Summary
ניתוח כמותי של תוכן התא בתוך בעצב מאתר קשה עקב מחסור הרקמה. פרוטוקול זה מתאר שיטה רקמות לעיכול, הכנה מספקת מספיק תאים לניתוח cytometry זרימה של אוכלוסיות תאים חיסוניים מרוב עצבים של עכברים בודדים.
Abstract
תאים חיסוניים תושב עצב במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) חיוניים לשמירה על תקינות עצביים עצבים בריאה. תאים חיסוניים של מערכת העצבים ההיקפית מושפעים פציעות ומחלות, המשפיעים על הפונקציה העצבים יכולת התחדשות. תאים חיסוניים עצביים מנותחים בדרך כלל על-ידי immunofluorescence (אם). ואילו אם הוא חיוני לקביעת המיקום של תאים חיסוניים העצב, אם היא רק חצי כמותית השיטה היא מוגבלת מספר סמנים ניתן לנתח בו-זמנית את מידת ביטוי משטח. במחקר זה, שימש cytometry זרימה לניתוח כמותי של חדירה ליקוציט ממוגלה בעצבים או העזוב השורש ganglions (DRGs) של עכברים בודדים. תא בודד והניתוח נעשה שימוש דאפי, חלבונים שונים נותחו בו זמנית עבור הביטוי תאיים או משטח. שני עצבים ממוגלה של עכבר אחד אשר טופלו על-פי פרוטוקול זה שנוצר ≥ 30,000 אירועים nucleated יחיד. חלקם של לויקוציטים של העצבים בירך, נקבע על ידי ביטוי של CD45, היה כ 5% של תוכן הכולל תא בעצב, כ- 5-10% בהרפובליקה. למרות פרוטוקול זה מתמקד בעיקר אוכלוסיית תאים חיסוניים בתוך מערכת העצבים ההיקפית, הגמישות של cytometry זרימה כדי למדוד בו זמנית מספר סמנים אומר את אוכלוסיות תאים אחרים מתנה בתוך העצב, כגון תאי שוואן, pericytes , fibroblasts, תאי אנדותל, יכול גם להיות מנותח בשיטה זו. שיטה זו מספקת ולכן אמצעי חדש ללמוד תופעות מערכתיות על מערכת העצבים ההיקפית, כגון neurotoxicology ודגמים גנטיים של נוירופתיה או במחלות כרוניות, כגון סוכרת.
Introduction
תאי המערכת החיסונית אשר להזין את מערכת העצבים ההיקפית של מחזור הדם, כפי שהוגדר על-ידי הביטוי של CD45, CD11b, לעזור לשמור על היושרה של העצב לשחק תפקיד שני התחדשות והתנוונות1. מקרופאגים (המוגדר על ידי הבעת רגשותיהם CD68 עכבר) יכול להיות מוטה כלפי פנוטיפ דלקתיות, ביטוי MHC יותר מחלקה II ו- CD86 על פני השטח (M1), או לכיוון פנוטיפ אנטי דלקתיות, לבטא יותר CD206 תאיים (M2)2 . הטיית של פנוטיפ מקרופאג הוא תהליך דינמי מוסדר באמצעות Akt איתות3, המשקף את הפעילויות השונות של מקרופאגים ההגנה נגד פתוגנים (M1) ואת התפקיד בהתחדשות רקמות (M2). חידוש העצב הפגוע דורשת קודם phagocytosis של המיאלין פסולת על ידי מקרופאגים עצב4,5, וכן אנטי דלקתיות (CD68+CD206+) M2 מקרופאגים הוכחו לקדם את האקסון תוצר ב מערכת העצבים ההיקפית6. למצב של גיוס או מקרופאגים, מערכת העצבים ההיקפית, או יכולת ראייה phagocytosis עלול לגרום התחדשות לקוי ותחזוקה של תקינות עצב. דלקתיות מקרופאגים M1, ביטוי MHC class II, פחות מסוגל phagocytosis מאשר M2 מקרופאגים, הייתה שם דלקת עצביים בפתוגנזה של מחלות ניווניות מספר7.
השינויים המתרחשים המערכת החיסונית תושב העצבים כתוצאה מכך נזק יכול להיות כמותיים, מפגין לאובדן CD45+ לויקוציטים (או גדל חדירה של CD45+ לויקוציטים הדלקת במקרה), או איכותיים, כגון שנה של פנוטיפ מקרופאג מ M2 M1 פנוטיפ. תאים חיסוניים של מערכת העצבים ההיקפית יש באופן מסורתי נותחו באמצעות IF, באמצעות סעיפים קפוא או פרפין-מוטבע גשמי8. אם נדרשת עבור קביעת לוקליזציה של התאים של ריבית. עם זאת, כימות באמצעות אם לעיתים קרובות מסתמך על ספירת מספר קטן יחסית של תאים בקטע הצר של הרקמה, ביצוע כימות לא אמין ופגיעה הטיית בחירה. עבור זיהוי של הנדונים של תאים חיסוניים, זיהוי סמנים חוץ-תאית ו/או תאיים סימולטני נדרש, תוך קביעת פנוטיפ מקרופאג דורש לפחות לפחות שני סמנים, במיוחד CD206 ו- MHC class II. כמו לרוב מיקרוסקופים זמין מוגבלות לערוצי לפחות שני צבעים, כגון fluorescein isothiocyanate (FITC) phycoerythrin (PE), אפיון הנדונים של תאים חיסוניים מאת אם יכול להיות מגבילים ולא שלמים, הדורשים הצורך לקחת מספר שקופיות, נגזר באותו האזור של הריבית, אשר הם כתמים וניתח במקביל. היבט זה זמן רב ולכן אינו הכרחי מרשה לעצמו הניתוח של ערכות מדגם גדולים. יתר על כן, כמו רוב הקריטריונים של עניין הם חוץ-תאית, הזיהוי ברקמות, אשר יש גם להיות מוטבע בתוך פרפין או cryoconserved, עשויה להיות בעייתית עקב שיבוש הקרומיות, המסיכה של epitopes, כמו גם על אובדן האנטיגנים של עניין משימוש של ממיסים, כגון אצטון, מתנול9.
לעומת זאת, flow cytometry, אשר מודד אופטי, קרינה פלואורסצנטית מאפייני תאים בודדים ההשעיה כשהם עוברים דרך קרן של אור, מספק אמצעים מעשיים וכוללת יותר לניתוח של אוכלוסיות תאים. Cytometry זרימה, במקום לייצר תמונה דיגיטלית של הרקמה, מספק של כימות פרמטרים שהוגדרו, הכוללים אינדקס רפלקטיביים, המכונה הפיזור קדמי (FSC), צפיפות רשת/פנימיות מורכבות ובגודל היחסי של התא אוטומטיות או לוואי-פיזור (האס), עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי, מתן כי התא יש כבר עם תוויות של fluorophore המתאים, כגון נוגדן מצומדת. Cytometer זרימה טיפוסית מורכבת שני, לייזרים מקורר; ללייזר מייצרת אור כחול-488 ננומטר, לייזר הליום-ניאון מייצרת אור-633 ננומטר. שילוב זה מאפשר זיהוי, מדידה, בו זמנית, לפחות חמש מטרות או על פני השטח או בתוך תא תאיים. Cytometers זרימה מתקדמות יותר יכולה להיות מורכבת מרובים לייזרים, אשר מאפשרים זיהוי עד שמונה fluorochromes שונים בעת ובעונה אחת, מתן כי שיא פליטת אורכי הגל של fluorochromes שנבחרו אינם חופפים באופן משמעותי.
ניתוח על ידי cytometry זרימה, הרקמה עניין חייב קודם enzymatically ובינינו, בדרך כלל עם collagenase, כדי ליצור השעיה תא בודד. הניתוח של העצבים ממוגלה מאתר בעבר היה קשה בגלל כמות קטנה של רקמת המתקבל בכל עכבר. בנוסף, תכולת שומן גבוהה של המיאלין סביב האקסונים הסלים תא התאוששות ומייצר כמויות גדולות של פסולת. השיטה המתוארת במסמך זה עבור הכנה בעצב ועיכול הותאם פרוטוקול בידוד תאי שוואן הסיכה. et al. 7, שואפת לבודד מספיק תאים מן העצבים של עכברים בודדים לניתוח cytometry זרימה, על מנת להפחית וריאציה בין עכברים. באמצעות דאפי לצורך זיהוי תאים בודדים בשיטה digest רקמות raw עוקף את הצורך להסיר האקסון פסולת, מה שמוביל בדרך כלל איבוד תאים. כביסה מספר פעמים עם איידס מאגר עשיר דטרגנט במהדורה של תאים לכוד בתוך ההריסות שומן, ובכך מגדיל את התשואה. מערכת העיכול של שני עצבים ממוגלה באורך מלא של עכבר אחת לפי פרוטוקול זה יוצר ≥30, 000 אירועים nucleated יחיד, לפחות 3 פעמים את המספר אוחזרה הרפובליקה. חלקם של CD45+ לויקוציטים היה כ- 5% של תוכן התא סך הכל ב"דייגיסט בעצב, כ 5-10% בשיטה DRG digest. הרוב המכריע של CD45+ תאים בעצב הביע את סמני macrophage, CD68 ו- CD206.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פראי-סוג עכברים C57BL/6 (זכרים; 10-12 שבועות) הוחזקו במחזור רגיל h 12/כהה, נמסרו גישה חופשית תקן האוכל דיאט ומים. כל הניסויים בבעלי חיים שנערך בהתאם להנחיות הרלוונטיים על ידי מקומיים בעלי חיים טיפול שימוש הוועדה ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מקומיים ועל שימוש הוועדה ברשות אזורית ב קרלסרוהה, גרמניה (G216/10).
1. זלוף של העכבר
- להקריב את העכבר (C57BL/6; גברים; 10-12weeks) באמצעות CO2 או על פי תקנות מקומיות.
הערה: רטרו-מסלולית דימום ניתן לבצע כדי להשיג שליטה לויקוציטים, באמצעות צינורות מצופים EDTA mL 1.5. שיטה זו של דימום יעיל רק מיד לאחר ההקרבה. שטיפת חלל נוסף, הצפק (PCL) ניתן לבצע כדי להשיג שליטה מקרופאגים, באמצעות PBS מחומם מראש ב 37 ° C כדי להימנע קר התלכדות של הדם, אשר ייתכן ה"בלתי זלוף. - לחטא את העכבר על ידי ריסוס הפרווה על הבטן בנדיבות עם 70% אתנול וי/v שוב ושוב לנגב עם טישו עם גזה כותנה. שימוש במספריים קהים, חתך בעור בטן על ידי חתך האורך.
- לחשוף את חלל הצדר מאת הראשונה ביצוע חתך לתוך הסרעפת באמצעות מספריים מעוגלים, בוטה והארכת ואז את החתך לאורך כל של כלוב הצלעות. לבצע חתך דומה בצד contralateral עד עצם החזה ניתן בזהירות להעלות משם.
- עם תצוגה ברורה של הלב ושל כלי מרכזי, הוספה פרפר 23¾ למדוד. את המחט, מחובר מזרק 50 מ ל מלא PBS קר כקרח, אל החדר השמאלי של הלב.
- בחתך כדי אטריום ימין של הלב באמצעות מספריים איריס ליצירת גדול של פורקן ככל האפשר מבלי להזיק העורקים ולאחר מכן בעדינות לדכא את המזרק לדחוף דרך כ 30 מ של PBS. תפליט אמור לפעול ברורה. קרחת היער של הכבד או הכליות יכול לשמש כמחוון של זלוף טוב.
2. ניתוח בעצב ו- DRG
הערה: עבור ניתוח בירך את העצבים, העור לעיל את העכוז מקסימוס יוסר, העכבר הוא ממוקם בצד הגחוני למטה בעוד שמשתרע על פני הגפיים התחתונות.
- דו צדדיים לנתח את כל העצבים בירך על-ידי הפרדת לרקמת שריר מן הירך הגבי, לעקוב אחרי העצב לאורך עמוד השדרה. חתך העצב היכן תתבצע יציאה מן השדרה ומיד מעל הברך בקצה השני.
הערה: להימנע טיפול מופרז של עצב כמו ריסוק או משיכת עם מלקחיים. - באמצעות מלקחיים, להעביר את nerve(s) נכרת, כ- 2 ס מ לכל חוצפה, צינור 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של PBS קר כקרח, חנות על קרח.
הערה: העצב ניתן לאחסן במשך הלילה על קרח.
הערה: רוברט DRG, באמצעות מלקחיים, אזמל, לנתק את העור מן הרקמות הרכות המשמשת כבסיס על-ידי פילינג בעדינות את העור בגב נותרת כדי לחשוף את האזורים בעמוד השדרה המותני, צוואר הרחם, מותניים. הסר את הראש על ידי חיתוך בבסיס הגולגולת בעזרת זוג מספריים בוטה. - חותכים את הצלעות מקבילים עם וקרוב השדרה משני הצדדים, לפני ניתוק את הקרביים מחובר הצד הקדמי של עמוד השדרה. לחתוך את עצמות הירך, להסיר את עמוד השדרה על ידי רוחבי לחתוך ברמה של עצמות הירך. באמצעות מספריים איריס, לחתוך כל שריר, שומן, רקמות רכות אחרות מעמוד השדרה.
- מקם עמוד השדרה עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה לפתוח אותו, החל בסוף סימטרית, על-ידי החלקת אחת קצה המספריים לתוך תעלת השדרה בשעה שלוש המיקום ואת העצם להיחתך. חזור על הפעולות במיקום תשע בערב.
הערה: חשוב לחתוך בדיוק במרכז כדי למנוע נזק הרפובליקה. - חזור על החיתוך מ מצד לצד עד לסופו rostral חוט השדרה נחשף במלואו. באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, הסר את חוט השדרה כדי לחשוף את עצבים בעמוד השדרה, אשר יכול לשמש כדי לאתר את DRGs בתוך עמוד השדרה.
- להסיר את DRGs המותני על ידי בעדינות המשוחררים על השורש העזוב כדי למשוך את DRG לתעלות החוליות, ואז מסיכה את העצבים ואת רקמת חיבור עם מספריים איריס כדי להסיר את DRGs.
הערה: זה אפשרי להגביל את האיסוף הרפובליקה L4-L6, אשר תורמים בעצב. - באמצעות מלקחיים, להעביר DRGs את צינור 1.5 mL המכיל כ 1 מ"ל של PBS קר כקרח, ולאחסן על קרח.
הערה: העצב ניתן לאחסן במשך הלילה על קרח.
3. עיכול בעצב ו- DRG
- להכין את התקשורת עיכול (DMEM, 10 מ מ HEPES, 5 מ"ג/מ"ל BSA, 1.6 מ"ג/מ"ל collagenase Type 4) בתוספת µg/mL 100 של deoxyribonuclease, חנות על קרח.
הערה: כמות בינונית עיכול הנדרש לכל העכבר (ממוגלה עצבים + DRGs) היא 1 מ"ל. ברגע מוכן, aliquots של התקשורת עיכול ניתן לאחסן ב-20 ° C. - העברה ממוגלה ואת DRGs של עכבר אחד לתוך צינורות mL 1.5 נפרד המכיל 500 µL של מערכת העיכול מדיה. גדול בירך, חותכים את החומר לחתיכות 15-20 באמצעות מספריים האביב, אז דגירה של המתלים רקמות בתוך חממה חזק ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם עצבנות עדין (≤ סל ד 450).
- שוב ושוב triturate התליה תא דרך 1,000 µL פיפטה עצה מכנית מביצועם כל רקמות שהיישום מעוכל.
הערה: אם ההשעיה קשה titrate, ואז לחתוך את הקצה פיפטה עם מספריים כדי ליצור קצה קהה. דגירה ההשעיה רקמות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם עצבנות עדין (≤ סל ד 450). - אני חוזר על trituration באמצעות טיפ פיפטה µL 1,000, תקופת דגירה של 10 דקות נוספות ב 37 ° C עם עצבנות עדין (≤ סל ד 450).
- הכנת המאגר FACS (PBS בתוספת 10% FCS ו- 1 מ מ EDTA) ולאחסן על קרח. שוטפים ומשרים מסך נירוסטה עם גודל רשת של 140 מיקרומטר עם FACS מאגר ב 60 x 15 מ"מ פטרי על קרח.
הערה: ניילון מסנני יש להימנע ככל זה מוביל לאובדן משמעותי בתפוקה של תאים nucleated. - שוב ושוב לעבור את המתלים רקמות דרך המסנן מסך מיקרומטר 140, כמו זה החזיק מעל את צלחת פטרי, עם מלקחיים בוטה, על קרח. לאסוף את המתלים תא הפטרי, להעביר אותו צינור 1.5 mL המאוחסנים על קרח.
- לדחוף כל רקמות שהיישום מתעכל הנשאר מסנן דרך על-ידי trituration חוזרות ונשנות עם טיפ פיפטה 1,000 µL. לשטוף את המסנן מסך פעמיים עם 500 µL מאגר FACS ולאסוף התליה תא וכתוצאה מכך בצלוחית הפטרי לשלב עם התליה תא מהשלב 3.6.
הערה: אם cytometer זרימה המשמש רגישים פסולת, התליה תא מהשלב 3.7 ניתן להעביר דרך מסנן מסך מיקרומטר 70; עם זאת, זה עלול להוביל לאובדן בתפוקה של תאים nucleated. - Centrifuge את המתלים תא ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר FACS. חזור על שלב זה כביסה פעם אחת.
- Resuspend בגדר תא ב- 150-350 µL מאגר FACS, בהתאם למספר של צביעת כי הם נדרשים (150 µL FACS מאגר לכל לוח מכתימים).
4. צביעת בעצב, DRG עם נוגדנים Fluorescently עם תוויות עבור Cytometry זרימה
- העברת µL 100 בעצב או ההשעיה תא DRG לתוך בצורת V גם צלחת 96-ובכן על קרח.
הערה: תאים שהוכתמו יחיד נחוצים לכל הנוגדנים כפי שהם תספק את הפקדים הדרושים להגדרת cytometry זרימה של האופטיקה צינור (PMT) מתח רווחים, פיצויים, כמו גם כדי לסייע באבחנה ספציפי מן כריכת שאינם ספציפיים. בשל החומר מוגבלת זמין בעצב, DRGs, דם לויקוציטים ו מקרופאגים מ PCL (שלבים 1.1-1.2) יכול לשמש הפקדים שהוכתמו יחיד, ההכתמה עבור אשר צריכה להתבצע במקביל ההכתמה של פציעה עצב, DRGs. - בריכת הנותרים תאים המתלים (כ 50 µL עבור דגימה) בירך העצבים או דגימות DRG, כדי לשמש פקד וללא רבב.
- Centrifuge את הצלחת ב g x 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך את הצלחת על סל והחלת תנועה חדה של כף היד, טפח בעדינות יבש על מגבות נייר.
- צביעת משטח, resuspend אחד של כדורי תא ב- µL 20 FACS מאגר המכיל את הנוגדנים עניין (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 ו- MHC Class II-ביוטין), דגירה, מוגן מפני אור, על קרח למשך 30 דקות.
הערה: (1) דילול נוגדן אופטימלית צריך להיות נחוש לפני השימוש על ידי ביצוע סדרה דילול על פי המידע על מוצרים של היצרן; (2) stainings שאינו ספציפי יכול להיות מופחת על ידי דגירה עם Fc-גוש בשלב זה, בהתאם להוראות היצרן; (3) Isotype בקרת stainings הם בדרך כלל לא נדרש בעת השימוש העיקרי נוגדנים מצומדת ישירות עם fluorophore ו/או כאשר antigen(s) עניין לייצר אוכלוסיות נפרדות. - להוסיף µL 130 FACS מאגר כל טוב, centrifuge את הצלחת ב g x 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע כפי שתואר קודם לכן (שלב 4.3). ולשטוף את כדורי תא פעמיים עם 150 µL מאגר FACS.
הערה: אם באמצעות נוגדן ראשוני unconjugated או של נוגדן ראשוני מצומדת כדי ביוטין, לאחר מכן ריאגנט המשני המתאים, מצומדת אל fluorophore, ניתן להוסיף בשלב זה, חוזרים על השלבים 4.4-4.5. במקרה של פרוטוקול זה, שימש streptavidin-PE/Cy7 או Streptavidin-PerCP כדי לזהות MHC Class II בשילוב עם CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, או בשילוב עם CD68-APC, F4/80-PE/Cy7, בהתאמה. - עבור קיבעון, לאחר השלב האחרון כביסה, resuspend תא כדורי ב- 100 µL של 4% paraformaldehyde ב- PBS (pH 7.4). דגירה על הלוחית קרח למשך 10 דקות, ואז צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע כפי שתואר לעיל (שלב 4.3) ולשטוף את כדורי תא פעם אחת עם 150 µL מאגר FACS.
התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת כגון כפפות, משקפיים, וכו '.
הערה: Resuspend כדורי תא ב- 150 µL של המאגר FACS וחנות מוגן מפני האור, ב 4° C עד 2 ימים. אם לא מכתים תאיים נדרשת, ואז להמשיך לשלב 4.11 לאחר צריך שתוציאו את הצלחת ב g 400 x דקות 5-4 מעלות צלזיוס. - צביעת תאיים, resuspend תא כדורי ב- 150 µL של סבון buffer+0.5% FACS, דגירה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור במשך 15 דקות צנטריפוגה הצלחת ב 400 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע כפי שתואר לעיל (שלב 4.3) ולשטוף בגדר תא פעם אחת עם 150 µL של המאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי. Resuspend בגדר תא ב 20 µL של FACS buffer+0.5% סבון המכיל את הנוגדנים עניין (CD68-APC, CD206-PE), דגירה, מוגן מפני אור, בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- להוסיף µL 130 של סבון buffer+0.5% FACS מכל קידוח, centrifuge את הצלחת ב g x 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע כפי שתואר קודם לכן (שלב 4.3). ולשטוף את כדורי תא פעמיים עם 150 µL של המאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי.
הערה: אם באמצעות נוגדן ראשוני unconjugated או של נוגדן ראשוני מצומדת כדי ביוטין, ואז ריאגנט המשני המתאים, מצומדת אל fluorophore, ניתן להוסיף בשלב זה וחזר צעדים 4.9-4.10. - Resuspend תא כדורי ב- 150 µL של המאגר FACS + 0.5% דטרגנט, חנות, מוגן מפני האור, ב 4 ° C עד 2 ימים.
- Resuspend כדורי תא עם מאגר FACS µL 150 + 0.5% חומר ניקוי בתוספת 5 µg/mL דאפי, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור. Centrifuge את הצלחת ב g x 400 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע. כאמור תיאר (שלב 4.3).
- Resuspend תא כדורי ב- 150 µL של PBS, העברה שפופרת FACs שכותרתו כראוי. לאחסן בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור, עד מוכן לניתוח.
הערה: לאחר resuspension ב- PBS, התאים צריך להיות מנותח בתוך שעות, מאז דאפי לאט מביצועם של ה-DNA, שמוביל לאובדן אות.
5. ההתקנה של Cytometry זרימה, ריצה של דגימות
- ודא כי cytometer זרימה מצויד עם לייזרים המתאים או מסנן מגדיר כדי למדוד את fluorophores להשתמש כדי להכתים את התאים. זה יכול להיקבע תחת תצורת cytometer ברירת המחדל במערכת. במקרה של פרוטוקול זה, תאים נותחו באמצעות cytometer של זרימה מצויד בשלושה לייזרים (405 ננומטר, 488 ננומטר, 633 ננומטר) המאפשר איתור ≤ 5 fluorophores.
- בחר הערוצים המקובלים גילוי של fluorophores עניין. כל אותות פלואורסצנט מזוהים ביותר עם הגברה לוגריתמי.
- בחר את קצב הזרימה המתאימה על הדגימות. פרמטר זה יכול להשתנות בהתאם המשמש את המחשב, עליך להיות החלטי מדעית. במקרה של פרוטוקול זה, קצב זרימה של MED-להי (35-60 µL/דקה) נעשה שימוש כדי למנוע סתימת של המחט.
- בחר את המספר הכולל של אירועים/תאים להיות שנאספו עבור דגימה. המספר המינימלי של אירועים צריך להיות 1,000,000.
- ליצור פיזור החלקות תחת גליון עבודה גלובלי של האס-A לעומת FSC-A, כמו גם עבור כל fluorophore עניין לעומת FCS-א יצירת תצוגה סטטיסטי אשר יציג את מספר האירועים ואת עוצמת פלורסנט רשע (MFI) עבור fluorophores שנבחר.
- להגדיר את המתח של ערוצי FSC-A והאס-A, כך התאים הקטנים להשתלב השמאלי התחתון 10% של העלילה פיזור. לקבוע רקע זריחה זריחה המדגם המינימלי מהפקדים מוכתם ממוגלה העצבים או DRGs. לקבוע שער האב (P1) בהתבסס הפיזור עלילה של דאפי בלבד צביעת פקדים.
הערה: זה לא שער אוסף, בשל בחלקו, לטבע הטרוגנית של דאפי + האוכלוסייה מערכת העצבים ההיקפית. - באמצעות פיזור FSC את מתווה עבור כל אחד fluorophores של עניין, להתאים את המתחים כך התאים של הפקד מוכתם ליפול ברבעון התחתון לחלקות פיזור המתאימים שלהם. גייטס ואז נוצרים מעל אזור זה להגדרת תאים אלה הם חיוביים עבור כל אחד סמני/fluorophores בהתאמה. המיקום של שער אושר על ידי ריצה של הפקד שהוכתמו יחיד (שלב 4.1).
הערה: פיצוי חופפים ספקטרום הפליטה ניתן לבצע בשלב זה או להחיל retrospectively עם התוכנה המתאים לניתוח. - ברגע cytometer זרימת הוגדר, כמתואר, ניתן להפעיל את הדגימות.
- לאחר הבריחה החומרים דגימה הנותרים יכולים להימחק, ניתן לייצא את הקבצים FCS לצורך ניתוח נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המתלים תא עצבי ממוגלה באורך מלא והן DRG וכל השברים המוכן, לפי הפרוטוקול, עכברים C57BL/6 בריא שש, מחולק aliquots שווה שלוש עבור צביעת. מונה מכתים עם דאפי, אשר כתמי דנ א, מאפשר איתור אוכלוסיה תא בודד (איור 1 א'–B, החלונית העליונה). לשטוף החוצה את דאפי, לפני ניתוח לפי cytometry זרימה, ירד במידה מסוימת את עוצמת פלורסנט ההריסות שאינם nucleated, מה שמאפשר עבור הבחירה של אוכלוסיה דיסקרטית על הציר-FSC של אירועים nucleated יחיד או ללבישה. שום שער אוסף מוחל כמו ללבישה של מערכת העצבים ההיקפית משתרעים על טווח גדול של FSC וחדר האס (איור 1C). החומר בקצה הגבוה של הציר FSC, אשר מכיל שהיישום מתעכל רקמות, לא ייכללו בבחירה של האוכלוסייה גופיה (איור 1 א'–B). באמצעות מגרש צפיפות (החלונית התחתונה) כדי להציג את התוצאות עשויה להקל על הכללת ההריסות גדולים (החלונית התחתונה). סך של 30,000 ללבישה ≥ ניתן להשיג באופן קבוע שני עצבים ממוגלה מלאה, ≥200, 000 ללבישה ניתן להשיג DRGs (איור 1D). מן העצבים בירך, כ- 5% של ללבישה הביעו CD45 על פני השטח, בעוד כ- 5-10% נמצאו את DRGs, ובכך הגדרת התאים האלה לויקוציטים ממוצא hematopoietic (איור 2 א).
רוב CD45+ ללבישה באה לידי ביטוי גם מחלקה MHC II, באופן הדרגתי (איור 2B). ב DRGs, CD11b יכול לשמש כדי לזהות תאים, כמו microglial (CD45עמום, MHCII+ , CD11b+) (איור 2B, החלונית העליונה). עם זאת, אוכלוסייה זו מיקרוגלייה נעדר מן העצבים בירך (איור 2B, החלונית התחתונה). רוב ללבישה לבטא CD45 ב מערכת העצבים ההיקפית הם CD68+ מקרופאגים. בעצב, DRG, 2-5% ללבישה מבוטא CD68 (איור 3 א). כל התאים לבטא גם CD68 מבוטא CD45 (נתונים לא מוצג). ב DRGs, CD68+ מקרופאגים היו יותר הטרוגנית בביטוי שלהם של שני MHC כיתה II ו- CD206, סמן M2 מקרופאגים, מאשר העצבים בירך (איור 3B–D). העצבים בירך, רוב מקרופאגים שותף ביטוי MHC בכיתה II ו- CD206 (איור 3B–D, לוחות התחתון); בדרך כלל, כ- 60-80% CD68+ מקרופאגים הביע CD206, בעוד אחוז יותר קטן של CD68+ הביע שיתוף CD206, DRGs (איור 3B). מעניין, דה מרקר מקרופאג M1 CD86 אפשרות לייצר כל מכתים חיובית גם על מקרופאגים עצב או מ- PCL (נתונים לא מוצג). דה מרקר macrophage, F4/80, הראה ביטוי הטרוגנית ב DRG והן ממוגלה העצבים (איור 3B–C), צביעת שיעור של CD68– MHCII– תאים. יתר על כן, ביטוי F4/80 לא לגמרי חופפים עם הביטוי CD68.
איור 1: נציג נתונים מניתוח cytometry זרימה של דאפי מוכתם nucleated תאים מן DRG בעצב. כל האירועים שנאספו, ומוצגים כפי scatterplots (החלונית העליונה) או צפיפות מתווה (החלונית התחתונה), מ- DRG (א) או (B) בעצב (SN) של עכבר נציג אחד. חיצים הפאנלים התחתון מציינים את השערים, למעט החומר בראש הציר FCS. (ג) חזרה-gating התאים שנאספו בשער דאפי-(ללבישה), המוצגים בחלונית (א) על מגרש פיזור האס לעומת FSC. (ד) מספר ללבישה SN והן DRG וכל השברים של שישה עכברים C57BL/6 בריאים. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Flow cytometry ניתוח משטח הביטוי של CD45, מחלקה MHC II, ו CD11b על ללבישה DRG, בעצב. אירועים נבחרים דאפי-השער (ללבישה) המוצגת באיור 1 נותחו. (א) שיעור ללבישה לבטא CD45 בעצב (SN) ו- DRG מ 6 בקרת עכברים. פיזור נציג (B) חלקות של ללבישה DRG (החלונית העליונה), SN (החלונית התחתונה). התאים לבטא CD11b מסומנים בצבע כחול. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Flow cytometry ניתוח משטח הביטוי של CD68, מחלקה MHC II, ו CD206 על ללבישה DRG, בעצב. אירועים נבחרים דאפי-השער (ללבישה) המוצגת באיור 1 נותחו. (א) שיעור ללבישה לבטא CD68 בעצב (SN), DRGs של שישה עכברים C57BL/6 בריאים. (B) מקרופאגים פרופורציה של CD68+ משותפת להביע CD206 SN ו DRG מ 6 עכברים C57BL/6 בריאים. (ג) פיזור נציג חלקות ללבישה DRG (החלונית העליונה), SN (החלונית התחתונה) מציג CD68 MHC class II הבעה. (ד) נציג פיזור חלקות ללבישה DRG (החלונית העליונה), SN (החלונית התחתונה) מציג את הביטוי CD68 ו- CD206. התאים לבטא F4/80 מסומנים בצבע מגנטה. נתונים מייצגים זאת אומרת ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
העצבים ממוגלה מכילים אחוז גדול של שומנים, כגון כולסטרול, עקב התוכן של המיאלין סביב האקסונים. מאז לשנות המאפיינים של ליפידים עם טמפרטורה, ניתן לקבל תוצאות שונות בטמפרטורות שונות. כדי להבטיח שימור תא, כל השלבים פרוטוקול זה לאחר העיכול בוצעו על קרח. בעוד עקביות מומלץ למען הפארמצבטית של התוצאות, ייתכן שתהיה אפשרות להגדיל את התשואה על-ידי ביצוע השלבים 3.6 ו 3.7 בטמפרטורת החדר. אם העצבים בשלב 3.8 שיש לא מספיק מתעכל, חתיכות קטנות של עצב יהיה גלוי על רשת השינוי. במקרה של עיכול לא מספיקות, החומר נשמר על רשת השינוי יכול להיות מחדש מתעכל על ידי העברת צינור 1.5 mL המכיל 250 µL עיכול ומדיה חוזר צעדים 3.2-3.6. אם התשואה הוא עני, אז מדגם של התליה תא, לאחר עובר דרך המסך רשת (שלב 3.6) צריך להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ אור עם trypan blue. התאים קיימא, הלא-כחול, צריכים להיות גלויים יחד עם מבנים דמויי-רוד, אשר הם פרגמנטים של אקסונים. אם לא התאים קיימא קיימות, ואז העיכול התנאים ו/או של שגוי מסירת החומר גרמה נמק. אם רק אגרגטים גדולים גלויים, ואז מומלץ כדי לאסוף את החומר על ידי צנטריפוגה וחזור העיכול (שלבים 3.2-3.6).
השיטה של ניתוח תזרים cytometer של העצבים ממוגלה מאתר, DRGs הוא שימושי עבור שאלות מעורבים כל העצבים, מספר DRGs. לאחרונה היו עניין מוגבר הניתוח של מערכת העצבים ההיקפית שימוש לזרום cytometry11,12 . ליו. et al. פיתחו שיטה באמצעות פפאין ועל מכניים דיסוציאציה של העצבים בירך, DRGs באמצעות 21 G ו- 23 גרם לנתח באופן ספציפי רק 1 ס מ סעיף של העצב, ובכך לאפשר לניתוח של עצב חומר מאתרים ספציפיים פציעה-11. השיטה המוצגת כאן מומלצת לשימוש כאשר ההשפעה על מערכת העצבים ההיקפית צפוי להיות מערכתית, neurotoxicology, דגמים גנטיים של נוירופתיה או במחלות כרוניות, כגון סוכרת. בשל התשואה נמוכה של תאים nucleated המתקבל בעצב, לא מומלץ לנסות ללמוד אוכלוסיות קטנות עם ≤ 100 מגודרת אירועים עכבר בודדות. עם זאת, איגום של חומר מספר עכברים להקל על לימוד כזה אוכלוסיות קטנות בתוך העצב. בכל זאת, זה יהיה עניין לחקור אם הדיסוציאציה אנזימטי רקמות באמצעות מחטים פפאין ו- 21G / 23G מתוארת על ידי ליו. et al. 11 יכול להיות משולב עם צביעה cytometry זרימה של גרעינים, כפי שמתואר במחקר זה, כדי לשפר את התשואה של תאים בודדים. היכולת לנתח כמויות קטנות מאוד של רקמה חיונית לביצוע השוואה בין ipsi - DRGs contralateral בעקבות חד-צדדית בעצב axotomy. עם זאת, זה מעבר להיקף של מחקר זה. מעניין, סמני נפוץ עבור זיהוי של מקרופאגים נמצאו יש ביטוי הטרוגנית באופן בלתי צפוי מערכת העצבים ההיקפית של עכברים. למשל, CD11b ו- F4/80 נמצאו להתבטא על חלק גדול של הלא-hematopoietic, ללא אנטיגן הצגת תאים בעצב והן DRGs. יתר על כן, בהעצבים בירך, לא כל CD68+ מקרופאגים הביע CD11b ו- F4/80, כפי היה לצפות מן המחקר של איברים אחרים. לכן מומלץ כי הוא נלקח זהירות בעת שימוש סמנים אלה לצורך המחקר של מקרופאגים, מערכת העצבים ההיקפית ואת סמנים אחרים, כגון CD163, צריך להיחקר. יתר על כן, יש גם להקים הרגישות של הסמנים השונים לדיסוציאציה אנזימטי זה אולי הסבר ההבדלים נצפתה בביטוי, כגון CD11b או F4/80.
פרוטוקול זה שימש בעבר כדי לנתח את תאי מערכת החיסון מערכת העצבים ההיקפית לאחר אתגר רעיל עם streptozotocin (STZ)13, חומר כימי משמש בדרך כלל תנאי הגיוס של סוכרת אורגניזמים מכרסמים מודל. זה הוצג כי STZ, המפעילה גם TRPV1 וגם TRPA1, בתחילה גורמת של דלדול של תאים חיסוניים בעצב והן DRGs, בעוד לא גורם לדלקת כל העצב. למרות המספרים של תאים חיסוניים ב DRGs התאושש, תאים חיסוניים ובמיוחד מקרופאגים היו עדיין משמעותית מטעינת שלושה שבועות להציב אתגר רעילים. זה היה לאחר מכן שיערו כי phagocytosis מקרופאג של פסולת עצב, וכתוצאה מכך מפגיעה על ידי יון ערוץ אי-שקט ייתכן שהובילו אפופטוזיס של המקרופאגים, וכתוצאה מכך דלדול שלהם מהאוכלוסייה הכללית תא. לא ידוע כיצד משפיעות על רעלים אחרים במערכת העצבים ההיקפית מקרופאגים תושב עצב. אם דלדול של מקרופאגים תוצאה נפוצה של סוכנים כאלה זה עשוי להיות השלכות לטיפול.
נמצא כי רק 5-10% של תאים nucleated של העצב היו לויקוציטים ממוצא hematopoietic. התאים הנותרים הם ככל הנראה תערובת של תא עצב סוגים אחרים, כלומר תאי שוואן, pericytes fibroblasts, תאי אנדותל. בשל קיבולת של מערכות cytometry זרימה כדי למדוד פרמטרים מרובים, ומספקת שקיימים סמנים ספציפיים ו/או נוגדנים זמינים, זה מתקבל על הדעת כי אלה סוגי תאים יכול גם להיות מנותח בשיטה זו. שיטה זו תואר עבור חומר מאתר. עם זאת, עם מספר שינויים, זה שימש גם עבור הניתוח של מערכת העצבים ההיקפית חומר של חזיר ושל אנושיות. הוא צפוי כי שיטה זו יהיה יותר שימושי עבור הניתוח של חומר של מינים גדולים יותר מאשר עכברים, בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לגבי מחקר זה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי פתוח (DFG; SFB1118). המחברים רוצה להודות אקסל ארהרד עבור ביצוע רוב הקרע והעברת ומרווח הידע הזה, ד ר אקשטיין וולקר על סיוע בהיבט הטכני של cytometer הזרימה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
