Summary
Analyse quantitative du contenu de la cellule dans le nerf sciatique murin est difficile en raison de la rareté du tissu. Ce protocole décrit une méthode de digestion de tissu et de préparation qui fournit des cellules suffisants pour analyse en cytométrie flux de populations de cellules immunitaires des nerfs de souris individuels.
Abstract
Nerf-résident des cellules immunitaires dans le système nerveux périphérique (PNS) sont essentiels pour préserver l’intégrité neuronale dans un nerf sain. Les cellules immunitaires de la PNS sont touchés par des blessures et la maladie, qui affecte la fonction nerveuse et la capacité de régénération. Les cellules immunitaires neuronales sont couramment analysés par immunofluorescence (IF). Tandis que si est essentielle pour déterminer l’emplacement des cellules immunitaires dans le nerf, s’il est seulement semi-quantitative et la méthode est limitée au nombre de marqueurs qui peuvent être analysés simultanément et le degré d’expression à la surface. Dans cette étude, cytométrie en flux a été utilisée pour l’analyse quantitative de l’infiltration leucocytaire dans les nerfs sciatiques ou des ganglions de la racine dorsale (DRGs) de souris individuels. Analyse d’unicellulaire a été réalisée à l’aide de DAPI et plusieurs protéines ont été analysés en même temps pour l’expression de surface ou intracellulaire. Les deux nerfs sciatiques d’une souris qui ont été traitées selon ce protocole générée ≥ 30 000 unique nucléées des événements. Les leucocytes dans les nerfs sciatiques, déterminés par l’expression de CD45, représentaient environ 5 % du contenu total de cellules dans le nerf sciatique et environ 5 à 10 % dans le PMSI. Bien que ce protocole se concentre principalement sur la population de cellules immunitaires dans le PNS, la flexibilité de la cytométrie pour mesurer un certain nombre de marqueurs simultanément signifie que les autres populations de cellules présentes dans le nerf, telles que les cellules de Schwann, péricytes , les fibroblastes et les cellules endothéliales, peuvent être également analysées à l’aide de cette méthode. Cette méthode offre donc un nouveau moyen pour étudier les effets systémiques sur le PNS, comme neurotoxicologie et modèles génétiques de neuropathie ou des maladies chroniques, telles que le diabète.
Introduction
Les cellules immunitaires qui entrent le PNS de la circulation, tel que défini par l’expression de CD45 et CD11b, aident à maintenir l’intégrité du nerf et jouent un rôle tant dans la régénération et la dégénérescence1. Macrophages (définis par leur expression du CD68 chez la souris) peuvent être décalés vers un phénotype inflammatoire, exprimant plus MHC de classe II et CD86 sur leur surface (M1), ou vers un phénotype anti-inflammatoires, exprimant plus CD206 intracellulaire (M2)2 . L’inclinaison du phénotype macrophage est un processus dynamique réglementé par Akt signalisation3, reflétant les différentes tâches des macrophages dans la défense contre les agents pathogènes (M1) et le rôle dans la régénération des tissus (M2). Régénération d’un nerf lésé exige d’abord la phagocytose des débris de la myéline par des macrophages dans le nerf4,5et anti-inflammatoire (CD68+CD206+) auraient dû être divulgués M2 macrophages pour promouvoir l’excroissance des axones dans le PNS6. Réduit de recrutement ou macrophages à la PNS, ou capacité altérée de phagocytose altérée de régénération et de maintien de l’intégrité du nerf peut entraîner. Inflammatoires M1 macrophages, exprimant le CMH de classe II, sont moins capables de phagocytose que M2 macrophages et inflammation neuronale est impliquée dans la pathogénie de plusieurs de maladies neurodégénératives7.
Les changements qui se produisent au système immunitaire résident nerveuses par suite de dommages peuvent être quantitatives, qui manifeste une perte de CD45+ leucocytes (ou augmenté l’infiltration du CD45+ leucocytes dans l’affaire inflammation), ou qualitatifs, tels que changer de phénotype macrophage de M2 à M1 phénotype. Les cellules immunitaires de la PNS ont traditionnellement été analysées au moyen de l’IF, à l’aide de coupes congelées ou paraffine matériel8. IF est nécessaire pour déterminer la localisation des cellules d’intérêt. Cependant, quantification si souvent repose sur le comptage un relativement petit nombre de cellules dans une partie étroite du tissu, faire quantification fiable et vulnérables à des biais de sélection. Pour l’identification des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires, la détection simultanée des marqueurs extracellulaires ou intracellulaires est requise, tandis que la détermination du phénotype macrophage nécessite au moins au moins deux marqueurs, en particulier CD206 et MHC classe II. Comme plus couramment microscopes disponibles sont limités au moins deux couleurs canaux, tels que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et la phycoérythrine (PE), la caractérisation des sous-ensembles spécifiques de cellules immunitaires par IF peut être restrictive et incomplète, nécessitant la nécessité de disposer de plusieurs diapositives, dérivé de la même zone d’intérêt, qui sont colorées et analysés en parallèle. Cet aspect fastidieux n’est donc pas nécessaire se prête à l’analyse des ensembles de grands échantillons. En outre, comme la plupart des marqueurs d’intérêt extracellulaire, la détection dans le tissu, qui a été soit intégrée dans la paraffine ou frais, peut être problématique en raison de la rupture de l’intégrité membranaire et le masquage des épitopes, ainsi que la perte de les antigènes de l’intérêt de l’utilisation de solvants comme l’acétone et le méthanol9.
En revanche, cytométrie en flux, qui mesure optique et caractéristiques de la fluorescence des cellules individuelles en suspension pendant qu’ils traversent un faisceau de lumière, offre un moyen plus pratique et complet pour l’analyse des populations cellulaires. Cytométrie en flux, plutôt que de produire une image numérique du tissu, fournit une quantification automatique des paramètres définis, qui comprennent une cellule taille relative et indice de réflexion, dénommé le forward scatter (FSC), complexité granularité/interne ou diffusion latérale (SSC) et l’intensité de la fluorescence relative, fournissant que la cellule a été étiquetée avec un fluorophore approprié, comme un anticorps conjugué. Un cytomètre en flux typique se compose de deux, lasers refroidis à l’air ; un laser à argon produit une lumière bleue à 488 nm et un laser hélium-néon émet des rayons à 633 nm. Cette combinaison permet de détection et de mesure, simultanément, d’au moins cinq cibles sur la surface ou dans le compartiment intracellulaire. Plus avancés cytomètres peut se composer de plusieurs lasers, qui permettant de détecter des fluorochromes différents jusqu'à huit en même temps, fournissant que les longueurs d’onde d’émission de pic des fluorochromes sélectionnés ne se chevauchent pas significativement.
Pour l’analyse par cytométrie en flux, le tissu d’intérêt doit d’abord être enzymatiquement digéré, généralement avec la collagénase, pour générer une suspension monocellulaire. L’analyse de la murines nerfs sciatiques a été difficile en raison de la petite quantité de tissu provenant de chacune des souris. En outre, la haute teneur en matières grasses de la myéline autour des axones entrave la récupération de la cellule et produit de grandes quantités de débris. La méthode décrite ici pour la digestion et préparation du nerf sciatique est une adaptation de la cellule de Schwann protocole d’isolement de Barrette et al. 7et vise à isoler suffisamment de cellules des nerfs des souris individuels pour analyse en cytométrie en flux, afin de réduire la variation entre les souris. À l’aide de DAPI pour l’identification des cellules individuelles dans le digest de tissus bruts contourne la nécessité d’éliminer les débris d’axon, qui entraîne généralement la perte de cellules. Laver plusieurs fois avec un sida détergent riche tampon dans la libération des cellules emprisonnées dans les débris de gras, ce qui augmente le rendement. Digestion des deux nerfs sciatiques pleine longueur d’une seule souris selon ce protocole génère ≥ 30, 000 événements nucléées uniques et au moins 3 fois ce nombre a été récupéré de la DRG. La proportion de CD45+ leucocytes était d’environ 5 % du contenu total de cellules dans le digest de nerf sciatique et environ 5-10 % dans le digest DRG. La majorité de la CD45+ cellules dans le nerf sciatique expriment les marqueurs de macrophage, CD68 et CD206.
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Protocol
Souris C57BL/6 de type sauvage (mâles ; 10-12 semaines) ont été conservés dans le cycle de lumière/obscurité standard 12 h et ont pu accéder gratuitement au régime standard et de l’eau. Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes par le Comité d’urbanisme et un animalier local et approuvés par le Comité de l’emploi et de locaux animalier à l’administration régionale à Karlsruhe, Allemagne (G216/10).
1. la perfusion de la souris
- Sacrifier la souris (C57BL/6 ; Mâles ; 10-12weeks) à l’aide de CO2 ou conformément aux règlements locaux.
NOTE : Rétro-orbitaire hémorragie peut être effectuée pour obtenir les leucocytes de contrôle, à l’aide de tubes EDTA-enduit 1,5 mL. Cette méthode de saignement est uniquement efficace immédiatement après le sacrifice. Lavage de cavité plus, péritonéale (PCL) peut être effectuée pour obtenir des macrophages de contrôle, à l’aide de PBS préchauffé à 37 ° C pour éviter le froide agglutination du sang, qui peut gêner la perfusion. - Désinfecter la souris par pulvérisation de la fourrure sur l’abdomen généreusement avec 70 % v/v d’éthanol et à plusieurs reprises essuyé avec un mouchoir en papier avec de la gaze de coton. À l’aide de ciseaux émoussé, fend la peau abdominale par une incision longitudinale.
- Exposez la cavité pleurale en premier, faire une incision dans la membrane à l’aide de ciseaux courbes, émoussé et puis qui s’étend de l’incision sur toute la longueur de la cage thoracique. Faites une coupe similaire du côté controlatéral, jusqu'à ce que le sternum peut être soulevé avec précaution loin.
- Avec une vue dégagée du cœur et les vaisseaux principaux, insérer un papillon 23¾ aiguille, relié à une seringue de 50 mL de calibre bac à glacée, dans la chambre de gauche du cœur.
- Faire une incision à l’oreillette droite du cœur à l’aide de ciseaux iris pour créer aussi grand d’une prise de courant que possible sans endommager l’aorte et puis appuyer légèrement sur la seringue pour faire passer environ 30 mL de PBS. L’exsudat doit être exécuté en clair. La clairière des foie et/ou des reins peut être utilisée comme un indicateur d’une bonne perfusion.
2. dissection du nerf sciatique et DRG
Remarque : Pour la dissection des nerfs sciatique, la peau qui précède le gluteus maximus est supprimé et la souris est positionnée face ventrale vers le bas tout en tendant les membres inférieurs.
- Sur le plan bilatéral disséquer les nerfs sciatiques tout en séparant le tissu musculaire de la cuisse dorsale et suivi le nerf le long de la colonne vertébrale. Couper le nerf à l’endroit où il sort de la colonne vertébrale et immédiatement au-dessus du genou à l’autre extrémité.
NOTE : Éviter la manipulation excessive du nerf tels que le broyage ou en tirant avec une pince. - À l’aide de pinces, transférer les nerfs excisées, environ 2 cm par nerf, dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBS glacée et magasin sur la glace.
Remarque : Le nerf peut être stocké pendant la nuit sur la glace.
Remarque : Pour la dissection de la DRG, à l’aide de pinces et un scalpel, détachez la peau à partir des tissus mous sous-jacente en décollant doucement la peau restante arrière pour exposer les régions de la colonne vertébrale cervicales, thoraciques et lombaires. Sortez la tête de coupe à la base du crâne à l’aide d’une mousse paire de ciseaux. - Couper les côtes parallèlement et à proximité de la colonne vertébrale des deux côtés, avant de détacher les viscères relié à la partie antérieure de la colonne vertébrale. Couper les fémurs et enlever la colonne vertébrale par une transversale coupée au niveau du fémur. À l’aide de ciseaux iris, découper n’importe quel muscle, la graisse et autres tissus mous de la colonne vertébrale.
- Placer la colonne vertébrale avec la face dorsale vers le haut et l’ouvrir, à partir de l’extrémité caudale, en glissant une astuce des ciseaux dans le canal vertébral à la position de 03:00 et l’OS ciselée. Répétez la procédure à la position de 09:00.
Remarque : Il est important de couper exactement au Centre pour éviter d’endommager le PMSI. - Répétez la coupe de côte-à-côte jusqu'à ce que l’extrémité rostrale est atteint et la moelle épinière est entièrement exposée. À l’aide d’un microscope à dissection, enlever la moelle épinière pour exposer les nerfs rachidiens, qui peut être utilisés pour localiser les DRGs au sein de la colonne vertébrale.
- Retirez les DRGs lombaires en tirant doucement sur la racine dorsale de tirer le PMSI dans les canaux de vertébrale, puis coupure les nerfs et le tissu conjonctif avec des ciseaux pour enlever les DRGs iris.
Remarque : Il est possible de restreindre la collecte à la DRG L4-L6, qui contribuent au nerf sciatique. - À l’aide de pinces, transférer les DRGs dans un tube de 1,5 mL contenant environ 1 mL de PBS glacee et stocker sur la glace.
Remarque : Le nerf peut être stocké pendant la nuit sur la glace.
3. digestion du nerf sciatique et DRG
- Préparer les médias de la digestion (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL de BSA, collagénase de 1,6 mg/mL Type 4) additionnés de 100 µg/mL de désoxyribonucléase et le magasin sur la glace.
Remarque : La quantité de milieu de digestion par souris (nerfs sciatiques + DRGs) est 1 mL. Une fois préparée, parties aliquotes des médias digestion peuvent être conservés à-20 ° C. - Transférez les nerfs sciatiques et DRGs une souris dans des tubes distincts 1,5 mL contenant 500 µL de médias de la digestion. Pour les nerfs sciatiques, hacher le matériau en 15-20 morceaux à l’aide de ciseaux de printemps et puis incuber les suspensions de tissu dans un incubateur à agitation à 37 ° C pendant 20 min avec agitation modérée (≤ 450 tr/min).
- À plusieurs reprises triturer la suspension cellulaire à travers 1 000 de pipette µL de dissocier mécaniquement n’importe quel tissu incomplètement digéré.
Remarque : Si la suspension est difficile à titrer, puis couper l’embout de la pipette avec des ciseaux pour créer une extrémité arrondie. Incuber à 37 ° C pendant 20 min avec agitation modérée (≤ 450 tr/min) la suspension des tissus. - Répétez la trituration grâce à un embout de pipette 1 000 µL et incuber pendant encore 10 minutes à 37 ° C sous agitation douce (≤ 450 tr/min).
- Préparer le tampon de FACS (PBS additionné de 10 % FCS et 1 mM EDTA) et stocker sur la glace. Rincer et faire tremper un écran en acier inoxydable avec un maillage de 140 µm avec tampon de FACS en 60 x 15 mm de Petri stérile sur la glace.
NOTE : Filtres écran Nylon doivent être évitées car elle conduit à une perte importante du rendement des cellules nucléées. - À plusieurs reprises passer les suspensions de tissus à travers le filtre d’écran 140 µm, qu’il est conservé dans la boîte de Pétri, avec une pince émoussée, sur la glace. Recueillir la suspension cellulaire de la boîte de Pétri et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL stocké sur la glace.
- Appuyez sur n’importe quel tissu incomplètement digéré qui reste sur le filtre à travers par la trituration répétée avec une pointe de pipette 1 000 µL. Rincer le filtre écran deux fois avec 500 µL de tampon de FACS et recueillir la suspension cellulaire qui en résulte dans la boîte de Pétri à combiner avec la suspension de cellules de l’étape 3.6.
Remarque : Si le cytomètre en flux utilisé est sensible aux débris, la suspension de cellules de l’étape 3,7 peut être passée à travers un filtre à tamis 70 µm ; Toutefois, cela peut entraîner une perte dans le rendement des cellules nucléées. - Centrifuger les suspensions de cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon de FACS. Répéter une fois cette étape de lavage.
- Resuspendre le culot dans 150-350 µL de tampon de FACS, selon le nombre de taches qui sont requis (150 µL FACS tampon par le panneau de coloration).
4. la coloration du nerf sciatique et DRG avec anticorps fluorescent étiquetés pour cytométrie en flux
- Transférer 100 µL du nerf sciatique ou suspension cellulaire DRG dans une forme de V dans une plaque à 96 puits sur la glace.
NOTE : Cellules simples sont nécessaires pour tous les anticorps utilisés comme ils fourniront les contrôles nécessaires pour la mise en place de la cytométrie en ce qui concerne les gains en tension photomultiplier tube (PMT) et d’indemnisation, ainsi que pour aider à faire la distinction spécifique de liaisons non spécifiques. En raison de la matière limitée disponible dans le nerf sciatique et GHM, sang leucocytes et macrophages de la PCL (étapes 1.1-1.2) peuvent être utilisés comme les contrôles de coloration unique, la coloration pour qui doit être exécuté en parallèle avec la coloration de la sciatique nerf et DRGs. - Piscine les autres cellules (environ 50 µL par exemple) des suspensions de nerfs sciatiques ou des échantillons DRG, pour servir de témoin non souillé.
- Centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant en inversant la plaque au-dessus d’un bac et en appliquant une forte chiquenaude du poignet et Tapotez doucement sécher sur du papier absorbant.
- Pour la coloration de surface, chacun des boulettes cellule resuspendre dans 20 µL de tampon de FACS contenant les anticorps d’intérêt (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 et MHC classe II-biotine) et incuber, abri de la lumière sur la glace pendant 30 min.
Remarque : (1) la dilution optimale anticorps doit être déterminé avant de l’utiliser en exécutant une série de dilution selon les informations de produit par le fabricant ; (2) salissures Non spécifiques peut être réduite par incubation avec Fc-bloc à cette étape, selon les instructions du fabricant ; et (3) Isotype contrôle salissures ne sont généralement pas nécessaires lors de l’utilisation des anticorps primaires conjugués directement avec un fluorophore ou quand les antigènes d’intérêt produisent des populations distinctes. - Ajouter 130 µL de tampon de FACS dans chaque puits et centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 4.3) et lavez les granules cellulaires deux fois avec 150 µL de tampon de FACS.
Remarque : Si vous utilisez un anticorps primaire non conjuguée ou un anticorps primaire conjugués à la biotine, puis un réactif approprié de secondaire, conjugué à un fluorophore, peut être ajouté à ce stade et 4.4-4.5 les étapes sont répétées. Dans le cas de ce protocole, streptavidine-PE/Cy7 ou streptavidine-PerCP a été utilisé pour détecter les MHC classe II en association avec CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, ou en combinaison avec CD68-APC et F4/80-PE/Cy7, respectivement. - Pour la fixation, après le dernier lavage, remettre en suspension les granules cellulaires dans 100 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (pH 7,4). Incuber les plaques sur la glace pendant 10 min et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 4.3) et laver les pellets de la cellule une fois avec 150 µL de tampon de FACS.
ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter une protection appropriée tels que des gants et des lunettes, etc..
NOTE : Remettre en suspension les granules cellulaires dans 150 µL de tampon de FACS et store abri de la lumière, à 4° C pendant deux jours. Si aucune coloration intracellulaire n’est requise, puis passez à l’étape 4.11 après centrifugation de la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. - Pour la coloration intracellulaire, remettre en suspension les granules cellulaires dans 150 µL de détergent buffer+0.5% FACS et incuber à température ambiante, abrie de la lumière pendant 15 min. Centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 4.3) et laver le culot cellulaire une fois avec 150 µL de tampon de FACS + 0,5 % de détergent. Resuspendre le culot dans 20 µL de détergent de buffer+0.5% de FACS contenant les anticorps d’intérêt (CD68-APC, CD206-PE) et incuber, abri de la lumière, à température ambiante pendant 30 min.
- Ajouter 130 µL de détergent buffer+0.5% FACS dans chaque puits et centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 4.3) et lavez les granules cellulaires deux fois avec 150 µL de tampon de FACS + 0,5 % de détergent.
Remarque : Si vous utilisez un anticorps primaire non conjuguée ou un anticorps primaire conjugués à la biotine, puis un réactif approprié de secondaire, conjugué à un fluorophore, peut être ajouté à ce stade et étapes 4,9-4.10 répétées. - Remettre en suspension les granules cellulaires dans 150 µL de tampon de FACS + 0,5 % de détergent et de magasin, abri de la lumière, à 4 ° C pendant deux jours.
- Remettre en suspension les pellets de cellules avec 150 µL de tampon de FACS + 0,5 % de détergent additionné de 5 µg/mL DAPI et incuber pendant 5 min à température ambiante, abrie de la lumière. Centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 4.3).
- Remettre en suspension les granules cellulaires dans 150 µL de PBS et transférer dans un tube de FACs correctement identifié. Conserver à température ambiante, abrie de la lumière, jusqu’au moment de l’analyse.
Remarque : Après la remise en suspension dans du PBS, les cellules doivent être analysées dans les heures, puisque le DAPI dissociera lentement de l’ADN, menant à une perte de signal.
5. installation de cytométrie en flux et fonctionnement des échantillons
- Veiller à ce que le cytomètre est équipé avec les lasers appropriés et/ou filtre définit pour mesurer les fluorophores utilisés pour colorer les cellules. Ceci peut être déterminé en vertu de la configuration du cytomètre par défaut sur le système. Dans le cas du présent protocole, les cellules ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux équipé de trois lasers (405 nm, 488 nm et 633 nm) permettant la détection de ≤ 5 fluorophores.
- Sélectionnez les voies appropriées pour détecter les fluorophores d’intérêt. Tous les signaux fluorescents sont mieux détectés avec amplification logarithmique.
- Sélectionnez un débit approprié pour les échantillons. Ce paramètre peut varier selon le système utilisé et doit être déterminé de manière empirique. Dans le cas du présent protocole, un débit de MED-à-HI (35-60 µL/min) a été utilisé pour éviter tout colmatage de l’aiguille.
- Sélectionnez le nombre total d’événements/cellules à percevoir par exemple. Le nombre minimum d’événements devrait être de 1 000 000.
- Créer des diagrammes de dispersion sous une feuille de calcul global de la SSC-A contre FSC-A, ainsi que pour chaque molécule d’intérêt par rapport aux FCS.-a. Créer une vue statistique qui affichera le nombre d’événements et de l’intensité moyenne fluorescente (MFI) pour les fluorophores sélectionnés.
- Régler la tension des canaux FSC-A et SSC-A, tels que les cellules plus petites s’insèrent dans le bas gauche 10 % du nuage de points. Déterminez la fluorescence de fond et la fluorescence minimale de l’échantillon des contrôles non colorés de nerfs sciatiques ou DRGs. Déterminez le portail parent (P1) basé sur le scatter plot de DAPI seule coloration contrôles.
NOTE : Ce n’est pas une porte de collection, dû en partie à l’hétérogénéité de la population DAPI + dans le PNS. - En utilisant le scatter FSC parcelles pour chacun des fluorophores d’intérêt, régler les tensions afin que les cellules du contrôle non-colorées entrent dans le quart inférieur de leurs diagrammes respectifs. Portes sont ensuite créés au-dessus de cette région pour définir les cellules qui sont positives pour chacun des marqueurs/fluorophores respectifs. Le placement d’une porte est confirmé par le fonctionnement du contrôle unique teinté (étape 4.1).
Remarque : Compensation pour le chevauchement des spectres d’émission peut être effectuée à ce stade ou appliquée de manière rétrospective avec le logiciel d’analyse appropriée. - Une fois que le cytomètre en flux a été mis en place, tel que décrit, les échantillons peuvent être exécutés.
- Après la course, le matériel restant de l’échantillon peut être mis au rebut et les fichiers FCS peuvent être exportées pour analyse ultérieure.
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Representative Results
Des suspensions cellulaires de longs nerfs sciatiques et DRG tous les principaux ont été préparées, selon le protocole, de six chez la souris C57BL/6 et divisées en trois aliquotes égales pour la coloration. Compteur de coloration au DAPI, qui colore l’ADN, permet la détection d’une population de cellule unique (Figure 1 a–B, panneau supérieur). Emportant le DAPI, avant l’analyse par cytométrie en flux, a diminué dans une certaine mesure l’intensité de fluorescence des débris non nucléées, qui permettant la sélection d’une population discrète sur l’axe FSC d’événements unique-nucléés ou maillots de corps. Aucune porte de collection n’est appliquée comme les maillots de PNS sont réparties sur une grande gamme de FSC et SSC (Figure 1). Le matériel sur le haut de gamme de l’axe de la FSC, qui contient incomplètement digérés tissus, doivent être exclus de la sélection de la population de singulet (Figure 1 a–B). À l’aide d’une parcelle de terrain de densité (panneau inférieur) pour afficher les résultats peut-être faciliter l’exclusion des gros débris (panneau inférieur). Un total de 30 000 maillots de corps ≥ peut être obtenu régulièrement deux pleine de nerfs sciatiques et ≥200, 000 maillots de corps peuvent provenir de DRGs (Figure 1). Des nerfs sciatique, environ 5 % des maillots de corps exprimé CD45 sur leur surface, alors qu’environ 5 à 10 % ont été trouvés dans les DRGs, définissant ainsi ces cellules comme les leucocytes d’origine hématopoïétique (Figure 2 a).
Une majorité de la CD45+ maillots également exprimé CMH de classe II, de manière progressive (Figure 2 b). Dans le GHM, CD11b peut être utilisé pour détecter les cellules microgliales (CD45dim, MHCII+ et CD11b+) (Figure 2 b, panneau supérieur). Cependant, cette population de cellules microgliales est absente des nerfs sciatique (Figure 2 b, panneau inférieur). Une majorité de le maillots exprimant CD45 dans le PNS sont CD68+ macrophages. Dans le nerf sciatique et de la DRG, 2-5 % de le maillots exprimé CD68 (Figure 3 a). Toutes les cellules exprimant CD68 également expriment CD45 (données non présentées). Dans le GHM, le CD68+ macrophages étaient plus hétérogènes dans leur expression de deux MHC de classe II et CD206, un marqueur pour les macrophages M2, que dans les nerfs sciatiques (Figure 3 b–D). Dans les nerfs sciatique, la plupart macrophages conjointement exprimé CMH de classe II et CD206 (Figure 3 b–D, panneaux inférieurs) ; en général, environ 60 à 80 % de la CD68+ macrophages exprimé CD206, une petite proportion de la CD68+ exprimé conjointement CD206 dans les DRGs (Figure 3 b). Fait intéressant, le marqueur de macrophage M1 CD86 n’a pas généré un marquage positif ni sur les macrophages des nerfs, ni des PCL (données non présentées). Le marqueur de macrophage, F4/80, ont montré une expression hétérogène en DRG et en nerfs sciatiques (Figure 3 b–C), souillant une partie de la CD68– et cellules MHCII– . En outre, F4/80 expression se chevauchent pas complètement avec l’expression CD68.
Figure 1 : les données représentatives de l’analyse en cytométrie en flux de colorés au DAPI nucléées cellules du PMSI et du nerf sciatique. Tous les événements collectés, montre que les diagrammes de dispersion (panneau supérieur) ou la densité (panneau inférieur), les parcelles de DRG (A) ou (B) du nerf sciatique (SN) de souris représentant un. Les flèches dans les panneaux inférieurs indiquent les portes, à l’exclusion de la matière dans la partie supérieure de l’axe de la FCS. (C) arrière-blocage des cellules recueillies dans la DAPI-gate (Maillots), indiquée dans le panneau (A) sur le diagramme de dispersion SSC vs FSC. (D) nombre de maillots de SN et de tous les grands DRG de six chez la souris C57BL/6. Les données représentent la moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse d’écoulement cytometry de surface expression de CD45, CMH de classe II et CD11b sur les maillots du PMSI et du nerf sciatique. On a analysé les événements sélectionnés dans la DAPI-gate (Maillots) illustrée à la Figure 1 . (A) Proportion de le maillots exprimant CD45 dans le nerf sciatique (SN) et DRG de six souris témoins. (B) intrigues représentatif des maillots de la DRG (panneau du haut) et SN (panneau inférieur). Les cellules exprimant CD11b sont indiquées par la couleur bleue. Les données représentent la moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : analyse d’écoulement cytometry de modelé du CD68, CMH de classe II et CD206 sur les maillots du PMSI et du nerf sciatique. On a analysé les événements sélectionnés dans la DAPI-gate (Maillots) illustrée à la Figure 1 . (A) la Proportion de le maillots exprimant CD68 dans le nerf sciatique (SN) et GHM de six chez la souris C57BL/6. (B) Proportion de CD68+ macrophages exprimant conjointement CD206 dans SN et DRG de six chez la souris C57BL/6. (C) les diagrammes de dispersion représentatif des maillots de la DRG (panneau du haut) et SN (panneau inférieur), montrant l’expression II classe CD68 et MHC. (D) les diagrammes de dispersion représentatif des maillots de la DRG (panneau du haut) et SN (panneau inférieur), montrant une expression CD68 et CD206. Les cellules exprimant F4/80 sont indiquées par la couleur magenta. Les données représentent la moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nerfs sciatiques contiennent une proportion importante des lipides, comme le cholestérol, en raison du contenu de la myéline autour des axones. Étant donné que les propriétés des lipides changent avec la température, les différents résultats peuvent être obtenus à différentes températures. Afin d’assurer la préservation de la cellule, toutes les étapes dans ce protocole après la digestion ont été effectuées sur la glace. Alors que la cohérence est recommandé pour des raisons de reproductibilité des résultats, il peut être possible d’augmenter le rendement en effectuant les étapes 3.6 et 3.7 à température ambiante. Si les nerfs à l’étape 3,8 n’ont pas été suffisamment digérés, petits morceaux de nerf sera visible sur le maillage. En cas de digestion insuffisante, le matériel retenu sur la maille peut être re-digéré en transférant dans un nouveau tube de 1,5 mL contenant 250 µL de médias de digestion et extensible mesures 3,2 à 3,6. Si le rendement est pauvre, puis un échantillon de la suspension cellulaire, après avoir traversé le grillage (étape 3.6) devrait être considéré sous un microscope optique avec le bleu trypan. Cellules viables et non bleu, doivent être visibles ainsi que des structures ressemblant à des tiges, qui sont des fragments des axones. Si aucune des cellules viables ne sont présents, puis la digestion des conditions et/ou de remise incorrecte du matériel a provoqué une nécrose. Si seulement les grands agrégats sont visibles, alors il est recommandé de rassemble le matériel par centrifugation et répétez la digestion (étapes 3,2 à 3,6).
La méthode d’analyse cytomètre en flux de murins nerfs sciatiques et GHM est utile pour les questions portant sur les nerfs tout et plusieurs DRGs. récemment il y a eu un intérêt accru pour l’analyse de la PNS utilisant flow cytometry11,12 . Liu et coll. ont mis au point une méthode utilisant la papaïne et la dissociation mécanique des nerfs sciatique et DRGs 21 G et 23 G pour analyser plus précisément aussi peu que 1 cm de section du nerf, permettant ainsi l’analyse du matériel de nerf de sites spécifiques des blessures11. La méthode présentée ici est recommandée pour une utilisation lors de l’effet sur le PNS est censée être systémique, comme en neurotoxicologie et modèles génétiques de neuropathie ou des maladies chroniques, telles que le diabète. En raison du faible rendement des cellules nucléées obtenues à partir du nerf sciatique, il n’est pas recommandé de tenter d’étudier les petites populations ≤ 100 dépendants d’une souris individuelle. Toutefois, la mise en commun de matériel provenant de plusieurs souris faciliterait l’étude de ces petites populations dans le nerf. Néanmoins, il serait intéressant d’étudier si la dissociation enzymatique de tissus à l’aide d’aiguilles de papaïne et 21G / 23G décrite par Liu et al. 11 pourrait être associée à la coloration de cytométrie de flux des noyaux, comme décrit dans cette étude, afin d’améliorer le rendement des cellules individuelles. La capacité d’analyser de très petites quantités de tissu est indispensable pour effectuer la comparaison entre ipsi - et controlatérales DRGs après une axotomie unilatérale du nerf sciatique. Cependant, c’est au-delà de la portée de cette étude. Fait intéressant, marqueurs couramment utilisés pour l’identification des macrophages se sont révélés pour avoir une expression inattendue hétérogène dans le PNS de souris. Par exemple, CD11b et F4/80 ont été tous deux étaient de s’exprimer sur une grande partie des non hématopoïétiques, non-cellules présentatrices en nerf sciatique et DRGs. En outre, dans les nerfs sciatiques, CD68 pas tous+ macrophages exprimée CD11b et F4/80, tel qu’aurait attendu de l’étude des autres organes. Il est donc recommandé que la mise en garde est prise lors de l’utilisation de ces marqueurs pour l’étude des macrophages dans le PNS et que les autres marqueurs comme CD163, devraient être étudiées. En outre, la sensibilité des différents marqueurs à la dissociation enzymatique devrait aussi être établie comme ceci peut-être d’expliquer les différences observée dans l’expression, comme avec CD11b ou F4/80.
Ce protocole a déjà été utilisé pour analyser les cellules immunitaires dans le PNS après provocation toxique par la streptozotocine (STZ)13, un produit chimique couramment utilisé pour l’induction du diabète chez les rongeurs organismes modèles. Il a été démontré que STZ, qui active les TRPV1 et TRPA1, initialement provoque un appauvrissement de la couche de cellules immunitaires dans le nerf sciatique et GHM, tout en ne causant une inflammation du nerf. Bien que le nombre de cellules immunitaires dans les DRGs récupérés, les cellules immunitaires et notamment les macrophages était encore considérablement appauvri trois semaines après défi toxique. Il a par la suite émis l’hypothèse que phagocytose des macrophages des débris de nerf, résultant de blessures par une hyperexcitabilité de canal ionique peut avoir conduit à l’apoptose des macrophages, ce qui entraîne leur appauvrissement de la population cellulaire générale. On ne sait pas comment les autres toxines de nerf périphérique affectent macrophages résident de nerf. Si l’épuisement des macrophages est un résultat commun de ces agents, cela peut avoir des implications pour le traitement.
Il a été constaté que seuls 5 à 10 % des cellules nucléées du nerf ont été leucocytes d’origine hématopoïétique. Les cellules restantes sont sans doute un mélange des autres types de cellules nerveuses, à savoir les cellules de Schwann, les péricytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales. En raison de la capacité des systèmes d’écoulement cytometry pour mesurer des paramètres multiples et fournissant qu’il existe des marqueurs spécifiques et/ou d’anticorps disponibles, il est concevable que ces types de cellules pourraient aussi être analysées à l’aide de cette méthode. Cette méthode a été décrite pour matériel murine. Cependant, avec quelques modifications, il a également servi à l’analyse du matériau PNS de porc et d’être humain. Il est prévu que cette méthode sera plus utile pour l’analyse du matériau des espèces plus grandes que les souris, à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts en ce qui concerne la présente étude.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ; SFB1118). Les auteurs aimeraient remercier Axel Erhardt pour effectuer la plupart de la dissection et utilement transmettre ces connaissances et Dr. Volker Eckstein devant concourir à l’aspect technique de la cytomètre de flux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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