellen uiten van CD11b worden aangegeven met blauwe kleur. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: stroom cytometry analyse van oppervlakte uitdrukking van CD68, MHC klasse II, en CD206 op onderhemden van DRG en nervus ischiadicus. Gebeurtenissen die zijn geselecteerd in de DAPI-poort (onderhemden) afgebeeld in Figuur 1 zijn geanalyseerd. (A) percentage van de onderhemden CD68 uiten in nervus ischiadicus (SN) en DRG van zes gezonde C57BL/6 muizen. (B) aandeel van CD68+ macrofagen mede uiting te geven aan CD206 in SN en DRG van zes gezonde C57BL/6 muizen. (C) vertegenwoordiger scatter percelen onderhemden van DRG (bovenste deelvenster) en SN (lagere paneel) weergegeven: CD68 en MHC klasse II expressie. (D) vertegenwoordiger scatter percelen onderhemden van DRG (bovenste deelvenster) en SN (lagere paneel) weergegeven: CD68 en CD206 expressie. Cellen uitspreken F4/80 worden aangegeven met de kleur magenta. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SD. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ischiadicus zenuwen bevatten een groot aantal lipiden, zoals cholesterol, als gevolg van de inhoud van myeline rond de axonen. Aangezien de eigenschappen van lipiden met temperatuur veranderen, kunnen verschillende resultaten bij verschillende temperaturen worden verkregen. Conservering van de cel, werden alle stappen in dit protocol na de spijsvertering uitgevoerd op het ijs. Terwijl de consistentie wordt aanbevolen omwille van de reproduceerbaarheid van de resultaten, is het wellicht mogelijk om het rendement te verhogen door het uitvoeren van de stappen 3.6 en 3.7 bij kamertemperatuur. Als de zenuwen bij stap 3.8 hebben niet voldoende zijn verteerd, kan kleine stukjes van de zenuw zien op de Maas. In geval van onvoldoende vertering, kan het materiaal op de Maas achtergebleven opnieuw worden verteerd door het overzetten naar een nieuwe 1,5 mL-buis met 250 µL van spijsvertering media en herhalende stappen 3.2-3.6. Als de opbrengst armen, dan een monster van de celsuspensie, nadat het scherm mesh (stap 3.6) passeren moet worden gezien onder een lichte Microscoop met trypan blauwe. Levensvatbaar, niet-blauw, cellen moeten worden weergegeven samen met rod-achtige structuren, die fragmenten van axonen. Als geen levensvatbare cellen aanwezig zijn, dan de voorwaarden van de spijsvertering en/of onjuist afleveren van het materiaal heeft geleid tot necrose. Als alleen de grote aggregaten zichtbaar zijn, dan is aan te raden om te verzamelen van het materiaal door middel van centrifugeren en herhaal de spijsvertering (stappen 3.2-3.6).
De methode van flow cytometer analyse van lymfkliertest ischiadicus zenuwen en DRG is handig voor vragen met betrekking tot hele zenuwen en verschillende DRG. onlangs is er een toegenomen belangstelling voor de analyse van de PNS met behulp van stroom cytometry11,12 . Liu et al. hebben een methode met behulp van papaïne en mechanische dissociatie van de ischiadicus zenuwen en de DRG met behulp van 21 en 23 G specifiek analyseren zo weinig als 1 cm sectie van de zenuw, waardoor voor de analyse van de zenuw materiaal van bepaalde sites ontwikkeld van verwonding11. De methode die hier wordt aanbevolen voor gebruik wanneer het effect op de PNS verwachte zit voor zitten systemische, zoals in neurotoxicology en genetische modellen van neuropathie of in chronische ziekten, zoals diabetes. Als gevolg van het lage rendement van genucleëerde cellen verkregen van de nervus ischiadicus, is het niet aanbevolen om te proberen om te bestuderen van de populaties van kleine omvang met ≤ 100 gated gebeurtenissen uit een individuele muis. Echter, bundeling van materiaal uit verschillende muizen zou worden vergemakkelijkt de studie van dergelijke kleine populaties binnen de zenuw. Toch lijkt het me van belang te onderzoeken of de enzymatische weefsel dissociatie gebruik papaïne en 21G / 23G naalden door Liu et al. beschreven 11 kunnen worden gecombineerd met de stroom cytometry kleuring van kernen, zoals beschreven in deze studie, ter verbetering van het rendement van afzonderlijke cellen. De mogelijkheid om zeer kleine hoeveelheden weefsel te analyseren is van cruciaal belang voor het uitvoeren van de vergelijking tussen ipsi- en contralaterale DRG na eenzijdige Ischiaszenuw axotomy. Echter, dit is buiten het bereik van deze studie. Interessant, waren gebruikte merkers voor identificatie van macrofagen gevonden te hebben een onverwacht heterogene expressie in de PNS van muizen. Bijvoorbeeld, CD11b en F4/80 bleken beide tot uitdrukking worden gebracht op een groot aantal niet-hematopoietische, niet-antigeen presentatie van cellen in zowel de DRG als de nervus ischiadicus. Bovendien, in de ischiadicus zenuwen, niet alle CD68+ macrofagen uitgedrukt CD11b en F4/80, zoals zou worden verwacht uit de studie van andere organen. Het is daarom aanbevolen dat voorzichtigheid bij het gebruik van deze markers voor de studie van macrofagen in de PNS is genomen en dat andere markeringen, zoals CD163, moeten worden onderzocht. Bovendien moet de gevoeligheid van de verschillende markeringen aan de enzymatische dissociatie ook worden vastgesteld als deze misschien een verklaring voor de verschillen in expressie, zoals met CD11b of F4/80 waargenomen.
Dit protocol heeft eerder gebruikt voor het analyseren van de immuuncellen in de PNS na giftige uitdaging met streptozotocin (STZ)13, een chemische stof die vaak gebruikt voor de inductie van diabetes bij knaagdieren modelorganismen. Het werd aangetoond dat STZ, die zowel TRPV1 als TRPA1 activeert, in eerste instantie een uitputting van immuuncellen in zowel de nervus ischiadicus en de DRG, veroorzaakt terwijl het niet wordt veroorzaakt door een ontsteking in de zenuw. Hoewel het aantal immuuncellen in de DRG hersteld, de immune cellen en met name macrofagen waren nog steeds aanzienlijk uitgeput post drie weken giftige uitdaging. Het was vervolgens veronderstelde dat macrofaag fagocytose van zenuw puin, als gevolg van letsel door ion kanaal hyperexcitability kan hebben geleid tot de apoptosis van de macrofagen, resulterend in hun uitputting van de algemene-celpopulatie. Het is niet bekend invloed van andere toxinen perifere zenuwen op zenuw resident macrofagen. Als de uitputting van de macrofagen is een gemeenschappelijk resultaat van ingebrachte kan dit gevolgen hebben voor behandeling.
Het bleek dat slechts 5-10% van de genucleëerde cellen van de zenuw leukocyten van hematopoietische oorsprong waren. De resterende cellen zijn vermoedelijk een mengsel van de andere zenuwcel types, namelijk Schwann cellen, pericytes en fibroblasten, endotheliale cellen. Als gevolg van de capaciteit van stroom cytometry systemen voor het meten van meerdere parameters en mits er zijn specifieke markers en/of antilichamen beschikbaar, het denkbaar dat deze celtypes ook kunnen worden geanalyseerd met behulp van deze methode. Deze methode is beschreven voor lymfkliertest materiaal. Echter, met enkele wijzigingen, het is ook gebruikt voor de analyse van PNS materiaal van varkens en van menselijke. Verwacht wordt dat deze methode in de toekomst meer nuttig voor de analyse van materiaal uit soorten muizen, groter zal zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang met betrekking tot deze studie.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). De auteurs bedank Axel Erhardt voor allermeest naar de dissectie uitvoeren en behulpzaam het overbrengen van deze kennis, en Dr. Volker Eckstein voor het assisteren in het technische aspect van de cytometer van de stroom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
