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Neuroscience

Synaptic जस्ता Histochemistry का उपयोग विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में विभिन्न क्षेत्रों और Laminae को प्रकट करने के लिए

Published: October 29, 2017 doi: 10.3791/56547
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, Chemistry and Environmental Sciences, American University of Sharjah, 2Department of Biology, The City College of New York

Summary

हम एक histochemical प्रक्रिया का वर्णन है कि विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में विशेषता लामिना और आरईएल जस्ता धुंधला पैटर्न पता चलता है । जस्ता-धुंधला पैटर्न अंय संरचनात्मक मार्करों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है मज़बूती से विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में परतों और क्षेत्रों भेद ।

Abstract

शारीरिक और कार्यात्मक मस्तिष्क संगठन और विकास के लक्षण वर्णन विशिष्ट तंत्रिका सर्किट और अपरिपक्व और वयस्क मस्तिष्क में क्षेत्रों की सही पहचान की आवश्यकता है । यहाँ हम एक जस्ता histochemical धुंधला प्रक्रिया है कि विभिन्न परतों और मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच पैटर्न धुंधला में मतभेद का पता चलता है का वर्णन. दूसरों को इस प्रक्रिया का उपयोग किया है न केवल जिंक युक्त न्यूरॉन्स और सर्किट मस्तिष्क में वितरण प्रकट करने के लिए, लेकिन यह भी सफलतापूर्वक कई प्रजातियों में विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में आरईएल और लामिना सीमाओं चित्रित करने के लिए. यहां हम विकासशील और वयस्क फेर्रेट दिमाग से छवियों के साथ इस धुंधला प्रक्रिया वर्णन । हम एक जस्ता धुंधला पैटर्न है कि क्षेत्रों और परतों के एक संरचनात्मक मार्कर के रूप में कार्य करता है पता चलता है, और मज़बूती से विकासशील और वयस्क दृश्य प्रांतस्था में दृश्य cortical क्षेत्रों में भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का मुख्य लक्ष्य एक histochemical तरीका है कि विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में परतों और क्षेत्रों की सही पहचान की अनुमति देता है जहां अंय तरीकों ऐसा करने में विफल वर्तमान है । Secondarily, densitometric छवि विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में, इस विधि एक synaptic जस्ता के वितरण का आकलन करने के लिए विकास के दौरान संभावित परिवर्तन प्रकट की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल विस्तार में वर्णन करता है रिएजेंट, उपकरण, और क्रमिक के लिए आवश्यक कदम जमे हुए मस्तिष्क वर्गों दाग । हालांकि इस प्रोटोकॉल फेर्रेट मस्तिष्क ऊतक का उपयोग कर वर्णित है, यह आसानी से कुतर, बिल्लियों, या बंदरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

ऊतकीय दाग परंपरागत रूप से architectonic सुविधाओं में अंतर प्रकट करके विभिन्न प्रजातियों में cortical क्षेत्रों की पहचान में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस तरह के Nissl पदार्थ के लिए के रूप में histochemical तकनीक का संयुक्त उपयोग, cytochrome oxidase (CO) जेट, या myelin के रूप में वे वयस्क मस्तिष्क में इसी तरह की आरईएल सीमाओं प्रकट फलदायक साबित कर सकते हैं । हालांकि, इन histochemical दाग हमेशा पर्याप्त रूप से cortical क्षेत्रों और अपरिपक्व मस्तिष्क में परतों के बीच स्पष्ट सीमाएं प्रकट नहीं करते हैं ।

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, जस्ता कई महत्वपूर्ण कार्य है कि डीएनए संरचना स्थिर शामिल है, एक एंजाइम cofactor के रूप में अभिनय, कई विनियामक कार्यों में भाग लेने, और synaptic बुलबुले में अपनी उपस्थिति के माध्यम से एक neuromodulator के रूप में अभिनय 1. Synaptic जस्ता अद्वितीय है क्योंकि यह ऊतकीय तरीकों का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है, जबकि प्रोटीन से बंधे जस्ता2visualized नहीं किया जा सकता है । यह सुविधा विभिन्न cortical क्षेत्रों में synaptic जिंक पैटर्न का खुलासा करने के लिए किया गया है, और synaptic जिंक histochemistry कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है । सेरेब्रल प्रांतस्था में glutamatergic न्यूरॉन्स का एक सबसेट उनके axon टर्मिनलों के भीतर presynaptic बुलबुले में जस्ता होते हैं3,4. Histochemical अध्ययन सेरेब्रल प्रांतस्था में synaptic जस्ता के एक विषम वितरण से पता चला है5,6,7. वहां विभिंन cortical क्षेत्रों में histochemically प्रतिक्रियाशील जस्ता के एक अलग आरईएल और लामिना वितरण होना प्रतीत होता है (जैसे, दृश्य बनाम somatosensory प्रांतस्था), या परतों (जैसे, supragranular में जस्ता स्तर और प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था के infragranular परतों अपेक्षाकृत कम synaptic जस्ता स्तर के साथ thalamocortical इनपुट परत चतुर्थ की तुलना में काफी अधिक हैं)5,8,9. प्रांतस्था में मनाया synaptic जस्ता धुंधला में विविधता विशेष रूप से लाभप्रद के रूप में यह आरईएल और लामिना पहचान की सुविधा है ।

यहां हम एक synaptic जस्ता histochemical प्रक्रिया है, जो Danscher के १९८२ विधि10का एक संशोधित संस्करण है का एक विस्तृत वर्णन प्रस्तुत करते हैं । इस विधि एक chelating एजेंट के रूप में पशुओं में selenite इंजेक्शन intraperitoneally (आईपी) का इस्तेमाल करता है । selenite मस्तिष्क के लिए यात्रा के लिए नि: शुल्क जस्ता के पूल के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए मस्तिष्क में glutamatergic synapses का एक सबसेट के बुलबुले में पाया । इस प्रतिक्रिया एक हाला कि चांदी के विकास2,10,11द्वारा बाद में बढ़ाया जा सकता है पैदावार ।

इस प्रक्रिया से पता चलता है लामिना और synaptic जस्ता धुंधला के आरईएल पैटर्न; densitometric विश्लेषण इन नमूनों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक वयस्क और अपरिपक्व मस्तिष्क में अन्य उपायों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, जैसे संवेदी, पर्यावरणीय, औषधीय, या आनुवंशिक जोड़तोड़. इसके अलावा, एक भी अंय मॉडल सिस्टम में अंय cortical या subcortical संरचनाओं में synaptic जस्ता के वितरण में संभावित विकास परिवर्तन का आकलन करना चाहते हो सकता है । मात्रात्मक जानकारी है कि densitometric विश्लेषण इस पद्धति में प्रदान करता है समय के साथ मस्तिष्क के विकास के बाद लाभप्रद हो सकता है । इस प्रोटोकॉल लामिना और आरईएल सीमाओं को प्रकट करने के लिए अन्य bliss-और histochemical मार्करों के लिए एक साथी प्रदान करता है.

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Protocol

< p class = "jove_content" > निम्नलिखित प्रोटोकॉल न्यू यॉर्क के सिटी कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा स्थापित पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है, जो सभी उपयुक्त राज्य और संघीय दिशानिर्देशों के अनुरूप है । संज्ञाहरण ferrets के लिए उपयुक्त है, और अध्ययन प्रजातियों के अनुसार संशोधित किया जाना चाहिए ।

< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig1.jpg"/>
चित्रा 1: फ़्लोचार्ट इस प्रोटोकॉल के 3 चरणों में शामिल प्रमुख कदम रूपरेखा और प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए आवश्यक समय । सभी अन्य चरणों सफेद पाठ हलकों में हैं, जबकि पूरी तरह से शुष्क करने के लिए वर्गों की आवश्यकता समय हरे पाठ हलकों में दिखाया जाता है. हरे हीरे के आकार का पाठ बॉक्स एक निर्णय बिंदु है, जबकि लाल आयत एक महत्वपूर्ण कदम है और अतिरिक्त देखभाल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 1. प्रारंभिक कदम (स्लाइड उपबिंग और समाधान बनाने)

  1. धो unsubbed स्लाइड गर्म पानी में एक डिटर्जेंट के साथ और कुल्ला गर्म पानी में कई बार एक आसुत पानी कुल्ला के साथ के बाद अच्छी तरह से किसी भी गंदगी या मलबे को हटा दें । स्लाइड की अनुमति दें कमरे के तापमान पर या एक ओवन में शुष्क करने के लिए ३७ & #176; C.
  2. एक बार स्लाइड पूरी तरह से शुष्क कर रहे हैं, एक उंगलियों या एक तूलिका का उपयोग कर प्रत्येक स्लाइड पर अंडा सफेद की एक पतली भी कोट परत । ६० पर ओवन में ड्राई करने की अनुमति दें & #176; C for 20-30 min. इष्टतम परिणामों के लिए और बंद फिसल वर्गों से बचने के लिए, अंडे की सफेद का एक दूसरा कोट जोड़ने और ६० & #176 पर ओवन में एक बार और शुष्क करने की अनुमति; C.
  3. १०० मिलीलीटर में जिलेटिन के 1 ग्राम को भंग करके एक 1% जिलेटिन समाधान तैयार करें & #160; गरम पानी के (६० & #176; C) और यह कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. अनुभाग 4. में उपयोग के लिए नीचे वर्णित के रूप में डेवलपर समाधान की २०० मिलीलीटर तैयार
    1. धीरे से वृद्धि में ४० जी जोड़कर गम अरबी समाधान तैयार गर्म पानी के १२० मिलीलीटर (यह और अधिक आसानी से इस तरह घुल) । एक गिलास सरगर्मी रॉड के साथ समाधान हलचल जारी रखें । एक बार समाधान पूरी तरह से भंग कर दिया है, यह गर्मी से हटा दें और यह कुछ मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, तो एक कीप में धुंध कपड़े की 6-8 परतों के माध्यम से फिल्टर.
    2. 20 मिलीलीटर डीएच 2 हे और मिश्रण भंग में ५.०४ ग्राम साइट्रिक एसिड प्लस ४.७ ग्राम सोडियम साइट्रेट जोड़कर साइट्रेट बफर तैयार करते हैं । सुनिश्चित करें कि इस समाधान का पीएच ४.० पर 25 & #176; C. अगर सोडियम हीड्राकसीड या हाइड्रोक्लोरिक एसिड को हल करने के लिए जोड़कर आवश्यक पीएच समायोजित ।
    3. 30 मिलि डीएच 2 O को ताप देकर हैड्रोक्विनोन समाधान तैयार करें और हैड्रोक्विनोन के १.७ g को भंग कर
      नोट: हैड्रोक्विनोन समाधान हीटिंग के लिए यह पानी में आसानी से भंग करने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है के रूप में हैड्रोक्विनोन पानी में कमरे के तापमान पर आसानी से dissolvable नहीं है । पानी का तापमान नीचे रखने के लिए सावधान रहें ६० & #176; सी, अंयथा हैड्रोक्विनोन ऑक्सीकरण हो सकता है । यदि समाधान पीला हो जाता है, तो त्यागें और एक और ताजा समाधान तैयार करें ।
    4. को भंग करके चांदी स्तनपान समाधान तैयार ०.२२ जी में 30 एमएल के डीएच 2 ओ.
    5. मिश्रण समाधान (1.4.1-1.4.4) क्रम में वे प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए तैयार है जब में वर्णित हैं ( यानी , के बाद अनुभाग, सुखाने, और फिक्सिंग) (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ ). अंत में रजत स्तनपान समाधान जोड़ें । सुनिश्चित करें कि इस कदम को जल्दी पूरा हो गया है और डेवलपर समाधान अंधेरे में रखा गया है जब तक यह समय है वर्गों प्रतिक्रिया के रूप में चांदी स्तनपान सहज है.
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "figure 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig2.jpg"/>
चित्रा 2: योजनाबद्ध रूप से शामिल चरणों के अनुक्रम illustrating प्रोटोकॉल के जस्ता histochemistry चरण में रिएजेंट मिश्रण. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 2. पशु उपचार और संज्ञाहरण

  1. पशु बेहोश करने से पहले, एक 1% सोडियम selenite तैयार (Na 2 एसईओ 3 ) भंग करके समाधान 10 मिलीग्राम सोडियम selenite में 1 मिलीलीटर डीएच 2 ओ.
  2. Anesthetize के एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के साथ पशु ketamine (25 मिलीग्राम/xylazine) और
    (2 मिलीग्राम/ नोट: संज्ञाहरण का एक उचित स्तर पेडल पलटा प्रतिक्रिया का उपयोग करके हासिल की है कि यह सुनिश्चित करें.
  3. इंजेक्षन जस्ता chelator सोडियम selenite समाधान (15 mg/intraperitoneally (IP).
    नोट: सोडियम selenite के विभिन्न युगों में या अन्य प्रजातियों में विषाक्तता भिन्न हो सकता है.
  4. सोडियम selenite के लिए ६० करने के लिए ९० मिनट की अनुमति के लिए मस्तिष्क की यात्रा । इस अवधि के दौरान, यह सुनिश्चित करें कि पशु ठीक से बेहोश है और निष्क्रिय है, तो संज्ञाहरण की गहराई हर 5 मिनट की जांच करने के लिए आवश्यक है
    5. selenite अवधि के दौरान
  5. , जबकि जानवर anesthetized है, सुनिश्चित करें कि आंखों सूखापन को रोकने के लिए बंद कर रहे हैं, या नेत्र मरहम प्रशासन उंहें नम रखने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. ऊतक तैयार करने और दाग

  1. Euthanize सोडियम pentobarbital (१०० मिलीग्राम/केजी, आई. पी.) की ओवरडोज का प्रबंध करके पशु.
  2. 1 मिनट के लिए सामांय खारा समाधान के साथ transcardial छिड़काव प्रदर्शन, और 4% paraformaldehyde के साथ 20 मिनट के लिए अंत में, 4% paraformaldehyde और 10% सुक्रोज (1 एच की कुल निर्धारण अवधि) के साथ एक समाधान प्रशासन ।
  3. बड़े कतरनों की एक जोड़ी का उपयोग कर सिर को हटा दें ।
  4. खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए गर्दन को नाक से एक स्केलपेल का उपयोग कर एक midline चीरा.
  5. ध्यान से मस्तिष्क को हटाने और एक ब्लेड के साथ गोलार्द्धों अलग ।
  6. कई घंटे के लिए ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर (पंजाब) में 4% paraformaldehyde में मस्तिष्क और पोस्टफिक्स के पीछे भाग ब्लॉक.
  7. ०.१ मीटर पंजाब में एक 30% सुक्रोज समाधान में ब्लॉक प्लेस और मस्तिष्क सिंक करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: 4% paraformaldehyde और 30% सुक्रोज समाधान की जगह 30% सुक्रोज समाधान के साथ ०.१ मीटर पंजाब में मस्तिष्क की सीमा सिंक करने के लिए मस्तिष्क & #39; एस paraformaldehyde के लिए जोखिम के रूप में यह ऊतक धुंधला गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं ।
  8. एक बार मस्तिष्क डूब, कट अर्द्ध-स्पर्श ४० & #181; मी मोटी वर्गों के माध्यम से दृश्य प्रांतस्था या ब्याज के क्षेत्र पर एक ठंड, फिसलने microtome या cryostat. यह औसत दर्जे की सतह के साथ ब्लॉक रखकर पूरा किया जा सकता है और धीरे से एक गिलास स्लाइड के साथ सपाट ।
  9. एक तूलिका के साथ वर्गों को इकट्ठा और एक से निपटने के बॉक्स में स्टोर फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) युक्त.
  10. अलग गिने श्रृंखला में वर्गों अलग । तुरंत अंडा सफेद subbed स्लाइड (खंड 1) पर मस्तिष्क वर्गों के एक या दो श्रृंखला माउंट, कमरे के तापमान पर रात भर शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं, और synaptic जस्ता के लिए प्रक्रिया वर्गों histochemically.
    नोट: अन्य श्रृंखला तुलना के लिए अन्य मार्करों के लिए संसाधित किया जा सकता है, जैसे myelin < सुप class = "xref" > 12 या cytochrome oxidase का उपयोग कर संशोधित प्रोटोकॉल < सुप वर्ग = "xref" > 13 : 2-8 के लिए मशीन ४० & #176; ग के साथ 3% सुक्रोज, ०.०१५% cytochrome ग, ०.०१५% catalase, और ०.१ एम पीबी में ०.०२% diaminobenzidine । Nissl पदार्थ भी दृश्य cortical क्षेत्रों भेद के लिए एक ऊतकीय मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इन अन्य ऊतकीय दाग की आवश्यकता नहीं है कि मस्तिष्क वर्गों अंडा-सफेद subbed स्लाइड पर मुहिम शुरू कर रहे हैं, तो पारंपरिक जिलेटिन लेपित स्लाइड के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 4. Synaptic जस्ता Histochemistry

  1. तय स्लाइड 15 मिनट के लिए निरपेक्ष शराब में वर्गों घुड़सवार और 1 ज.
    2. के लिए कमरे के तापमान पर पूरी तरह से शुष्क करने की अनुमति < li > संक्षेप में एक 1% जिलेटिन समाधान (खंड 1) में 10 एस के लिए वर्गों में विसर्जित और कमरे के तापमान पर रात भर सूखी अनुमति देते हैं ।
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए वर्गों रातोंरात शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं । अनुमति वर्गों रातोंरात पैदावार बेहतर ऊतक धुंधला सूख करने के लिए ।
  2. एक साथ समाधान मिश्रण के रूप में चरण १.८ में वर्णित के रूप में ही वर्गों के लिए तैयार है प्रतिक्रिया व्यक्त की है ।
    1. एक गिलास या प्लास्टिक ट्रे में ओर से स्लाइड की व्यवस्था करके वर्गों प्रतिक्रिया, और स्लाइड पर विकासशील समाधान डालने । जांचें कि समाधान में स्लाइड्स पूरी तरह से जलमग्न हैं और ट्रे को एक अंधेरी जगह में स्थानांतरित करें, या एक हल्के-टाइट बॉक्स से कवर करें ।
      नोट: एक प्लास्टिक ट्रे है कि लगभग 12 इंच लंबे 8 इंच चौड़ा द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है, जो ठीक 18 स्लाइड फिट बैठता है । २०० मिलीलीटर डेवलपर समाधान की कुल मात्रा स्लाइडों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त है, इसलिए यह सुनिश्चित करें कि सही मात्रा का उपयोग स्लाइड की संख्या के लिए किया जाता है और इसके अनुसार रेसिपी को समायोजित करें । एक प्लास्टिक या ग्लास ट्रे का उपयोग के रूप में एक धातु की ट्रे का उपयोग करने का विरोध के रूप में वहां चांदी डेवलपर समाधान में स्तनपान और लौह या अंय धातु ट्रे में पाया धातुओं के बीच परस्पर जेट के कुछ डिग्री है सलाह दी जाती है ।
  3. नेत्रहीन वर्गों हर 30 मिनट का निरीक्षण द्वारा प्रतिक्रिया के विकास की निगरानी । वर्गों के लिए आम तौर पर आवश्यकता १२०-पूर्ण विकास के लिए १८० मिनट ।
  4. यदि अनुभागों का दाग हो (< सशक्त वर्ग देखें = "xfig" > चित्र 3 ए ), 2% में अंतर करें किसान & #39; s solution (9 जु 2% सोडियम thiosulfate मे डीएच 2 हे और 1 भाग 2% पोटेशियम Ferricyanide मे डीएच 2 o) के लिए 1-2 min.
    नोट: नमूना धारा है कि खराब दाग है में दिखाया गया है < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र बी .
  5. एक बार वांछित तीव्रता हासिल की है, ट्रे से स्लाइड घुड़सवार वर्गों को हटाने और स्लाइड रैक पर स्लाइड रखकर प्रतिक्रिया समाप्त ।
  6. स्लाइड रैक को एक बड़े शीशे के दाग वाली डिश में रखें और स्लाइड को गर्म करके धो लें (४०-५० & #176; C) जिलेटिन कोट और बाहरी सिल्वर डिपॉजिट को निकालने के लिए 10 मिनट के लिए पानी चलाना ।
    नोट: बंद फिसल से वर्गों को रोकने के लिए स्लाइड रैक आंदोलन के लिए सावधान रहें. अनुभाग की वांछित तीव्रता जब पर्याप्त लामिना भिंनता स्पष्ट है और वर्गों को प्राप्त किया है काफी अंधेरा है लेकिन प्रतिक्रिया नहीं (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4a ).
  7. कमरे के तापमान पर शुष्क करने के लिए स्लाइड की अनुमति दें, और फिर १००% ेतोः (5 मिनट) में निर्जलीकरण, xylene में स्पष्ट (5 मिनट), और एक बढ़ते माध्यम के साथ पर्ची कवर । वैकल्पिक रूप से, शराब की एक आरोही श्रृंखला में स्लाइड जगह है, तो निर्जलीकरण, स्पष्ट, और coverslip ।
  8. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए पिछले selenite उपचार के बिना जानवरों से वर्गों का उपयोग करें । इन वर्गों के रजत प्रवर्धन कोई धुंधला उपज चाहिए ।
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "figure 3" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig3v2.jpg"/>
चित्रा 3: Synaptic जिंक सना में जुवेनाइल फेर्रेट ब्रेन. अर्द्ध-स्पर्श जस्ता-सना हुआ वर्गों है कि एक) दाग और ख) किशोर फेर्रेट मस्तिष्क में दाग के Photomicrographs । आरईएल सीमाओं लामिना भिंनता के रूप में विचार करना मुश्किल है कमी है । सफेद मैटर पर भी भारी दाग लगा है । Ssy Suprasylvian प्रांतस्था, एम डब्ल्यू सफेद बात है, एक पूर्वकाल, डी पृष्ठीय । स्केल बार = ५०० & #181; m (a-b). < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig3v2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 5. भेद आरईएल सीमाओं और छवि अधिग्रहण

  1. architectonic और आरईएल पहचान के लिए विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों के लामिना सुविधाओं का उपयोग करें ।
    नोट: उदाहरण के लिए, विकासशील चूहे में retrosplenial प्रांतस्था < सुप वर्ग = "xref" > 14 , लेखक एक क्षणिक मॉड्यूलर जस्ता, जो वयस्क में मौजूद नहीं है के लिए भारी दाग की विशेषता से पता चला है, लेकिन वर्णन करने के लिए उपयोग किया जा सकता cortical इस प्रजाति में विकास के दौरान संगठन । एक अन्य अध्ययन में < सुप वर्ग = "xref" > 15 , लेखकों को समूल बंदर प्रमस्तिष्कखंड में पाए जाने वाले विभिन्न नाभिक के synaptic जस्ता वितरण में विशिष्टता का पता चला, जो इन डिवीजनों की पहचान को सुगम बनाता है । डेवलपिंग और एडल्ट फेर्रेट ब्रेन में विजुअल cortical एरियाज को पहले से बताया गया है < सुप क्लास = "xref" > 16 , < सुप क्लास = "xref" > 17 , < सुप क्लास = "xref" > 18 , architectonic उपखंड neocortex ग्रे गिलहरी को बताया गया < सुप क्लास = "xref" > 19 . इसके अलावा, जिंक histochemistry पहले वयस्क बंदर दृश्य प्रांतस्था में क्षेत्रों के बीच भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था < सुप क्लास = "xref" > 8 , डेवलपिंग और एडल्ट कैट विजुअल प्रांतस्था < सुप क्लास = "xref" > 5 , डेवलपिंग रैट somatosensory प्रांतस्था < सुप वर्ग = "xref" > ९ , < सुप क्लास = "xref" > 20 , और एडल्ट माउस somatosensory प्रांतस्था < सुप क्लास = "xref" > 6 , < सुप क्लास = "xref" > 21 . यदि उपलब्ध हो, myelin सना हुआ, cytochrome oxidase (CO) सना हुआ, और synaptic जस्ता सना हुआ मस्तिष्क वर्गों में धुंधला पैटर्न की तुलना, वयस्क में आरईएल सीमाओं की पुष्टि करने के लिए । synaptic जस्ता के लिए दाग फेर्रेट दृश्य प्रांतस्था के अर्द्ध-स्पर्श वर्गों में, आरईएल पहचान की सुविधा है कि दृश्य cortical क्षेत्रों के बीच प्रमुख मतभेद हैं । उदाहरण के लिए, 17 क्षेत्रों और वयस्क फेर्रेट के 18 पता चलता है कि synaptic जस्ता धुंधला परतों में उच्च है I-III और V. layer VI कम तीव्रता से दाग, जबकि परत IV लगभग जस्ता का अभाव है । जिंक की कमी परत चतुर्थ या क्षेत्रों में धुंधला 17 और 18 काले दाग सह दाग वर्गों में चतुर्थ स्तर में पाया बैंड के साथ विरोधाभासों । हालांकि, स्तर के क्षेत्र के चतुर्थ में सह दाग वर्गों परतों iii और वी के साथ एक तेज सीमा रखता है, लेकिन 18 क्षेत्र में परत चतुर्थ धुंधला तीव्रता में एक सूक्ष्म कमी की विशेषता है और उसके ऊपरी परत iii में पाया सीमा कम विशिष्ठ है ।
  2. एक कम शक्ति उद्देश्य (2x या 4x इज़ाफ़ा) और ब्याज की तस्वीर क्षेत्रों के साथ brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर वर्गों की जांच करें ।
  3. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग photomicrographs के विपरीत और चमक बढ़ाने के लिए । ऑप्टिकल घनत्व माप के लिए प्राप्त छवियों को किसी भी तरह से बदल नहीं किया जाना चाहिए ।
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 4" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig4v3.jpg"/>
चित्रा 4: Synaptic जिंक धुंधला में वयस्क फेर्रेट मस्तिष्क भेद अलग दृश्य cortical क्षेत्रों. Photomicrographs ( a ) synaptic जस्ता या ( बी ) cytochrome oxidase (CO) के लिए सना हुआ निकटवर्ती अर्द्ध-स्पर्श वर्गों के वयस्क में । तीर आरईएल सीमाएं चिह्नित करें । Ssy Suprasylvian प्रांतस्था, एक पूर्वकाल, डी पृष्ठीय । स्केल बार = ५०० & #181; m. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig4v2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 6. Densitometry (ऐच्छिक)

< p class = "jove_content" > NOTE: Densitometric विश्लेषण हित के क्षेत्रों में प्रतिनिधि जस्ता दाग वर्गों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा मस्तिष्क में synaptic जस्ता के वितरण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह विधि भी विकास के दौरान synaptic जस्ता के स्तर में संभावित परिवर्तन पर नज़र रखने के लिए उपयोगी है ।

  1. चयनित जस्ता दाग वर्गों का उपयोग कर, बेतरतीब ढंग से cortical कॉलम (स्तंभ photomicrographs) उपयुक्त चौड़ाई का चयन (एक ४५० & #181; मीटर चौड़ा कॉलम इस्तेमाल किया जा सकता है) ब्याज के क्षेत्र के अधिग्रहीत photomicrographs से । एक cortical कॉलम pial सतह से सफेद पदार्थ के लिए सभी cortical परतों फैले एक क्षेत्र है ।
  2. हित के प्रत्येक क्षेत्र में कई अलग मस्तिष्क वर्गों से नमूना स्तंभों की एक उचित संख्या चुनें.
  3. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में प्रतिनिधि कॉलम के नमूना छवियों हस्तांतरण ।
  4. पूरे cortical स्तंभ शामिल करने के लिए आयताकार चयन उपकरण का उपयोग करें ।
  5. स्तंभ का एक फोटोग्राफिक नकारात्मक के समान विपरीत छवि बनाने के लिए पलटना उपकरण का उपयोग करें.
    नोट: इसके विपरीत छवियों के उलटा उच्च synaptic जस्ता स्तर और कम synaptic जस्ता स्तर के लिए कम ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों के लिए उच्च ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों उपज के लिए किया जाता है । यह प्लॉट प्रोफ़ाइल ग्राफ़ को रेंडर करने का अधिक सहज तरीका है < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 .
    6. में देखे गए लोगों के समान
  6. एक लाइन के साथ पिक्सेल तीव्रता के एक दो आयामी ग्राफ उत्पन्न करने के लिए भूखंड प्रोफ़ाइल उपकरण का उपयोग करके इन छवियों से ऑप्टिकल घनत्व प्रोफाइल का उत्पादन.
    7. प्लॉट प्रोफ़ाइल ग्राफ़ को एक अनुलंब प्रोफ़ाइल में कनवर्ट करने के लिए प्लॉट विकल्पों का उपयोग करें और एक बार अधिक
  7. प्रोफ़ाइल पर क्लिक करें ।
    नोट: x-अक्ष रेखा के साथ दूरी का प्रतिनिधित्व करता है और y-अक्ष पिक्सेल तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है । इसलिए, प्रत्येक प्लॉट प्रोफ़ाइल मान स्तंभ की चौड़ाई के बीच प्रत्येक गहराई पर औसत धूसर स्केल मान को प्रतिबिंबित करता है ।
  8. खोलें प्लॉट प्रोफ़ाइल मान स्प्रेडशीट में पाठ फ़ाइलों के रूप में, मानक, और ग्राफ़ के रूप में प्लॉट करें (< सशक्त वर्ग देखें = "xfig" > चित्र 5 ).
    नोट: यह परिणाम के रूप में मात्रात्मक माप की तुलना के लिए synaptic जस्ता के सापेक्ष घनत्व का उपयोग करने के लिए उचित है विभिन्न प्रतिक्रिया समय का एक परिणाम के रूप में समग्र धुंधला तीव्रता में भिन्नता द्वारा पाया जा सकता है, ऊतक के दाग, साथ ही अन्य चर.
  9. डेटा चिकनी करने के लिए पहले भूखंड प्रोफ़ाइल मूल्यों की एक मालगाड़ी औसत प्रदर्शन से सापेक्ष जस्ता घनत्व की गणना ।
    नोट: यह औसत द्वारा पूरा किया है, उदाहरण के लिए, हर क्रमिक 20 या 30 पिक्सेल (1 पिक्सेल = २.५ & #181; m) गहराई में, और उसके बाद प्रत्येक नमूने के लिए अधिकतम तीव्रता के लिए सामान्य. इसलिए, प्रत्येक औसत प्लॉट प्रोफ़ाइल मान उस गहराई (धूसर स्केल मान श्रेणी 0 से २५५) पर औसत धूसर स्केल मान प्रतिबिंबित करता है । एक अलग मानकीकरण विधि का उपयोग किया जा सकता है पहले प्राप्त सफेद पदार्थ (डब्ल्यू एम) नमूना क्षेत्रों है जो ब्याज के क्षेत्रों में अंतर्निहित सफेद बात शामिल है से ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों । आदर्श रूप में, कई क्षेत्रों है कि हल्के से एक मतलब डब्ल्यू एम मूल्य प्राप्त करने के लिए संभव के रूप में दाग रहे है चुनें । औसत ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों फिर से विभाजित कर रहे है मतलब डब्ल्यू एम एम मूल्यों को प्राप्त करने के सामान्यीकृत मूल्यों ।
  10. मात्रात्मक तुलना के लिए ब्याज के क्षेत्रों की विशिष्ट परतों में ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों का मतलब निर्धारित करते हैं ।
    नोट: उदाहरण के लिए, फेर्रेट के विज़ुअल cortical क्षेत्रों की लेयर IV में न्यूनतम ऑप्टिकल घनत्व मान को & #177; 5 पिक्सल से कम दाग वाले क्षेत्र को शामिल करके निर्धारित किया जाता है ।
  11. की गणना supragranular और फेर्रेट के दृश्य cortical क्षेत्रों की infragranular परतों में ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों का मतलब है & #177 द्वारा काले दाग क्षेत्र को शामिल करके; 5 पिक्सल मतलब अधिकतम मूल्य निर्धारित करने के लिए ।
  12. सुनिश्चित करें कि मतलब ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों विशेष परतों के भीतर से प्राप्त कर रहे हैं ।
    नोट: यह मूल photomicrographs के रूप में अच्छी तरह से आसंन सह अनुभाग के लिए तुलना करके इसके विपरीत उल्टे छवियों में इन परतों की सीमा को सत्यापित करने के लिए आवश्यक है । यह एक सन्निकट परतों पर अतिक्रमण नहीं करता कि की गारंटी देता है.
< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "figure 5" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig5.jpg"/>
चित्रा 5: लामिना जिंक का synaptic वितरण अलग दृश्य cortical में वयस्क फेर्रेट. में क्षेत्रों प्रतिनिधि photomicrographs एक वयस्क में इसी सामान्यीकृत ऑप्टिकल घनत्व प्रोफाइल के साथ सभी cortical परतों के माध्यम से स्तंभों की । वयस्क क्षेत्रों के चतुर्थ स्तर में कम synaptic जस्ता घनत्व 17 और 18 प्रोफ़ाइल भूखंड में गर्त से संकेत दिया है । प्रत्येक भूखंड प्रोफ़ाइल में, परत IV के गर्त में भरा अंडाकार औसत ंयूनतम पिक्सेल तीव्रता मूल्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया मूल्यों का संकेत है । स्केल बार = २०० & #181; m. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56547/56547fig5large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

synaptic जस्ता के लिए मस्तिष्क वर्गों दाग करने के लिए इस प्रोटोकॉल में शामिल प्रमुख कदम चित्रा 1में एक फ़्लोचार्ट में प्रस्तुत कर रहे हैं । प्रोटोकॉल तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1) छिड़काव और ऊतक संग्रह, 2) ऊतक तैयार करने और धुंधला, और 3) जस्ता histochemistry । संक्षेप में, प्रोटोकॉल के पहले चरण के दौरान, पशु anesthetized और सोडियम selenite की उचित खुराक के साथ आईपी इंजेक्शन है । एक पर्याप्त समय अवधि के बाद (आदर्श ६०-९० मिनट), पशु बाद में euthanized है, ०.९% NaCl समाधान एक 4% paraformaldehyde समाधान के बाद के साथ perfused । सिर decapitated है और खोपड़ी से मस्तिष्क जल्दी निकल जाता है । मस्तिष्क तो cryoprotectant के रूप में एक 4% paraformaldehyde प्लस 30% सुक्रोज समाधान में डूबने की अनुमति दी है । प्रोटोकॉल के दूसरे चरण में, जमे हुए वर्गों फॉस्फेट-खारा (पंजाब) में ४० µm पर एक रपट microtome पर काट रहे है और गिने श्रृंखला में अलग कर दिया । यह अनुभाग के बाद तुरंत अंडा-सफेद subbed स्लाइड पर वर्गों माउंट करने के लिए महत्वपूर्ण है, वर्गों को छोड़ इष्टतम परिणामों के लिए रातोंरात सूखी । जिलेटिन subbed स्लाइड की सिफारिश की क्रोमियम पोटेशियम सल्फेट के रूप में आम तौर पर उप बिंग समाधान में इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, चांदी स्तनपान के साथ प्रतिक्रिया करता है, इस प्रकार उपइष्टतम धुंधला करने के लिए अग्रणी । वर्गों तो निरपेक्ष शराब में 15 मिनट के लिए मशीन और कमरे के तापमान पर पूरी तरह से सूख छोड़ दिया जाता है । इस चरण में घुड़सवार वर्गों के एक संक्षिप्त डुबकी के बाद 1% जिलेटिन समाधान समय से आगे तैयार है, और इष्टतम परिणामों के लिए रातोंरात शुष्क करने की अनुमति दी । प्रोटोकॉल (जिंक histochemistry) के अंतिम चरण में, डेवलपर समाधान विधियां अनुभाग में दिए गए चरणों के अनुसार तैयार किया जाता है, और स्लाइड्स को समाधान में जलमग्न प्लास्टिक या ग्लास ट्रे में रखा जाता है । दाग का विकास आमतौर पर 2-3 एच के बीच कहीं भी लेता है, लेकिन बंद दृश्य निरीक्षण के वर्गों को धुंधला से बचने के लिए आवश्यक है । जब उचित तीव्रता हासिल की है, स्लाइड को हटा दिया जाना चाहिए, और 5-10 मिनट के लिए गर्म पानी में कुल्ला करने के लिए बाहरी चांदी जमा हटाने । वर्गों तो कमरे के तापमान पर सूख सकता है, मंजूरी दे दी और coverslipped । प्रोटोकॉल के जस्ता histochemistry चरण को पूरा करने के लिए आवश्यक विशिष्ट चरणों का एक योजनाबद्ध चित्रा 2में दिखाया गया है ।

इस प्रोटोकॉल cortical मस्तिष्क में दृश्य फेर्रेट क्षेत्रों के बीच स्तर धुंधला में आरईएल और लामिना भिन्नता प्रकट करने के लिए synaptic जस्ता histochemistry का उपयोग करता है. इस प्रोटोकॉल अंय प्रजातियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, somatosensory, श्रवण, या फेर्रेट या किसी अन्य मॉडल प्रणाली के ललाट प्रांतस्था जैसे अन्य संवेदी cortices का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं को इस histochemical दाग का उपयोग करने से बहुत लाभ होगा. इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह क्षेत्रों के बीच स्पष्ट संक्रमण प्रदान करता है वयस्कों में आरईएल पहचान की सुविधा के साथ ही मज़बूती से ऐसे कुतर, ferrets, बिल्लियों, और बंदरों के रूप में युवा पशुओं में cortical क्षेत्रों में अंतर ।

चित्रा 3 ए एक जस्ता सना हुआ खंड का एक उदाहरण है कि हम अनजाने में भी लंबे समय के लिए विकसित की है और इस तरह की प्रक्रिया में दाग से पता चलता है । सना हुआ ऊतक एक बहुत गहरे भूरे रंग, लामिना भिन्नता की कमी है, और भारी दाग सफेद बात की विशेषता है । हालांकि, जिंक-सना हुआ मस्तिष्क अनुभागों को कभी चित्र बीमें दिखाया जाता है । अगर जानवर समय की एक पर्याप्त राशि के लिए जीवित नहीं था (कम से ६० मिनट) है, जो मस्तिष्क के लिए यात्रा करने से सभी इंजेक्शन selenite precludes के लिए कई बार दाग वर्गों हो सकता है । ऊतक के दाग भी हो सकता है अगर selenite ठीक से प्रशासित नहीं किया गया था और इसलिए मस्तिष्क के लिए यात्रा नहीं की ।

एक वयस्क फेर्रेट में एकाधिक दृश्य cortical क्षेत्रों में धुंधला synaptic जस्ता के विषम वितरण एक प्रतिनिधि अर्द्ध में दिखाया गया है चित्रा 4aमें अनुभाग । तीर आरईएल सीमाओं को इंगित करते हैं. 17 और 18 क्षेत्रों में, synaptic जस्ता के धुंधला तीव्रता मैं परतों में आम तौर पर उच्च है, द्वितीय, III, और वी, और कम परत चतुर्थ में (thalamorecipient परत), और परत छठी में उदारवादी । 17 और 18 क्षेत्रों के बीच एक स्पष्ट रूप से पहचान योग्य संक्रमण की उपस्थिति चित्र 4aमें स्पष्ट है । 18 क्षेत्र में परत चतुर्थ धुंधला तीव्रता थोड़ा बढ़ जाती है और परत वी कम हो जाती है और चर तीव्रता का है । चित्रा 4b एक आसंन cytochrome oxidase (CO) कि हम जस्ता दाग के साथ मनाया उन के लिए आरईएल सीमाओं के समान स्थानों को दिखाता है के लिए दाग अनुभाग है । 17 क्षेत्रों और 18 कि जस्ता के उच्च स्तर है के क्षेत्रों में आम तौर पर सह धुंधला के निंन स्तर पर दिखाई देते हैं ।

19 और 21 क्षेत्रों में synaptic जिंक का वितरण गुणात्मक रूप से समान है कि दोनों क्षेत्रों में 17 और 18 क्षेत्रों की तुलना में कम लामिना भिन्नता है । क्षेत्रों के चतुर्थ स्तर 19 और 21 क्षेत्रों में स्पष्ट रूप से अलग है परत चतुर्थ 17 और 18 में है कि यह मामूली दाग है । 19 क्षेत्र के supragranular और infragranular परतों समान तीव्रता के हैं, लेकिन परत वी दाग थोड़ा गहरा । क्षेत्र 21 क्षेत्र 19 में है कि एक तुलनीय synaptic जस्ता वितरण किया है । हालांकि, क्षेत्र 21 के स्तर छठी क्षेत्र 19 की परत चतुर्थ से अधिक से अधिक synaptic जस्ता स्तर की विशेषता है । परतों VI और Suprasylvian के चतुर्थ (Ssy) के लिए मध्यम दाग दिखाई देते है और तुलनीय तीव्रता के हैं, जबकि परत वी अधिक से अधिक synaptic जस्ता के स्तर की विशेषता है और supragranular परतों synaptic जस्ता स्तर के एक अस्थिर पैटर्न द्वारा चिह्नित कर रहे हैं ।

विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptic जस्ता के वितरण का मात्रात्मक मूल्यांकन, विभिन्न उपचार के साथ, या विभिन्न उम्र में, पूरा किया जा सकता है, यदि ऐसा वांछित. उदाहरण के लिए, एक के लिए वयस्कों में synaptic जस्ता के वितरण में या प्राथमिक दृश्य, श्रवण, और somatosensory cortices में किसी भी मॉडल प्रणाली में विकास के दौरान परिवर्तन का आकलन करना चाहते हो सकता है । densitometric विश्लेषण का उपयोग करना, हम पहले से पता चला है कि कई दृश्य क्षेत्रों में synaptic जस्ता का वितरण (17, 18, 19, 21, और Suprasylvian) विकासशील फेर्रेट मस्तिष्क के, महत्वपूर्ण गिरावट के पांच से छह सप्ताह से17की उंर । यहां हम एक वयस्क फेर्रेट से लिया प्रतिनिधि नमूनों में synaptic जस्ता के वितरण में अंतर का आकलन करने की प्रक्रिया को समझाने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन । इन चरणों में जुवेनाइल फेर्रेट विजुअल प्रांतस्था में synaptic जिंक के वितरण में बदलाव के साथ-साथ किसी भी अन्य प्रजाति या ब्रेन क्षेत्रों में परिवर्तन ट्रैक करने के लिए फ़ॉलो किया जा सकता है. चित्रा 5 वयस्क मस्तिष्क वर्गों से प्रतिनिधि स्तंभ photomicrographs उनके पूरक सामान्यीकृत ऑप्टिकल घनत्व भूखंड प्रोफाइल के साथ जस्ता histochemistry के लिए संसाधित से पता चलता है. ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों के सामान्यीकृत भूखंड cortical गहराई के अनुसार परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने के लिए उत्पन्न किया गया. इसलिए, प्रत्येक प्लॉट प्रोफ़ाइल मान लगातार cortical गहराई पर औसत धूसर स्केल मान को प्रतिबिंबित करता है । उदाहरण के लिए, 17 क्षेत्रों और 18 जस्ता में एक नजर गिरावट की विशेषता है परत चतुर्थ में धुंधला (गर्त द्वारा प्रतिनिधित्व), जो उनके भूखंड प्रोफाइल से स्पष्ट है । 17 और 18 क्षेत्रों में न्यूनतम ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों मतलब भर काले अंडाकार द्वारा संकेत दिया जाता है । कम जस्ता दाग 17 क्षेत्रों के चतुर्थ स्तर में मनाया और 19, 21, और Ssy क्षेत्रों में जिंक के स्तर में केवल एक सूक्ष्म डुबकी के साथ 18 विरोधाभासों । सामूहिक रूप से, 19, 21 क्षेत्रों और Ssy क्षेत्रों 17 और 18 में है कि जस्ता के स्तर में सभी परतों से अधिक सजातीय है 17 और 18 क्षेत्रों की तुलना में गुणात्मक रूप से अलग हैं । इसके अलावा, supragranular परतों और क्षेत्र 17 और 18 के वी परत आम तौर पर अधिक तीव्रता से परत छठी से दाग ।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन Danscher (१९८२) विधि10, जिससे synaptic जस्ता स्थानीयकरण का पता लगाया जा सकता है और मस्तिष्क में visualized के एक संशोधित संस्करण के आधार पर एक histochemical तकनीक कार्यरत हैं । इस विधि को अनिवार्य रूप से जस्ता chelator सोडियम selenite (Na2एसईओ3) के साथ पशु इंजेक्शन द्वारा काम करता है (15 मिलीग्राम/ इंजेक्शन के बाद, selenite मस्तिष्क के लिए यात्रा और जस्ता कि जस्ता के presynaptic बुलबुले के लिए स्थानीयकृत है कि मुक्त करने के लिए बांधों न्यूरॉन्स युक्त. जिंक आयनों synaptic बुलबुले के भीतर अणुओं के लिए बाध्य वेग, और बाद में भौतिक विकास2,11के माध्यम से visualized किया जा सकता है । मूल है Timm सल्फाइड रजत धुंधला विधि का पता लगाने और Au, एजी, पीटी, Fe, सीडी, घन, नी, और जैविक ऊतक में Zn के रूप में भारी धातुओं के एक नंबर कल्पना करना था22। इस विधि के लिए इस्तेमाल किया chelating एजेंट सोडियम सल्फाइड है । इसलिए, Timm सल्फाइड विधि का उपयोग कर के साथ एक बड़ी समस्या किसी भी धातु है कि एक धातु सल्फाइड में तब्दील किया जा सकता है वास्तव में चांदी शारीरिक विकास से परिलक्षित हो सकता है के रूप में विशिष्टता की कमी है । हालांकि, वर्तमान अध्ययन में प्रयोग किया जाता है कि Danscher विधि के संशोधित संस्करण जस्ता और कोई अन्य भारी धातुओं के लिए विशिष्ट है । वहां है Danscher १९८२ विधि और वर्तमान विधि हम इस अध्ययन में वर्णन के बीच कई मतभेद हैं । Danscher की विधि ताजा स्थिर मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करता है, जबकि हम जमे हुए ऊतक का उपयोग करें । Danscher भी छिड़काव के लिए glutaraldehyde का उपयोग करता है, जबकि हम इस paraformaldehyde का उपयोग के रूप में immunohistochemical और अंय ऊतकीय मार्करों हम नियमित रूप से हमारे प्रयोगशाला में दाग के साथ और अधिक संगत है । Danscher भी poststaining प्रक्रियाओं का उपयोग करता है जैसे toluidine नीला (1%), जो हम अपनी विधि में निष्पादित नहीं करते हैं ।

वर्तमान तकनीक की एक सीमा के पशुओं द्वारा सोडियम selenite सहिष्णुता के साथ जुड़े अनिश्चितता है । हम पाते हैं कि सोडियम selenite के प्रशासन के बाद, कभी जानवरों 30 मिनट से अधिक समय तक जीवित नहीं है. इस स्थिति के रूप में यह मस्तिष्क के लिए यात्रा करने के लिए selenite के लिए पर्याप्त समय की अनुमति नहीं है एक समस्या बन गया है, और मस्तिष्क वर्गों के बाद विकास आम तौर पर असमान ऊतक धुंधला करने के लिए सुराग. एक अंय संभावित सीमा सोडियम selenite के intraperitoneal इंजेक्शन के उचित प्रशासन से संबंधित है । एक कम उदर गुहा के ऊपर त्वचा पर खींच और सुई बेवल की ओर एक 15-20 डिग्री के कोण पर, केवल पेट की दीवार मर्मज्ञ डालने चाहिए । सुई थोड़ा वापस खींच लिया जाना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि उदर अंगों और प्रवेश नहीं किया गया है सामग्री aspirated नहीं किया गया है । सुई का निपटारा किया जाना चाहिए और अगर यह होता है की जगह ।

उच्च गुणवत्ता धुंधला परिणाम और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, हम निंनलिखित सावधानी उपायों की सलाह देते हैं । पशुओं में सोडियम selenite के उचित प्रशासन, और पशु के अस्तित्व के समय अधिकतम (६० से ९० मिनट इष्टतम है) euthanizing से पहले, पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है selenite मस्तिष्क की यात्रा के लिए दिया जाता है । हमने पाया है कि कम उत्तरजीविता अवधि (30 मिनट या उससे कम) आम तौर पर असमान ऊतक धुंधला करने के लिए सीसा । इसी तरह, ब्लॉक अनुभाग के बाद तुरंत अंडा सफेद subbed स्लाइड पर बढ़ते वर्गों एक महत्वपूर्ण कदम है । दिन के एक नंबर के लिए नए सिरे से पंजाब में जमे हुए वर्गों को छोड़ जोरदार के खिलाफ की सलाह दी है के रूप में जस्ता आयनों समाधान में बाहर नमकीन पानी होगा । डेवलपर समाधान की तैयारी के दौरान, यह सुनिश्चित करने के लिए साइट्रेट बफर सही पीएच (४.०) के रूप में यह प्रतिक्रिया काफी पीएच में छोटे परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है महत्वपूर्ण है । इसी तरह, जब हैड्रोक्विनोन समाधान हीटिंग ६० डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान बनाए रखने के लिए आवश्यक है, के रूप में आगे हीटिंग समाधान ऑक्सीकरण और दाग को बाधित करेगा । इसी तरह, संक्षेप में स्लाइड-जिलेटिन में बढ़ वर्गों के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह खंड की सतह पर चांदी के गैर विशिष्ट जमाव को रोकता है । हालांकि, वर्गों जिलेटिन समाधान में नहीं छोड़ा जाना चाहिए अब से 10 एस के रूप में यह उंहें सूखना अप असमान ऊतक धुंधला करने के लिए अग्रणी होगा । जबकि डेवलपर समाधान में वर्गों के आवधिक दृश्य निरीक्षण के लिए भी लंबे समय से अधिक दाग के लिए नेतृत्व कर सकते है के लिए वर्गों छोड़ने के बाद से सलाह दी है । यह दाग काफी तापमान संवेदनशील है, इसलिए वर्गों को और अधिक जल्दी से विकसित जब परिवेश तापमान गर्म है और अधिक धीरे से जब तापमान कूलर है करते हैं । अंत में, एक धीरे गर्म पानी में कुल्ला कदम के दौरान स्लाइड रैक में स्लाइड्स हिलाना चाहते हो सकता है स्लाइड से जिलेटिन और अवशिष्ट चांदी जमा को हटाने की सुविधा । हालांकि, गर्म पानी के साथ स्लाइडों को धोने के दौरान अनुभागों की अत्यधिक और लापरवाही से आंदोलन की स्लाइड्स बंद हो जाती है और इससे बचना चाहिए । यह भी एक उचित नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है densitometric माप मात्रात्मक तुलना करने के लिए उपयोग किया जाता है । संभवतः एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में एक हल्के से सना हुआ या गैर-धुंधला क्षेत्र का उपयोग कर सकते हैं । हमारी सामग्री में, हम एक नियंत्रण के रूप में सफेद पदार्थ का उपयोग करने के लिए विभिंन दृश्य cortical क्षेत्रों में विकास के दौरान ऑप्टिकल घनत्व मूल्यों को सामान्य । हम पाते है कि सफेद बात मूल्यों अलग उंर भर में और वयस्क17में तुलनीय हैं । इसलिए, यह देखते हुए कि सफेद बात मूल्यों उंर के एक समारोह के रूप में बदल नहीं है, सफेद बात densitometric विश्लेषण के लिए एक वैध नियंत्रण के रूप में कार्य करता है ।

इस विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह एक सरल और विश्वसनीय histochemical दाग जिसका वितरण किया जा सकता है, अन्य histochemical मार्करों की तरह, मस्तिष्क क्षेत्रों में भेद करने के लिए. हालांकि, इस histochemical विधि का उपयोग कुछ कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है (उन जिंक की कमी), या synaptic जस्ता स्तर के रूप में बहुत युवा जानवरों में शुरू में कम कर रहे हैं के रूप में माउस somatosensory और बिल्ली दृश्य प्रांतस्था के विकास में दिखाया के रूप में जन्म के5 ,20. इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ यह है कि यह neuroanatomical अनुरेखक इंजेक्शन प्रयोगों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम आम तौर पर दृश्य प्रांतस्था में एकाधिक क्षेत्रों के बीच कनेक्टिविटी पैटर्न में विकासात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किशोर ferrets के प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में एक द्वि-दिशा न्यूरॉन अनुरेखक सुई. इसलिए, पशुओं को जिंक histochemistry के लिए पूरी तरह इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है यदि पशुओं का एक अलग प्रायोगिक अध्ययन के लिए दोहन किया जा सके । वर्णित विधि का प्रमुख लाभ यह है कि यह अन्य प्रजातियों में और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि हम इस फेर्रेट मस्तिष्क ऊतक का उपयोग कर विधि का प्रदर्शन किया है, वहां कुछ कदम जब कुतर, बिल्लियों, या बंदरों से मस्तिष्क के ऊतकों का अध्ययन में सूक्ष्म मतभेद हो सकता है । दूसरों को सफलतापूर्वक इस जस्ता histochemical विधि का इस्तेमाल किया है वयस्क बंदर दृश्य प्रांतस्था8में धुंधला पैटर्न में अंतर वर्णन, विकासशील और वयस्क बिल्ली दृश्य प्रांतस्था5, विकासशील चूहे somatosensory प्रांतस्था9 , 20, एडल्ट माउस somatosensory प्रांतस्था6,21, और वयस्क परमा wallaby दृश्य प्रांतस्था7.

यहाँ हम प्रोटोकॉल के बुनियादी कदम रूपरेखा और लगातार उच्च गुणवत्ता जस्ता धुंधला प्राप्त करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण मापदंडों को रेखांकित. एक अंय संवेदी या मोटर cortices या अंय मॉडल पशुओं में subcortical संरचनाओं में synaptic जस्ता के स्तर में परिवर्तन का आकलन करना चाहते हो सकता है । मात्रात्मक जानकारी जो densitometricnalysis इस विधि में प्रदान करता है समय पर cortical विकास निंनलिखित के लिए लाभप्रद हो सकता है और संभवतः विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptic जस्ता स्तर के विभिंन विकासात्मक प्रोफाइल खुलासा (जैसा कि हम पहले17दिखाया है) । एक महत्वपूर्ण विचार विकासात्मक प्रश्न और पशुओं की इसी उंर का अध्ययन करने के लिए है । Synaptic जस्ता histochemistry स्पष्ट रूप से ferrets में पहचाने जाने योग्य दृश्य cortical क्षेत्रों से पता चलता है और cortical संगठन और समारोह के आगे के अध्ययन में एक उपयोगी गाइड के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम अनुसंधान संसाधनों के लिए राष्ट्रीय केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (2G12RR03060-26A1); राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं (8G12MD007603-27) पर पेशेवर कर्मचारी कांग्रेस-सिटी ंयूयॉर्क विश्वविद्यालय (पीएससी-CUNY); और संकाय अनुसंधान अनुदान (FRG II) अमेरिकी शारजाह विश्वविद्यालय । हम इन विधियों को हमें शुरू करने के लिए विद्यासागर Sriramoju को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

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References

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तंत्रिका अंक १२८ Neuroanatomy सेरेब्रल प्रांतस्था striate प्रांतस्था संरचनात्मक मार्कर धुंधला विधि लामिना रूपांतर
Synaptic जस्ता Histochemistry का उपयोग विकासशील और वयस्क मस्तिष्क में विभिन्न क्षेत्रों और Laminae को प्रकट करने के लिए
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Khalil, R., Levitt, J. B. Use of… More

Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

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