Summary
정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
말 초 신 경계 (PNS) 신경 상주 면역 세포는 건강 한 신경에 신경 원 완전성을 유지 하기 위해 필수적입니다. PNS의 면역 세포는 상해 및 질병, 신경 기능 재생 능력에 영향을 미치는 영향을. 신경 면역 세포 면역 형광 검사 (면)에 의해 일반적으로 분석 된다. 경우 경우 신경에 면역 세포의 위치를 결정 하기 위한 에센셜만 반 정량적 이며 방법은 동시에 분석할 수 있는 마커 수와 표면 식의도로 제한 하는 동안. 이 연구에서 cytometry 좌 골 신경이 나 개별 쥐의 지 루트 절 (Drg)에 백혈구 침투의 정량 분석을 위해 사용 되었다. 단일 세포 분석 DAPI를 사용 하 여 수행 하 고 여러 가지 단백질 동시에 표면 또는 세포내 식에 대 한 분석 했다. 이 프로토콜에 따라 치료 한 마우스에서 두 좌 골 신경 ≥ 30000 단일 nucleated 이벤트 생성. 좌 골 신경, CD45의 식에 의해 결정에 백혈구의 비율이 전체 셀 내용 좌 골 신경에서의 5%와 대략 5-10%는 DRG에 약 했다. 하지만이 프로토콜 PNS 내 면역 세포 인구에 주로 초점을 맞추고, cytometry 마커 수를 동시에 측정 하의 유연성 즉 신경, Schwann 세포, pericytes 등 내의 다른 세포 인구 섬유 아 세포와 내 피 세포, 또한 분석 될 수 있다이 방법을 사용 하 여. 따라서이 메서드는 PNS, neurotoxicology 등 신경 병 또는 당뇨병 같은 만성 질환에서 유전자 모델에 조직의 효과 공부에 대 한 새로운 의미를 제공 합니다.
Introduction
면역 세포는 순환에서 PNS를 입력 CD45 그리고 CD11b의 식에 의해 정의 된 대로 재생 및 변성1에서 두 역할을 신경의 무결성을 유지 도움이. 대 식 세포 (그들의 표현의 CD68 마우스에 의해 정의 된) 더 MHC를 표현 하는 염증 성 표현 형을 향해 왜곡 수 있습니다 클래스 II 및 CD86 (M1), 그들의 표면에 또는 항 염증 제 표현 형으로 표현 더 많은 세포내 CD206 (M2)2 . 대 식 세포 표현 형의 기울이기 Akt 신호3, 반사 체 (M1)에 대 한 방어에 대 식 세포 및 조직 재생 (M2)에서 역할의 다양 한 작업을 통해 규제 하는 역동적인 과정 이다. 손상 된 신경의 재생 먼저 신경4,5, 및 항 염증 세포 myelin 파편 식 균 작용 해야 (CD68+CD206+) M2 세포 축 삭 파생물에 홍보 보였다는 PNS6. PNS, 채용 또는 대 식 세포 감소 또는 먹어서 장애인된 능력 장애인된 재생 및 신경 무결성의 유지 관리 될 수 있습니다. 염증 성 m 1 대 식 세포, MHC 종류 II, 표현 M2 세포 보다 덜 먹어서 수 있으며 신경 염증은 여러 가지 신경 퇴행 성 질병7의 병 인에 연루.
신경 거주 면역 체계 손상 때문에 발생 하는 변화는 양적, CD45의 손실에 명시 수 있습니다+ 백혈구 (CD45의 침투를 증가 또는+ 경우 염증에 백혈구), 또는과 같은 질적 m 1 형 m 2에서 대 식 세포 표현 형의를 변경 합니다. PNS의 면역 세포는 전통적으로 냉동된 섹션 또는 파라핀 끼워 넣어진 소재8를 사용 하 여 IF를 사용 하 여 분석 되었습니다. 만약 관심의 세포의 지역화를 결정 하는 데 필요한. 그러나, 부 량 사용 하는 경우 종종 불안정 하 고 취약 선택 바이어스에 정량화를 만드는 조직의 좁은 부분에 셀의 상대적으로 작은 수를 계산에 의존 합니다. 면역 세포의 특정 하위 집합의 식별을 위해 세포 외 또는 세포내 표식의 동시 검출이 필요, 대 식 세포 표현 형의 결정은 적어도 두 개 이상 표시, 특히 CD206와 MHC를 필요 합니다 하는 동안 클래스 Ii입니다. 가장 일반적으로 사용 가능한 현미경 fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 phycoerythrin (PE), 적어도 2 색상 채널에 제한 됩니다 경우 면역 세포의 특정 하위 집합의 특성 수 제한 하 고, 불완전 한 요구 얼룩이 고 병렬로 분석 필요 여러 슬라이드는 동일한 지역에서 파생. 이 시간이 많이 걸리는 측면은 따라서 하지 않습니다 필요한 큰 샘플 세트의 분석에 빌려. 또한, 관심의 표시의 대부분은 세포 외, 중 파라핀 또는 cryoconserved에 포함 되어, 조직에서 검출 수 막 무결성의 파괴와 epitopes, 마스킹의 손실 때문에 문제 아세톤과 메탄올9같은 용 매를 사용 하 여 관심의 항 원.
대조적으로, cytometry, 광학 측정 흐름 고 형광 특성에에서 단일 셀의 빛의 광선을 통과 제공 합니다 셀 인구의 분석을 위해 더 실용적이 고 포괄적인 의미. 셀의 상대적인 크기와 앞으로 분산형 (FSC), 복잡 한 단위/내부로 반사 인덱스를 포함 하는 매개 변수 설정된의 자동화 된 정량화를 제공 하는 조직의 디지털 이미지를 생산 하는 것 보다는 cytometry, 또는 측면 살포 (SSC), 그리고 상대 형광 강도 제공 하는 셀 활용 된 항 체와 같은 적절 한 fluorophore와 분류 되었습니다. 전형적인 교류 cytometer 이루어져 있다 2, 공 냉 식된 레이저; 488에서 푸른 빛을 생산 하는 아르곤 레이저 및 헬륨-네온 레이저 생산 633에 빛 nm. 이 조합은 최소 5 목표 표면에 또는 세포내 구획 내에서 동시에, 탐지 및 측정, 대 한 수 있습니다. 고급 흐름 cytometers 허용 한 번에 최대 8 개의 다른 형광의 탐지를 위해 선택 된 형광의 피크 방출 파장 크게 중복 되지 않도록 제공 하는 여러 레이저 구성할 수 있습니다.
Cytometry 분석, 대 한 관심의 조직 해야 합니다 먼저 수 효소 소화, 일반적으로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 콜라와 함께. 분석 murine 좌 골 신경의 이전 조직의 각 마우스에서 얻은 작은 금액으로 인해 어려운 되었습니다. 또한, 축 삭 주위 myelin의 고 지방 내용 셀 복구를 저해 하며 많은 양의 파편을 생성 합니다. 좌 골 신경 준비 및 소화에 대 한 여기에 설명 된 메서드 외. 여 자용 머리 핀 Schwann 세포 격리 프로토콜에서 적응 시켰다 7, 그리고 쥐 간의 편차를 줄이기 위해 충분 한 흐름 cytometry 분석에 대 한 개별 쥐의 신경 세포를 분리 하는 것을 목표로. DAPI를 사용 하 여 원시 조직 다이제스트에서 단일 세포의 식별에 대 한 축 삭 파편, 일반적으로 셀 손실에 이르게 제거할 필요가 circumvents. 셀의 출시에 세제-풍부한 버퍼 에이즈로 여러 번 세척 수확량 증가 지방 파편 안에서 갇혀. 이 프로토콜에 따라 단일 마우스에서 두 길이 좌 골 신경의 소화 ≥30, 000 단일 nucleated 이벤트를 생성 하 고 3 배 이상 그 숫자는 DRG에서 검색. CD45 비율+ 백혈구는 총 셀 내용 좌 골 신경 다이제스트 및 약의 약 5% DRG 다이제스트에서 5-10%. 대부분은 CD45의+ 좌 골 신경에 있는 세포 대 식 세포 마커, CD68 및 CD206을 표현.
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Protocol
야생-타입 C57BL/6 마우스 (남성, 10 ~ 12 주) 표준 12 h 명암 주기에서 유지 했다 그리고 표준 차 다이어트와 물에 대 한 무료 액세스를 제공 했다. 모든 동물 실험 지역 동물 관리 및 사용 위원회 관련 지침에 따라에서 실시 하 고 Karlsruhe, 독일 (G216/10)에 지역 권위에서 로컬 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 마우스의 관류
- 희생 마우스 (C57BL/6; 남성; 10-12weeks) CO2 를 사용 하 여 지역 규정에 따라.
참고: EDTA 코팅 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 제어 백혈구를 수행할 수 있습니다 복고 궤도 출혈. 이 방법은 출혈만 희생 직후 효율적입니다. 더, 복 막 구멍 게 (PCL) 융합 관류를 방해할 수 있습니다 혈액의 찬 들을 피하기 위해 37 ° C에서 미리가 열된 PBS를 사용 하 여 제어 세포를 얻기 위해 수행할 수 있습니다. - 후 한 70 %v / v 에탄올과 모피는 복 부에 살포 하 고 반복적으로 코 튼 거 즈와 휴지로 닦아 하 여 마우스를 소독. 세로 절 개 하 여 복 부 피부 오픈 컷 무딘가 위를 사용 하 여.
- 처음 만드는 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 및 다음 흉 곽의 전체 길이 따라 절 개를 확장 횡 경 막으로 절 개 하 여 흉 막 캐비티를 노출 합니다. 흉 골 떨어져 신중 하 게 해제를 수 때까지 contralateral 쪽에 비슷한 상처를 확인 합니다.
- 심장과 주요 혈관의 명확한 전망, 삽입 나비 23¾ 계기 바늘, 50 mL 주사기에 연결 되어 심장의 왼쪽된 상공에 얼음 처럼 차가운 PBS, 가득 합니다.
- 하강 대동맥 손상 없이 가능한 콘센트의 대형을 아이리스가 위를 사용 하 여 심장의 오른쪽 아 트리 움을 절 개 하 고 다음 주사기를 약을 부드럽게 우울 30 mL PBS의. exudate 분명 실행 되어야 합니다. 간 및 신장의 좋은 관류의 지시자로 사용할 수 있습니다.
2입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 해 부
참고: 좌 골 신경의 해 부에 대 한 gluteus 막시무스 제거 되 고 마우스는 피부 위의 위치 복 부 측 아래로 더 낮은 사지에 밖으로 기지개 하는 동안.
- 양측 위 지 허벅지에서 근육 조직을 구분 하 여 전체 좌 골 신경 해 부 고 신경 척추를 따라 따라. 잘라 신경 척추에서 및 즉시 다른 끝에서 무릎 위에 어디 종료 됩니다.
참고: 분쇄 또는 당기는 집게와 같은 신경의 과도 한 처리를 하지 마십시오. - 집게를 사용 하 여 삭제 nerve(s), 신경, 얼음 처럼 차가운 PBS와 얼음가 게의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 약 2 cm 전송.
참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다.
참고: DRG 절 개, 포 셉, 메스를 사용 하 여에 대 한 분리는 기본 부드러운 조직에서 피부 노출 자 궁 경부, 흉부, 요 추 척추 지역 나머지 다시 피부를 벗 겨 부드럽게 합니다. 무딘가 위의 쌍을 사용 하 여 두개골의 기지에서 절단 하 여 머리를 제거 합니다. - 척추의 앞쪽 측면에 연결 된 내장을 분리 하기 전에 갈비뼈를 병렬와 척추 양쪽에 가까이 잘라. 화관을 잘라 고는 화관의 수준에서 컷 통과 의해 척추 열을 제거 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여 모든 근육, 지방, 그리고 척추에서 다른 부드러운 조직 떨어져 잘라.
- 등 쪽 면이 위로 향하도록 척추 열을 배치 하 고, 3 시 위치와 잘라 뼈에서 척추 운하로가 위의 1 개의 끝을 슬라이딩 하 여 꼬리 끝에서 시작. 9 시 위치에서 절차를 반복 합니다.
참고:는 DRG의 손상을 방지 하려면 센터에 정확 하 게 잘라 중요 하다. - Rostral 끝에 도달 하 고 척수가 완전히 노출 될 때까지 사이드-투-사이드에서 절단을 반복 합니다. 해 부 현미경을 사용 하 여, 척추 신경, 척추 내 Drg를 찾는 데 사용 될 수 있는 노출 척수를 제거 합니다.
- 부드럽게 잡아 당 겼 지 루트 다음 클리핑 신경 및 결합 조직 아이리스가 위는 Drg를 제거 하는 척추 운하에는 DRG를에 의해 허리 Drg를 제거 합니다.
참고: 가능 하다 L4-L6 DRG 컬렉션을 제한 하는 좌 골 신경에 기여 하고있다. - 집게를 사용 하 여 약 1 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 1.5 mL 튜브에는 Drg를 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.
참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다.
3입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 소화
- 100 µ g/mL deoxyribonuclease, 그리고 얼음에 저장소의 보충 소화 미디어 (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL 콜라 유형 4)를 준비 합니다.
참고: 마우스 (좌 골 신경 + Drg) 당 필요한 소화 매체의 금액은 1 mL. 일단 준비, 소화 미디어의 aliquots-20 ° c.에 저장 될 수 있다 - 좌 골 신경 및 Drg 한 마우스에서 소화 미디어의 500 µ L을 포함 하는 별도 1.5 mL 튜브에 전송. 좌 골 신경에 대 한 소재 봄이 위를 사용 하 여 15 ~ 20 조각으로 절단 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 20 분 동안 37 ° C에서 떨고 인큐베이터에서 조직 정지를 품 어.
- 반복적으로 triturate 1000 µ L 피 펫 팁 어떤 불완전 소화 조직을 기계적으로 해리를 통해 세포 현 탁 액.
참고: 현 탁 액 적정 하기 어려운 경우 다음 잘라 피 펫 팁 만들 무뚝뚝한 끝을가 위로. 조직의 정지 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 20 분 동안 37 ° C에서 품 어. - 1000 µ L 피 펫 팁을 통해 분쇄를 반복 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 37 ° C에 추가 10 분 동안 품 어.
- FACS 버퍼 PBS (보충 10 %FCS 및 1 mM EDTA)를 준비 하 고 얼음에 저장. 린스 하 고 60 x 15 mm 페 트리 접시에 얼음에에서 FACS 버퍼 140 µ m의 메쉬 크기 스테인리스 스틸 화면을 담근 다.
참고: nucleated 세포의 수율에 중대 한 손실을 리드 나일론 스크린 필터를 피해 야 한다. - 반복적으로 통과 조직 정지 140 µ m 스크린 필터로 그것은 얼음에 무딘 집게와 페 트리 접시에 개최 됩니다. 페 트리 접시에서 세포 현 탁 액을 수집 하 고 얼음에 저장 된 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.
- 1000 µ L 피 펫 팁 반복된 분쇄 하 여 통해 필터에 남아 있는 어떤 불완전 소화 조직을 밀어. FACS 버퍼의 500 µ L로 두 번 스크린 필터를 헹 구 고 단계 3.6에서에서 세포 현 탁 액 결합을 페 트리 접시에 결과 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
참고: 사용 하는 교류 cytometer 파편에 민감한 경우에, 단계의 3.7 세포 현 탁 액 수 통과 70 µ m 스크린 필터; 그러나,이 nucleated 세포의 수확량에 손실이 발생할 수 있습니다. - 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 정지 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 한 번이 세 단계를 반복 합니다.
- 150-350 µ L의 FACS 버퍼, 얼룩의 수에 따라 필요한 (150 µ L FACS 버퍼 얼룩 패널 당)는에 셀 펠 릿을 resuspend.
4. Cytometry에 대 한 좌 골 신경 및 붙일 레이블된 항 체와 DRG의 얼룩
- 얼음에 V 96 잘 접시에 모양으로 좌 골 신경 또는 DRG 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송.
참고: 단일 스테인드 셀은 그들은 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 이득 및 보상, cytometry 구별에서 특정 도움말 설정 하기 위한 필요한 컨트롤을 제공 합니다 사용 하는 모든 항 체에 필요한 일반적인 바인딩입니다. 좌 골 신경 및 Drg에서 사용할 수 있는 제한 된 자료로 인해 혈액 백혈구 및 PCL (1.1-1.2 단계)에서 대 식 세포는 얼룩이 지는 단일 스테인드 컨트롤으로 사용할 수 있습니다 하는 좌 골의 얼룩과 병렬로 수행 해야에 대 한 신경 및 Drg 있습니다. - 수영장 나머지 정지 (약 50 µ L 샘플 당) 좌 골 신경 또는 흠 없는 컨트롤 역할을 DRG 샘플에서 세포.
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 위에 빈 접시를 반전 하는 손목의 날카로운 영화를 적용 하 여는 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 건조 종이 타월에 누릅니다.
- 표면 얼룩에 대 한 관심 (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5, MHC 클래스 II-Biotin)의 항 체를 포함 하는 FACS 버퍼의 20 µ L에서 각 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 얼음에 빛 으로부터 보호.
참고: (1) 최적 항 체 희석 결정된 전에 제조 업체의 제품 정보; 희석 시리즈를 수행 하 여 사용 해야 합니다. (2) 일반적인 stainings; 제조업체의 지침에 따라이 단계에서 Fc-블록 외피에 의해 감소 될 수 있다 그리고 (3) Isotype 제어 stainings는 일반적으로 필요 하지 않습니다는 fluorophore와 또는 관심의 antigen(s) 고유 인구 생산에 직접 활용 된 1 차 항 체를 사용 하는 경우. - 각 우물에 FACS 버퍼의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다.
참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하는 경우는 적절 한 보조 시 약, fluorophore에 활용 된이 시점에서 추가 될 수 있다 그리고 단계 4.4-4.5 반복 됩니다. 이 프로토콜의 경우 streptavidin-PE/Cy7 또는 Streptavidin PerCP MHC 종류 II 또는 CD68 APC와 함께 F4/80-PE/Cy7, CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5와 함께에서 각각 검출 하기 위하여 사용 되었다. - 마지막 세척 단계 후 고정을 위한 PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 10 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어와 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한을 삭제 하 고 FACS 버퍼의 150 µ L 한번 셀 펠 릿을 세척.
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 장갑과 안경, 등등을 착용 하십시오.
참고: FACS 버퍼와 최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 저장소의 150 µ L에서 셀 펠 릿을 Resuspend. 세포내 얼룩이 지 하는 것이 필요한 경우 다음 단계로 진행 4.11 centrifuging 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 플레이트 후 - 세포내 얼룩, FACS buffer+0.5% 세제, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 15 분 분리기 400 x g에서 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 빛에서 보호 하는 실 온에서 품 어 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한 삭제 하 고 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제로 한 번 셀 펠 릿을 세척. FACS buffer+0.5% 세제 (CD68-APC, CD206 PE)의 항 체를 포함 하는 20 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 실내 온도에 빛 으로부터 보호.
- 각 우물에 FACS buffer+0.5% 세제의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼 + 0.5% 세제의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다.
참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하 여 다음에 fluorophore를 활용 한 적절 한 보조 시 추가할 수 있습니다이 시점에서 그리고 단계 4.9-4.10 반복. - 최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 FACS 버퍼 + 0.5% 세제와 저장소, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- Resuspend 셀 알 약 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제 5 µ g/mL DAPI 보충 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 앞에서 설명한 상쾌한 (4.3 단계)를 삭제 합니다.
- PBS 및 레이블이 표시 된 FACs 튜브에 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 분석에 대 한 준비까지, 빛에서 보호 하는 실내 온도에 상점.
참고: PBS에 물의 resuspension, 후 셀 분석 되어야 합니다 시간, 이후는 DAPI 신호에서 손실에 지도 하는 DNA에서 해리 천천히 것입니다.
5. 설치 Cytometry 및 샘플의 실행의
- 교류 cytometer는 적절 한 레이저를 갖추고 또는 필터 fluorophores 셀 얼룩에 사용을 측정 하기 위해 설정 확인 하십시오. 이 시스템에 기본 cytometer 구성에서 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 셀 흐름 cytometer 3 레이저 장비를 사용 하 여 분석 했다 (405 nm, 488 nm와 633 nm) 5 fluorophores ≤의 검출에 대 한 허용.
- 관심의 fluorophores의 검출에 대 한 적절 한 채널을 선택 합니다. 모든 형광 신호 로그 증폭 검색 잘 됩니다.
- 샘플에 대 한 적절 한 유량을 선택 합니다. 이 매개 변수 사용 하는 시스템에 따라 다를 수 있습니다 그리고 실험적으로 결정 되어야 한다. 이 프로토콜의 경우 클럽 메 드-하-안녕 (35-60 µ L/min)의 흐름 속도 바늘의 막힘을 방지 하기 위해 사용 되었다.
- 샘플 당 수집 될 이벤트/셀의 총 수를 선택 합니다. 최소 이벤트 수 1000000 이어야 한다입니다.
- 점도의 SSC-대 전역 워크시트에서 만들 뿐 각 fluorophore FCS-. 대 관심의에 대 한 FSC-A 이벤트 및 선택한 fluorophores에 의미 한 형광 강도 (MFI)의 수를 표시 하는 통계 보기를 만듭니다.
- 작은 셀 맞는 점도의 더 낮은 왼쪽된 10%에는 FSC와 SSC-A 채널의 전압을 설정 합니다. 결정 배경 형광 및 좌 골 신경 또는 Drg. 결정 부모 (P1) 게이트는 분산형 기반에서 흠 없는 컨트롤에서 최소 샘플 형광 DAPI 전용에서 플롯 컨트롤 얼룩.
참고:이 아니다 컬렉션 게이트 인해 부분적으로, 인구의 DAPI + PNS에서 이기종 자연. - 관심의 fluorophores의 각 플롯 FSC 분산형을 사용 하 여, 그들의 각각 점도 낮은 분기 속하는 흠 없는 컨트롤의 셀 전압을 조정 합니다. 빌 게이츠 다음 각각 마커/fluorophores의 각각에 대 한 긍정적인 그 셀을 정의 하기 위해이 지역 위에 만들어집니다. 게이트의 위치는 단일 스테인드 컨트롤 (단계 4.1)의 실행에 의해 확인 된다.
참고: 중복 방출 스펙트럼에 대 한 보상이 시점에서 수행 하거나 적절 한 분석 소프트웨어를 사용 하 여 소급 적용 될 수 있습니다. - 교류 cytometer 설정 되었습니다, 설명 된 대로, 일단 샘플을 실행할 수 있습니다.
- 실행 후 나머지 샘플 자료를 삭제 될 수 있습니다 하 고 FCS 파일 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.
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Representative Results
전체 길이 좌 골 신경 및 모든 주요 DRG에서 셀 정지 했다 6 건강 한 C57BL/6 마우스에서 프로토콜에 따라 준비 하 고 얼룩에 대 한 3 개의 동등한 aliquots로 분할. DAPI, DNA, 얼룩과 얼룩 카운터 단일 셀 인구 (그림 1A-B, 상단 패널)의 검출에 대 한 수 있습니다. DAPI cytometry, 분석 이전에 밖으로 세척 단일 nucleated 이벤트 또는 singlets의 FSC 축에는 이산의 선택에 대 한 수 비 nucleated 파편의 형광 강도 정도로 감소. 아니 컬렉션 게이트는 PNS에서 singlets는 FSC의 큰 범위와 SSC (그림 1C)를 통해 배포 됩니다 적용 됩니다. 불완전 하 게 포함 된 FSC 축의 높은 끝에 자료 조직 소화, 내의 인구 (그림 1A-B)의 선택에서 제외 해야 합니다. 큰 파편 (하단 패널)의 배제에 촉진 수 밀도 플롯 (하단 패널)을 사용 하 여 결과를 표시 한다. ≥ 30000 singlets 총 2 개의 전체 좌 골 신경 및 ≥200에서 정기적으로 얻어질 수 있다, 000 singlets Drg (그림 1D)에서 얻을 수 있습니다. 좌 골 신경에서 singlets의 약 5 %CD45 그들의 표면에 약 5-10%는 Drg에 발견 된 그로 인하여 백혈구 조 혈 기원 (그림 2A)으로이 셀을 정의 하는 반면 표현.
대다수는 CD45+ singlets 또한 점진적 방식으로 (그림 2B) MHC 종류 II, 표현. Drg에서 CD11b를 사용할 수 있는 microglial 같은 셀을 검출 (CD45희미 한, CD11b 및 MHCII+ +) (그림 2B, 상단 패널). 그러나,이 microglia 인구는 결 석 좌 골 신경 (그림 2B, 하단 패널)에서. CD45 PNS에서 표현 하는 singlets의 대부분은 CD68+ 대 식 세포. 좌 골 신경에 DRG, 2-5%는 singlets의 표현 CD68 (그림 3A). 모든 셀 또한 CD68 표현 표현 CD45 (데이터 표시 되지 않음). Drg는 CD68에서+ 세포 했다 두 MHC의 그들의 표현에 더 많은 다른 유형의 클래스 II 및 CD206, M2 세포에 대 한 마커를 좌 골 신경 (그림 3B-D)에서 보다. 좌 골 신경에 대부분 세포 공동 표현된 MHC 종류 II 및 CD206 (그림 3B-D, 낮은 패널); 일반적으로, 약 60-80%는 CD68의+ 대 식 세포는 CD68의 작은 비율 동안 CD206, 표현+ 공동 Drg (그림 3B)에서 CD206을 표현. 흥미롭게도, m 1은 대 식 세포 마커 CD86 어떤 긍정적인 얼룩도 신경에서도 PCL (데이터 표시 되지 않음)에서 대 식 세포에 생성 하지 않았다. 대 식 세포 마커 F4/80, DRG와 좌 골 신경 (그림 3B-C), 이기종 식 보였다 얼룩은 CD68 비율- MHCII- 셀. 또한, f 4/80 식 CD68 식와 완전히 중복 하지 않았다.
그림 1: DAPI 스테인드의 흐름 cytometry 분석에서 대표적인 데이터 nucleated 세포에서 DRG와 좌 골 신경. 모든 이벤트가 수집, scatterplots (위 패널) 또는 밀도 (하단 패널), 하나의 대표 마우스의 DRG (A) 또는 (B) 좌 골 신경 (SN)에서 플롯으로 표시. 낮은 패널에 화살표 FCS 축 상단에 자료를 제외 하 고 성문을 나타냅니다. (C) 다시-게이팅 셀 DAPI-게이트 (singlets), SSC 대 FSC 점도에 패널 (A)에 표시 된 수집. SN를 모든 주요 DRG 6 건강 한 C57BL/6 쥐에서 singlets의 (D) 수입니다. 데이터 대표 평균 ± sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 흐름 CD45, MHC 종류 II의 표면 표현의 cytometry 분석 및 DRG와 좌 골 신경에서 singlets에 CD11b. DAPI-게이트 (singlets) 그림 1에서 선택한 이벤트 분석 되었다. CD45 좌 골 신경 (SN)에 표현 하는 singlets의 (A) 비율 및 6 컨트롤 마우스에서 DRG. (B) 대표적인 분산형 DRG (위 패널) 및 SN (하단 패널)에서 singlets의 플롯합니다. CD11b을 표현 하는 세포는 파란색으로 표시 됩니다. 데이터 대표 평균 ± sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: CD68, MHC 종류 II의 표면 표현의 cytometry 분석 흐름 및 DRG와 좌 골 신경에서 singlets에 CD206. DAPI-게이트 (singlets) 그림 1에서 선택한 이벤트 분석 되었다. 6 건강 한 C57BL/6 쥐에서 좌 골 신경 (SN)에 Drg CD68를 표현 하는 singlets의 (A) 비율. (B) 비율의 CD68+ 세포 공동 6 건강 한 C57BL/6 쥐에서 SN에 DRG CD206을 표현. DRG (위 패널) 및 SN (하단 패널) 보여주는 CD68와 MHC 클래스 II 식에서 singlets의 (C) 대표적인 분산형 구획. DRG (위 패널) 및 SN (하단 패널) 보여주는 CD68 및 CD206 식에서 singlets의 (D) 대표적인 분산형 구획. F4/80를 표현 하는 세포는 마젠타 색상으로 표시 됩니다. 데이터 대표 평균 ± sd. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
좌 골 신경 축 삭 주위 myelin의 콘텐츠로 인해 콜레스테롤 같은 지질의 큰 비율을 포함합니다. 온도와 지질의 속성 변경, 다른 온도에 다른 결과 얻을 수 있습니다. 셀 보존 되도록 소화 후이 프로토콜의 모든 단계는 얼음에 수행 했다. 일관성 결과의 재현성을 위해서 권장 하는 동안 그것은 3.6, 3.7 실 온에서 단계를 수행 하 여 수율을 높일 수 수 있습니다. 3.8 단계에서 신경 충분히 소화 하지 해야 하는 경우 메쉬에 신경의 작은 조각 볼 수 있을 것입니다. 부족 한 소화 시에 메쉬 소재 다시 소화 미디어 및 반복 단계 3.2-3.6 250 µ L을 포함 하는 새로운 1.5 mL 튜브에 전송 하 여 소화 될 수 있습니다. 경우 수율 이다 가난한 사람, 세포 현 탁 액의 샘플 trypan 블루와 가벼운 현미경 볼 수 메쉬 화면 (단계 3.6) 통과 후. 가능한, 비-블루, 셀 axons의 조각 막대 모양의 구조를 함께 표시 되어야 합니다. 실행 가능한 셀 경우 다음 소화 조건 및 재료의 잘못 된 전달 발생 했습니다 괴 사. 경우에 큰 집계를 볼 수 있습니다, 그것은 원심 분리에 의해 자료를 수집 하 여 소화 (3.2-3.6 단계)를 반복 좋습니다.
교류 cytometer 분석 murine 좌 골 신경 및 Drg의 방법은 전체 신경 관련 된 질문에 대 한 유용 하 고 여러 Drg. 최근 PNS 사용 하 여 분석에 대 한 관심 증가 되었습니다 교류 cytometry11,12 . 리 우 외. papain 및 좌 골 신경 및 특히 작은 신경의 1 cm 섹션 분석 21 G와 23 G를 사용 하 여, 특정 사이트에서 신경 자료의 분석에 대 한 수 있도록 Drg의 기계적 분리를 사용 하는 방법 개발 부상11. 여기에 제시 된 방법 것이 좋습니다 사용 때 PNS에 영향 체계, neurotoxicology 및 신경 병 또는 당뇨병 같은 만성 질환에서 유전자 모델 될 것으로 예상 된다. 좌 골 신경에서 얻은 nucleated 세포의 낮은 수율으로 인해 그것은 문이 ≤ 100 작은 인구는 개별 마우스에서 이벤트를 공부 하려고 하는 것 권장 하지 않습니다. 그러나, 여러 마우스에서 재료의 풀링 같은 작은 인구는 신경 내에서 연구를 촉진 것 이다. 그럼에도 불구 하 고, papain 및 21 G/23 G 바늘을 사용 하 여 효소 조직 분리 Liu 그 외 여러분 에 의해 설명 여부 조사에 대 한 관심의 것 11 이 연구에서 단일 셀의 수익률 향상에 설명 된 대로, 핵의 흐름 cytometry 얼룩과 결합 될 수 있었다. 아주 적은 양의 조직 분석 하는 능력은 사이 ipsi-contralateral Drg 일방적인 좌 골 신경 axotomy 다음과 같은 비교를 수행 하기 위한 중요 합니다. 그러나,이이 연구의 범위를 벗어납니다. 흥미롭게도, 대 식 세포의 식별 마커를 일반적으로 사용 되는 마우스의 PNS 예기치 않게 다른 유형의 식에 있는을 발견 했다. 예를 들어, CD11b 및 f 4/80 둘을 발견 했다 비 조 혈, 비 항 원 좌 골 신경에 Drg 세포의 큰 비율에 표현. 또한, 좌 골 신경, 모든 CD68에서+ 세포 표현 CD11b와 F4/80, 다른 장기의 연구에서 기대 했을 것 이다. 주의 PNS에서 대 식 세포의 연구에 대 한 이러한 마커를 사용 하 여 이루어집니다 그리고 CD163, 같은 다른 마커를 조사 해야 합니다 따라서 것이 좋습니다. 또한, 다른 마커 효소 분리를의 감도 차이 대 한 설명을 CD11b 또는 f 4/80과 같은 식에서 관찰이 어쩌면 설립 합니다.
이 프로토콜은 이전 후에 streptozotocin (STZ)13, 당뇨병 모델 쥐 유기 체에서의 유도 대 한 일반적으로 사용 되는 화학 물질과 독성 도전 PNS에 있는 면역 세포를 분석 하에 사용 되었습니다. 그것을 활성화 TRPV1와 TRPA1, STZ 처음 하면 면역 세포의 고갈 좌 골 신경에 Drg, 하지 신경에 염증이 발생 하는 동안 표시 했다. 복구 하는 Drg에 면역 세포와 면역 세포 특히 대 식 세포의 수가 크게 고갈 했다 비록 3 주 독성 도전 게시물. 그것은 이후 가설 신경 파편, 이온 채널 hyperexcitability 부상에서 결과의 해당 대 식 세포 식 균 작용 대 식 세포는 일반 세포 인구에서 그들의 고갈 결과의 apoptosis 이끌어 수 있습니다. 그것은 다른 주변 신경 독 신경 주민 대 식 세포에 미치는 영향을 알 수 없습니다. 대 식 세포의 고갈 같은 에이전트의 일반적인 결과이 치료에 대 한 의미 할 수 있습니다.
그것은 발견 했다 신경에서 nucleated 세포의 단지 5-10% 백혈구 조 혈 기원 했다. 나머지는 아마도 다른 신경 세포 유형의 혼합물, 즉 Schwann 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, pericytes. 때문에 용량 흐름 cytometry 시스템의 여러 매개 변수 및 제공 특정 마커 및 항 체를 사용할 수 있습니다 생각할 수 있는 것이 세포 유형 또한 분석 될 수 있었다이 메서드를 사용 하 여 측정을 합니다. 이 방법은 murine 자료에 대 한 설명 하고있다. 그러나, 일부 수정, 그것은 또한 사용 되었다 돼지와 인간의 PNS 자료의 분석에 대 한. 그것는이 방법은 도움이 될 것입니다 더 마우스 보다 더 큰 종에서 자료의 분석에 대 한 미래에 예상 됩니다.
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Disclosures
저자는이 연구에 관한 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이 연구는 도이치 가운데 (DFG;에 의해 지원 되었다 SFB1118)입니다. 저자는 해 부의 대부분을 수행 하 고 유익 하 게이 지식을 전송에 대 한 악 셀 Erhardt와 박사 Volker 엑스 타인과 교류 cytometer의 기술적인 측면에 도움을 위한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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