Summary
Vi beskriver ett histochemical förfarande som avslöjar karakteristiska laminär och areala zink färgning mönster i olika hjärnregioner. Zink-färgning mönstret kan användas tillsammans med andra anatomiska markörer att tillförlitligt skilja skikt och regioner i utvecklingsländerna och vuxna hjärnan.
Abstract
Karakterisering av anatomiska och funktionella hjärnan organisation och utveckling kräver korrekt identifiering av distinkta neurala kretsar och regioner i hjärnans omogna och vuxen. Här beskriver vi ett zink histochemical färgningsproceduren som avslöjar skillnader i färgning mönster bland olika skikt och regioner i hjärnan. Andra har utnyttjat detta förfarande inte bara avslöja fördelningen av zink-innehållande nervceller och kretsar i hjärnan, men också att framgångsrikt avgränsa areala och laminär gränser i utvecklingsländer och vuxna hjärnan i flera arter. Här vi illustrera detta färgning förfarande med bilder från utvecklingsländer och vuxen iller hjärnor. Vi avslöja ett zink-färgning mönster som fungerar som en anatomisk markör områden och lager, och kan användas på ett tillförlitligt sätt att skilja visuella kortikala områden i utvecklingsländer och vuxen syncentrum. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att presentera en histochemical metod som möjliggör korrekt identifiering av skikt och regioner i utvecklingsländerna och vuxna hjärnan där andra metoder misslyckas att göra detta. I andra hand i samband med Densitometrisk bildanalys gör denna metod att man kan bedöma fördelningen av synaptic zink att avslöja potentiella förändringar i hela utvecklingen. Det här protokollet beskriver i detalj reagenser, verktyg och steg som krävs för att successivt färga frysta hjärnan sektioner. Även om detta protokoll beskrivs med iller hjärnvävnad, kan det enkelt anpassas för användning i gnagare, katt eller apor såväl som i andra regioner i hjärnan.
Introduction
Histologiska fläckar har traditionellt använts till stöd i identifiering av kortikala områden i olika arter genom att avslöja skillnader i arkitektoniska funktioner. Den kombinerade användningen av histochemical metoder såsom för Nissl ämne, cytokrom oxidasnegativ (CO) reaktivitet eller myelin kan visa sig fruktbart som de avslöjar liknande areala gränser i den vuxna hjärnan. Dessa histochemical fläckar avslöjar dock inte alltid tillräckligt tydliga gränser mellan kortikala områden och lager i den omogna hjärnan.
I det centrala nervsystemet har zink flera kritiska funktioner som inkluderar stabilisera DNA-struktur, fungerar som en enzym kofaktor, deltar i många tillsynsuppgifter och agerar som en neuromodulator genom sin närvaro i synaptiska vesikler 1. synaptic zink är unikt eftersom det kan visualiseras med histologiska metoder, protein-bound zinc kan inte visualiseras2. Denna funktion har utnyttjats för att avslöja den synaptiska zink mönstret i olika kortikala regioner och synaptic zink histokemi har använts i ett antal studier. En delmängd av glutamatergic nervceller i hjärnbarken innehåller zink i de presynaptiska blåsor inom deras axon Terminal3,4. Histochemical studier har visat en heterogen fördelning av synaptic zink i hjärnbarken5,6,7. Det verkar finnas en annan areal och laminär fördelning av histochemically reaktiv zink i olika kortikala regioner (t.ex., visuell kontra somatosensoriska cortex) eller lager (t.ex.zink nivåer i supragranular och infragranular lager av primära syncentrum är betydligt högre än i thalamocortical inmatningslagret IV med relativt låg synaptic zink nivåer)5,8,9. Heterogenitet i synaptic zink färgning observerades i cortex är särskilt fördelaktigt eftersom det underlättar areala och laminär identifiering.
Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av synaptic zink histochemical förfarande, som är en modifierad version av Danscher's 1982 metod10. Denna metod använder selenit injiceras intraperitonealt (IP) till djur som en kelatbildare. Selenit reser till hjärnan att reagera med pool av gratis zink Funna i blåsor av en delmängd av glutamatergic synapser i hjärnan. Denna reaktion ger en fällning som därefter kan förbättras genom silver utveckling2,10,11.
Detta förfarande avslöjar laminär och areala mönster av synaptic zink färgning; Densitometrisk analys kan användas för att bedöma dessa mönster både kvalitativt och kvantitativt i vuxen och omogna hjärnan för att studera effekter av andra insatser, såsom sensorisk, miljö, farmakologiska eller genetiska manipulationer. Dessutom kanske man också vill bedöma potentiella utvecklingsmässiga förändringar i fördelningen av synaptic zink i andra kortikala och subkortikala strukturer i andra modellsystem. Den kvantitativa information som Densitometrisk analys ger i denna metod kan vara fördelaktigt för följande hjärnans utveckling över tiden. Detta protokoll ger en följeslagare till andra immuno- och histochemical markörer för att avslöja laminär och areala gränser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
följande protokoll följer djurvård riktlinjer fastställda av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på The City College of New York, som överensstämmer med alla lämpliga statliga och federala riktlinjer. Anestesi är lämpligt för illrar, och bör modifieras enligt arter studerade.
figur 1: flödesschema beskriver de stora stegen i 3 faser i detta protokoll och den tid som krävs för att slutföra varje steg. Perioder som kräver sektioner torka helt visas i grön text cirklar, medan alla andra steg i vit text cirklar. Den gröna diamant-formade textrutan är en beslutspunkt, medan den röda rektangeln är ett kritiskt steg och ska utföras med extra omsorg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1. förberedande steg (Skjut Subbing och lösning att göra)
- tvätta unsubbed diabilder med diskmedel i varmt vatten och skölj flera gånger i varmt vatten följt med destillerat vatten skölj noggrant bort smuts eller skräp. Tillåta diabilder att torka i rumstemperatur eller i en ugn vid 37 ° C.
- När bilderna är helt torr, lager ett tunt jämnt skikt av äggvita på varje bild med hjälp av fingrar eller en pensel. Låt torka i ugnen på 60 ° C i 20-30 min. För optimalt resultat och för att undvika sektioner som glider av, lägga till ett andra skikt av äggvita och låt torka en gång till i ugnen på 60 ° C.
- Bered en 1% gelatin genom upplösning 1 gram gelatin i 100 mL varmt vatten (60 ° C) och låt det svalna till rumstemperatur.
- Bereda 200 mL utvecklare lösning som beskrivs nedan för användning i avsnitt 4.
- Förbered gummi arabicum lösning genom att långsamt lägga 40 g i steg till 120 mL varmt vatten (det löser sig lättare detta sätt). Fortsätt att röra lösningen med ett glas omrörning rod. När lösningen är helt upplöst, ta bort den från värmen och låt det svalna i några minuter, sedan filtrera genom 6-8 lager av gasväv tyg i en lufttunnel.
- Förbered citrat buffert genom att lägga 5.04 g citronsyra plus 4,7 g natriumcitrat i 20 mL dH 2 O och upplösa blandningen. Se till att denna lösningens pH är 4,0 vid 25 ° C. Justera pH vid behov genom att lägga till natriumhydroxid eller saltsyra lösningen.
- Förbereda hydrokinon lösningen genom värme 30 mL dH 2 O och upplösa 1,7 g av hydrokinon.
Obs: Uppvärmning hydrokinon lösningen är viktigt för att kunna lösa enkelt i vatten som hydrokinon inte är lätt dissolvable i vatten vid rumstemperatur. Var noga med att hålla temperaturen på vattnet under 60 ° C, annars hydrokinon kan oxideras. Om lösningen gulfärgas, kasta och förbereda en annan färsk lösning. - Förbereda silver laktat lösning genom att lösa 0.22 g i 30 mL dH 2 O.
- Blanda lösningarna (1.4.1 - 1.4.4) i den ordning som de beskrivs när du är redo att utföra reaktionerna (dvs. efter snittning, torkning och fastställande) ( figur 2). Lägg den silver laktat i slutet. Se till att detta steg är slutfört snabbt och utvecklare lösningen placeras i mörkret tills det är dags att reagera avsnitten som silver laktat är ljuskänsliga.
figur 2: Schematisk bild som illustrerar olika stegen i Blanda reagenserna i zink histokemi fas protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. djuret behandling och anestesi
- innan sederande djuret, förbereda en 1% natrium selenit (Na 2 SeO 3) lösning genom att lösa upp 10 mg natrium selenit i 1 mL dH 2 O.
- Söva djuret med en intramuskulär injektion av ketamin (25 mg/kg) och xylazin (2 mg/kg).
Obs: Se till att en lämplig nivå av anestesi uppnås med hjälp av en pedal reflex svar. - Injicera zink kelator natrium selenit lösning (15 mg/kg) intraperitonealt (IP).
Obs: Toxiciteten av natrium selenit vid olika åldrar eller i andra arter kunde variera. - Tillåt 60 till 90 min för natrium selenit att resa till hjärnan. Under denna period, det är absolut nödvändigt att se till att djuret är ordentligt drogad och inte svarar, så kolla djupet av anestesi varje 5 min.
- Under perioden selenit, medan djuret är sövda, säkerställa att ögonen är stängda för att förhindra torrhet eller administrera oftalmologiska salva för att hålla dem fuktiga.
3. Vävnad förberedelse och färgningen
- avliva djuret genom att administrera en överdos av natrium pentobarbital (100 mg/kg, IP).
- Utför transcardial perfusion med normal saltlösning för 1 min och 4% PARAFORMALDEHYD för 20 min. Slutligen administrera en lösning med 4% PARAFORMALDEHYD och 10% sackaros (en total räntebindningstid på under 1 h).
- Tar bort huvudet med ett par stora saxar.
- Gör en mittlinjen snitt med en skalpell från näsan till halsen för att exponera skallen.
- Försiktigt bort hjärnan och separat halvkloten med ett blad.
- Blockera den bakre delen av hjärnan och postfix i 4% PARAFORMALDEHYD i 0,1 M fosfatbuffert (PB) i flera timmar.
- Placera blocken i en 30% sackaroslösning i 0,1 M PB och tillåter hjärnan att sjunka.
Obs: Ersätta den 4% PARAFORMALDEHYD och 30% sackaroslösning med 30% sackaroslösning i 0,1 M PB sjunka hjärnan begränsar hjärnan ' s exponering för PARAFORMALDEHYD eftersom detta kan påverka vävnad färgning kvalitet. - En gång hjärnan sjunker, skär semi tangentiella 40 µm tjocka sektioner genom syncentrum eller regionen av intresse på en frysning, skjutbara mikrotomen eller kryostaten. Detta kan åstadkommas genom att placera blocket med mediala ytan ned och försiktigt slätande med en glasskiva.
- Samla sektioner med en pensel och lagra i en talja-box som innehåller fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Separata avsnitten i separata numrerade serier. Omedelbart montera en eller två serier av hjärnan delar på äggvita subbed diabilder (avsnitt 1), låt torka över natten i rumstemperatur och bearbeta avsnitt histochemically för synaptic zink.
Obs: Andra serien kan komma att behandlas för andra markörer för jämförelse, exempelvis myelin 12 eller cytokrom oxidas använder den modifierade protokoll 13: Inkubera i 2-8 h vid 40 ° C med 3% sackaros, 0,015% cytokrom C, 0,015% katalas och 0,02% Diaminobenzidin i 0.1 M PB. Nissl ämne kan också användas som en histologisk markör för att skilja visuella kortikala områden. Dessa andra histologiska fläckar inte kräver att hjärnan sektioner är monterade på äggvita subbed diabilder, så de traditionella gelatin överdragna bilderna kan istället användas.
4. Synaptic zink histokemi
- fixa bilden monterad sektioner i absolut alkohol för 15 min och låt torka helt i rumstemperatur i 1 h. < lJag > kort fördjupa sektioner för 10 s i en 1% gelatin lösning (avsnitt 1) och låt torka över natten i rumstemperatur.
- Blanda lösningarna som beskrivs i steg 1,8 så snart sektioner är redo att reageras.
- Reagera avsnitten genom att ordna bilderna sida vid sida i en glas eller plast fack, och hälla utveckla lösningen på bilderna. Kontrollera att bilderna är helt nedsänkt i lösningen och överföra facket i ett mörkt utrymme, eller täcka med en ljus-tight box.
Obs: En plastbricka som är cirka 12 inches lång och 8 inches bred kan användas, som passar exakt 18 rutschbanor. En total volym på 200 mL utvecklare lösning är tillräcklig för att helt dränka bilderna, så se till att den korrekta volymen används för antalet bilder att reageras och justera receptet. Användningen av en plast eller glas bricka i stället för med hjälp av en metall bricka är lämpligt eftersom det finns en viss gränsöverskridande reaktivitet mellan den silver laktat i utvecklare lösning och järn eller andra metaller i metall brickor.
- Reagera avsnitten genom att ordna bilderna sida vid sida i en glas eller plast fack, och hälla utveckla lösningen på bilderna. Kontrollera att bilderna är helt nedsänkt i lösningen och överföra facket i ett mörkt utrymme, eller täcka med en ljus-tight box.
- Övervaka utvecklingen av reaktionen genom att visuellt inspektera avsnitten varje 30 min. Avsnitten kräver i allmänhet 120-180 min för fullständig utveckling.
- Om avsnitt blivit overstained (se figur 3a), skilja i 2% Bonde ' s lösning (9 delar 2% natriumtiosulfat i dH 2 O och 1 del 2% kalium Kaliumferricyanid i dH 2 O) för 1-2 min.
Obs: Exempelavsnitt som är dåligt målat visas i figur 3b. - När önskad intensitet uppnås, avsluta reaktionen genom att ta bort bilden monterad sektioner från magasinet och placera bilder på en objektglashållaren.
- Placera objektglashållaren i ett stort glas färgning maträtt och tvätta objektglasen i varmt (40-50 ° C) rinnande vatten i ca 10 min att ta bort gelatin pälsen och den yttre silverfyndighet.
Obs: Var noga med att inte skaka den objektglashållaren för att förhindra sektioner glider av. I avsnittet önskad intensitet uppnås när tillräcklig laminar variationen är uppenbart och sektioner är mörka nog men inte överreagerade (se figur 4a). - Låta bilderna ska torka i rumstemperatur och sedan torka i 100% EtOH (5 min), klart i xylen (5 min) och täckglas med en monteringsmedium. Alternativt placera glasen i en stigande serie av alkohol och sedan torka, tydlig och täckglas.
- Användning sektioner från djur utan föregående selenit behandling att fungera som en negativ kontroll. Silver förstärkning av dessa avsnitt bör ge ingen färgning.
Obs: För bästa resultat låt sektioner att torka över natten. Att låta sektioner att torka över natten ger bättre vävnad färgning.
figur 3: Synaptic zink färgning i hjärnans juvenil iller. Mikrofotografier av semi tangentiella zink-färgade sektioner som a) overstained och (b) understained i juvenil iller hjärnan. Areala gränserna är svåra att urskilja som laminar variation saknas. Vit substans är också starkt färgade. SSY Suprasylvian cortex, WM vit roll, en främre, D dorsala. Skalstapeln = 500 µm (a-b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. skilja areala gränser och bild förvärvandet
- användning arkitektoniska funktioner i olika hjärnregioner areala och laminär identifiering.
Obs: till exempel utveckla råtta retrosplenial cortex 14, författarna visade en övergående modularitet kännetecknas av tung färgning för zink, som inte är närvarande i vuxen men skulle kunna utnyttjas för att beskriva kortikala organisationen under utveckling hos denna art. I en annan studie 15 avslöjade författarna specificitet i synaptic zink fördelningen av olika kärnor i makak apa amygdala, som underlättar identifiering av dessa divisioner. Visuella kortikala områden i utvecklingsländer och vuxen iller hjärnan har varit tidigare beskrivna 16 , 17 , 18, arkitektoniska delfältet i hjärnbarken i den grå ekorren var beskrivna 19. Dessutom användes zink histokemi tidigare för att skilja mellan områden i vuxen apa syncentrum 8, utveckla och vuxen katt syncentrum 5, utveckla råtta somatosensoriska cortex 9 , 20, och vuxen mus somatosensoriska cortex 6 , 21. Om tillgängligt, jämföra färgning mönstret i myelin målat, cytokrom oxidasnegativ (CO) färgas och synaptic zink färgade delar upp hjärnan, för att bekräfta areala gränser i vuxen. I semi tangentiella sektioner av iller visuella cortex färgas för synaptic zink, finns det framträdande skillnader bland visuella kortikala områden som underlättar areala identifiering. Till exempel avslöja områden 17 och 18 i vuxen vesslan att synaptic zink färgning är hög i lager I-III och V. lager VI fläckar mindre intensivt, medan lagret IV nästan saknar zink. Iögonfallande bristen på zink färgning i lager IV eller områden 17 och 18 kontraster med mörkt färgade bandet hittade i lager IV i CO färgade sektioner. Dock lager IV i området 17 i CO färgade sektioner upprätthåller en skarp kant med lager III och V, men skiktet IV i området 18 kännetecknas av en subtil minskning färgning intensitet och dess övre gräns som finns i lager III är mindre urskiljbara. - Undersöka sektioner med brightfield mikroskopi med låg effekt mål (2 X eller 4 X förstoring) och fotografera intresseområden.
- Förbättra kontrast och ljusstyrka av mikrofotografier använder programvara bildbehandling. Bilder erhållits för optisk densitet mätningar inte bör ändras på något sätt.
figur 4: Synaptic zink färgning i vuxen iller hjärnan skiljer olika visuella kortikala områden. Mikrofotografier av intilliggande semi tangentiella sektioner färgas för (en) synaptic zink eller (b) cytokrom oxidas (CO) i vuxen. Pilarna Markera areala gränser. SSY Suprasylvian cortex, en främre, D dorsala. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
6. Densitometry (tillval)
Obs: Densitometric analys kan användas för att bedöma fördelningen av synaptic zink i hjärnan genom att mäta den optiska densiteten av representativa zink färgade sektioner i regionerna av intresse. Denna metod är också användbar för att spåra potentiella förändringar i synaptic zink nivåer i hela utvecklingen.
- Med utvalda zink-färgade sektioner, välja slumpmässigt kortikala kolumner (columnar mikrofotografier) av lämplig bredd (en 450 µm bred kolumn kan användas) från förvärvade mikrofotografier av regionen av intresse. En kortikal kolumn är en region som sträcker sig över alla kortikala skikt från pial ytan till den vita substansen.
- Välja ett lämpligt antal prov kolumner från flera olika hjärnan avsnitt i varje region av intresse.
- Överföra provet bilder av representativa kolumner i ett bildbehandlingsprogram.
- Rektangulära markeringsverktyget till att omfatta hela kortikala kolumnen.
- Verktyget Invertera för att skapa en kontrast omvänd bild liknar en fotografiska negativ kolumnens.
Obs: Kontrast inversion av bilderna utförs för att ge hög optisk densitet för hög synaptic zink nivåer och låg optisk densitet värden för låga synaptic zink nivåer. Detta är ett mer intuitivt sätt att återge tomt profil grafer liknande dem som ses i figur 5. - Producera optiska densitet profiler från dessa bilder genom att använda verktyget tomt profil för att generera en tvådimensionell Graf över pixel stödnivåerna längs en linje.
- Användning tomt alternativ att konvertera diagrammet tomt profil till en vertikal profil och klicka på tomt profil en gång mer.
Notera: X-axeln representerar avståndet längs linjen och y-axeln representerar pixel intensiteten. Därför, varje tomt profilvärde återspeglar det genomsnittliga gråskalan värdet på varje djup tvärs över kolumnen. - Öppen tomt profil värden som textfiler i kalkylblad, normalisera och rita som grafer (se figur 5).
Obs: Det är tillrådligt att använda den relativa densiteten av synaptic zink för jämförelse av kvantitativa mätningar som resultat kan förväxlas av variation i övergripande färgning intensitet till följd av olika reaktionstider, stainability av vävnad, samt andra variabler. - Beräkna relativa zink densitet genom att först utföra en boxcar medelvärdet av tomt profil att jämna data.
Obs: Detta sker genom utjämning, till exempel varje successiva 20 eller 30 pixlar (1 pixel = 2,5 µm) i djup, och sedan normalisera till maximal intensitet för varje prov. Därför avspeglar varje genomsnittliga tomt profilvärde genomsnittliga gråskalan värdet på det djupet (gråskala värdena varierar från 0 till 255). En annan normalisering metod kan användas av första inlösande vit substans (WM) optiska densitet värden från provet regioner som omfattar den underliggande vita substansen i områden av intresse. Idealiskt, välja flera regioner som färgas så lätt som möjligt att få ett medelvärde WM värde. Genomsnittliga optisk densitet värden delas sedan av WM medelvärden att erhålla WM normaliserade värden. - Bestämma medelvärden optisk densitet i specifika lager av regioner av intresse för kvantitativa jämförelser.
Obs: till exempel genomsnittlig minsta optiska densitet värdet i lager IV av visuella kortikala områden av vesslan bestäms av omfattar minst färgade regionen ±5 pixlar. - Beräkna medelvärdet optisk densitet värden i supragranular och infragranular lager av visuella kortikala områden av vesslan av omfattar regionen mörkaste färgade ±5 pixlar att bestämma det högsta medelvärdet.
- Se till att medelvärdena för optisk densitet erhålls från inom särskilda lager.
Obs: Det är absolut nödvändigt att kontrollera gränserna för dessa lager i kontrast inverterade bilder genom att jämföra dem med de ursprungliga mikrofotografier samt det intilliggande CO-avsnittet. Detta garanterar att en inte inkräkta på intilliggande lager.
figur 5: Laminar distribution av synaptic zink i olika visuella kortikala områden i vuxen vesslan. Representativa mikrofotografier av kolumner genom alla kortikala skikt med motsvarande normaliserade optisk densitet profiler hos en vuxen. Låg synaptic zink densitet i lager IV av vuxna områden 17 och 18 indikeras av dalvärdet i profil observationsområdet. I varje tomt profil ange fyllda ovaler i tråg av lager IV de värden som används för att bestämma det genomsnittliga minsta pixelvärdet intensitet. Skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stora stegen i detta protokoll att färga hjärnan sektioner för synaptic zink presenteras i en flödesschemat i figur 1. Protokollet kan delas in i tre faser: 1) Perfusion och vävnad insamling, 2) vävnad beredning och färgning och 3) zink histokemi. Kortfattat, under den första fasen av protokollet, djuret är sövd och injiceras IP med lämplig dos av natrium selenit. Efter tillräckligt lång tid (helst 60-90 min), är därefter djuret avlivas, perfusion med 0,9% NaCl-lösning följt av en 4% PARAFORMALDEHYD lösning. Huvudet är halshuggas och hjärnan är snabbt bort från skallen. Hjärnan är då tillåtet att sjunka i en 4% PARAFORMALDEHYD plus 30% sackaroslösning som frysskyddmedel. I den andra fasen av protokollet, frusna snitt skärs på en slädmikrotom vid 40 µm in fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och separeras i numrerad serie. Det är viktigt att montera sektioner på äggvita subbed bilder omedelbart efter snittning, lämnar sektioner att torka över natten för bästa resultat. Gelatin subbed diabilder rekommenderas inte eftersom de krom kalium sulfat används vanligtvis i subbing lösningen cross-reacts med den silver laktat, vilket leder till en suboptimal färgning. Sektioner inkuberas sedan i 15 min i absolut alkohol och vänster för att torka i rumstemperatur. Detta steg är följt av en kort nedsänkning monterade avsnitt i 1% gelatin lösningen beredda i förväg, och får torka över natten för bästa resultat. I den sista fasen av protokollet (zink histokemi), utvecklare lösningen bereds enligt anvisningarna i avsnittet metoder och bilder placeras i en plast eller glas bricka nedsänkt i lösningen. Utvecklingen av fläcken tar vanligtvis någonstans mellan 2-3 h, men nära visuell inspektion är nödvändig för att undvika overstaining avsnitten. När lämplig intensitet uppnås, ska bilder bort, placeras på en objektglashållaren och sköljs i varmt vatten i 5-10 min att ta bort den yttre silverfyndighet. Avsnitten kan sedan torkas i rumstemperatur, rensat och ordning. En schematisk bild av de specifika åtgärder som krävs för att slutföra den zink histokemi fasen av protokollet visas i figur 2.
Detta protokoll använder synaptic zink histokemi för att avslöja areala och laminär variation i färgning nivåer bland visuella kortikala områden i iller hjärnan. Detta protokoll kan anpassas för användning i andra arter som i andra regioner i hjärnan. Forskare studerar andra sensoriska cortices såsom somatosensoriska, auditiv eller frontal cortex av vesslan eller någon annan modellsystem skulle exempelvis stor nytta med denna histochemical fläck. Den största fördelen med denna teknik är att det ger tydliga övergångar mellan områden för att underlätta areala identifiering hos vuxna samt tillförlitligt skilja kortikala områden i unga djur som gnagare, iller, katter och apor.
Figur 3a visar ett exempel på en zink färgade avsnitt som vi utvecklat oavsiktligt för alltför länge och därmed var overstained i processen. Overstained vävnad kännetecknas av en mycket mörk brun färg, bristande laminar variation, och kraftigt fläckade vit substans. Men kan zink-färgade hjärnan sektioner ibland vara understained som visas i figur 3b. Understained sektioner kan ibland förekomma om djuret inte överlevde för en tillräckligt lång tid (minst 60 min), vilket utesluter alla de injicerade selenit från resor till hjärnan. Understaining vävnad kan också uppstå om selenit administrerades inte ordentligt och därför inte resa till hjärnan.
Heterogena fördelningen av synaptic zink färgning i flera visuella kortikala områden i en vuxen iller visas i ett representativt semi tangentiella avsnitt i figur 4a. Pilarna pekar på areala gränser. I områden 17 och 18, synaptic zink färgning intensitet är generellt hög i lager I, II, III och V, låg i lager IV (thalamorecipient lager) och måttlig i lager VI. Förekomsten av en tydligt identifierbar övergång mellan områden 17 och 18 är tydligt i figur 4a. Layer IV färgning intensitet i området 18 ökar något och lager V minskar och är av varierande intensitet. Figur 4b är ett angränsande avsnitt färgas för cytokrom oxidas (CO) som illustrerar liknande platser av areala gränser som vi observerade med zink fläcken. Regioner av områden 17 och 18 som har höga nivåer av zink i allmänhet tycks ha låga halter av CO färgning.
Fördelningen av synaptic zink i områden 19 och 21 är kvalitativt liknande i att båda områdena har mindre laminar variation än i områden 17 och 18. Lager IV av områden 19 och 21 skiljer sig tydligt från lager IV i områden 17 och 18 i att det är måttligt målat. Supragranular och infragranular lager av område 19 är av liknande intensitet, men lager V fläckar något mörkare. Område 21 har en jämförbar synaptic zink fördelning som i område 19. Dock kännetecknas lager VI med område 21 av större synaptisk zink nivåer än lager IV av område 19. Lager VI och IV av Suprasylvian (Ssy) tycks vara måttligt färgas och jämförbara intensitet, medan lager V kännetecknas av större synaptisk zink nivåer och supragranular lager är markerade med ett varierande mönster av synaptic zink nivåer.
Kvantitativ bedömning av fördelningen av synaptic zink i olika hjärnregioner, med olika behandlingar, eller vid olika åldrar, kan åstadkommas, om så önskas. Exempelvis kan en vilja att bedöma förändringar i fördelningen av synaptic zink hos vuxna eller under utveckling i primära visuella, auditiva, och somatosensoriska cortices i varje modell. Använda Densitometrisk analys, vi har tidigare visat att fördelningen av synaptic zink i flera visuella områden (17, 18, 19, 21 och Suprasylvian) av hjärnans utveckling iller, minska kraftigt från fem till sex veckors ålder17. Här beskriver vi de steg som krävs för att bedöma skillnader i fördelningen av synaptic zink i representativa prover från en vuxen iller att illustrera processen. Dessa steg kan följas för att spåra förändringar i fördelningen av synaptic zink i juvenil iller syncentrum såväl som i alla andra arter eller hjärnan regioner. Figur 5 visar representativa columnar mikrofotografier från vuxna hjärnan avsnitt behandlas för zink histokemi tillsammans med sina kompletterande normaliserade optisk densitet tomt profiler. Normaliserade tomter av optisk densitet värden genererades för att återspegla ändringar enligt kortikala djup. Därför, varje tomt profilvärde återspeglar genomsnittliga gråskalan värdet på efterföljande kortikala djup. Exempelvis kännetecknas områden 17 och 18 av en märkbar nedgång i zink färgning i lager IV (företrädd av tråget), vilket är uppenbart från deras tomt profiler. Innebär minsta optiska densitet värden i områden 17 och 18 indikeras av de ifyllda svarta ovalerna. Den låga zink färgning observerades i områden 17 och 18 kontraster med den enda lager IV en subtil dopp i zink nivåer i områden 19, 21 och Ssy. Sammantaget områden 19, 21 och Ssy är kvalitativt annorlunda än områden 17 och 18 i det zink nivåer i hela alla lager är mer homogen än i områden 17 och 18. Dessutom den supragranular lager och lager V områden 17 och 18 normalt fläcken mer intensivt än lager VI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den aktuella studien sysselsätter en histochemical teknik baserad på en modifierad version av Danscher (1982) metod10, whereby synaptic zink lokalisering kan upptäckas och visualiseras i hjärnan. Denna metod fungerar i huvudsak genom att injicera djuret med zink kelator natrium selenit (Na2SeO3) (15 mg/kg). Efter injektion av selenit reser till hjärnan och binder till gratis zink som är lokaliserade till presynaptiska blåsor av zink som innehåller neuroner. Zink joner bundna till molekyler inom synaptiska vesikler fällningen, och därefter kan visualiseras genom fysisk utveckling2,11. Den ursprungliga Timm sulfid silver färgning metod syftade till att upptäcka och visualisera ett antal tungmetaller såsom Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni och Zn i biologisk vävnad22. Kelatbildare används för denna metod är natriumsulfid. Stora problem med att använda Timms sulfid metod därför bristande specificitet som någon metall som kan omvandlas till en metall sulfid kunde verkligen vara silver förstärks av fysisk utveckling. Den modifierade versionen av metoden Danscher som används i den aktuella studien är dock specifik för zink och inga andra tungmetaller. I området i närheten finns det flera skillnader mellan Danscher's 1982 metoden och den nuvarande metoden som vi beskriver i denna studie. Danschers metod använder färska ofixerade hjärnvävnad medan vi använder fryst vävnad. Danscher används också glutaraldehyd perfusionen, medan vi använder PARAFORMALDEHYD eftersom detta är mer kompatibel med immunhistokemiska och andra histologiska markörer som vi rutinmässigt stain för i vårt labb. Danscher använder också poststaining förfaranden såsom toluidin blå (1%), som vi utför i vår metod.
En begränsning av nuvarande teknik är det oförutsägbara som är associerad med natrium selenit tolerans av djur. Vi finner att efter administrering av natrium selenit, ibland djur inte överlever längre än 30 minuter. Denna situation utgör ett problem eftersom det tillåter inte tillräckligt med tid för den selenit att resa till hjärnan, och efterföljande utvecklingen av hjärnan delar vanligtvis leder till ojämn vävnad färgning. En annan potentiell begränsning är relaterad till en god förvaltning av intraperitoneal injektion av natrium selenit. En bör dra huden ovanför nedre bukhålan och infoga den nål avfasning Sidan upp i en vinkel på 15-20 grader, genomträngande endast den buk-väggen. Nålen ska dras tillbaka något för att säkerställa att bukorganen inte har varit trängt igenom och material har inte varit aspirerade. Nålen bör kasseras och ersättas om detta inträffar.
För att säkerställa hög kvalitet färgning resultat och reproducerbarhet, rekommenderar vi följande varnande åtgärder. God förvaltning av natrium selenit in djur och maximera överlevnadstid för djuret (60 till 90 min är optimalt) innan euthanizing, är avgörande för att säkerställa tillräcklig tid ges för det selenit att resa till hjärnan. Vi har funnit att kortare överlevnad perioder (30 minuter eller mindre) normalt leda till ojämn vävnad färgning. Jämväl, montering sektioner på äggvita subbed bilder omedelbart efter snittning blocket är ett kritiskt steg. Lämnar nyklippt frusna snitt i PBS för ett antal dagar rekommenderas starkt mot som zink joner kommer att läcka i lösningen. Under utarbetandet av utvecklare lösning är det viktigt att säkerställa citratbuffert är rätt pH (4.0) som denna reaktion är ganska känslig för små förändringar i pH. Likaså när värme hydrokinon lösningen är det absolut nödvändigt att hålla temperaturen under 60 ° C, som ytterligare uppvärmning kommer att oxidera lösningen och hämmar fläcken. Likaså är kort dränka avsnitten bild-monterad i gelatin kritisk eftersom den förhindrar icke-specifik nedfall av silver på ytan av avsnittet. Sektioner bör dock inte lämnas i gelatin lösningen längre än 10 s eftersom detta kommer att orsaka dem att skrumpna upp leder till ojämn vävnad färgning. Regelbunden okulärbesiktning av avsnitten medan i utvecklare lösning rekommenderas sedan lämnar avsnitten för länge kan leda till overstaining. Denna fläck är ganska temperaturkänsliga, så sektioner tenderar att utvecklas snabbare när den omgivande temperaturen är varm och långsammare när temperaturen är svalare. Slutligen kan en vill skaka försiktigt bilderna i objektglashållaren under steget skölja i varmt vatten för att underlätta avlägsnande av gelatin och kvarstående silverfyndighet från glasen. Dock överdrivna och slarvig agitation av sektioner medan sköljning diabilder med varmt vatten kan orsaka sektioner att glida av bilderna och bör undvikas. Det är också viktigt att garantera en ordentlig kontroll används för Densitometrisk mätningar för att göra kvantitativa jämförelser. Eventuellt kan man använda en lätt färgade eller icke-färgning region som intern kontroll. I vårt material använder vi vit substans som en kontroll för att normalisera optisk densitet värden i olika visuella kortikala områden under hela utvecklingen. Vi finner att vit substans värden är jämförbara mellan olika åldrar och i den vuxna17. Därför, med tanke på att vit substans värden inte förändras som en funktion av ålder, vit substans fungerar som en giltig kontroll för Densitometrisk analys.
Den största fördelen med denna metod är att det är en enkel och pålitlig histochemical fläcken vars fördelning kan användas, liksom andra histochemical markörer, för att skilja hjärnregioner. Men användningen av denna histochemical metod kanske inte är lämplig att studera vissa cellpopulationer (de saknar zink), eller i mycket unga djur som synaptic zink är initialt låga vid födseln som visas i utveckla mus somatosensoriska och katt syncentrum5 ,20. En annan fördel med detta protokoll är att den kan användas i samband med neuroanatomiska tracer injektion experiment. I vårt labb injicera vi vanligtvis dubbelriktad neuronala spårämne i primära syncentrum av juvenil illrar att studera utvecklingsmässiga förändringar i mönstret anslutning bland flera områden i syncentrum. Därför behöver djur inte enbart användas för zink histokemi om djuren skulle kunna utnyttjas för en annan experimentell studie. Den stora fördelen med den beskrivna metoden är att det kan anpassas för användning i andra arter och i andra regioner av hjärnan. Även om vi har visat den här metoden använder ferret hjärnvävnad, kan det finnas subtila skillnader i några av stegen när man studerar hjärnvävnad från gnagare, katt eller apor. Andra har framgångsrikt använt denna zink histochemical metod för att illustrera skillnader i färgningsmönster i vuxen apa syncentrum8, utveckla och vuxen katt syncentrum5, utveckla råtta somatosensoriska cortex9 , 20, vuxen mus somatosensoriska cortex6,21och vuxen Parma vallaby syncentrum7.
Här beskriver vi de grundläggande stegen av protokollet och understreck viktiga parametrar som måste styras för att uppnå konsekvent hög kvalitet zink färgning. En kanske vilja att bedöma förändringar i synaptic zink nivåer i andra sensoriska eller motoriska cortices eller subkortikala strukturer i andra modell djur. Den kvantitativa informationen som Densitometrisk enNALYS ger i denna metod kan vara fördelaktigt för efter kortikala utveckling över tid och eventuellt avslöjande olika utvecklande profiler av synaptic zink nivåer bland olika hjärnregioner (som vi har tidigare visat17). En viktig faktor är fosterskadande frågan och motsvarande ålder på djur att studera. Synaptic zink histokemi avslöjar tydligt identifierbara visuella kortikala områden hos illrar och kan tjäna som en användbar guide i ytterligare studier av kortikala organisation och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (2G12RR03060-26A1); National Institute on minoritet hälsa och hälsa skillnader (8G12MD007603-27) från de National institutionerna of Health; Professionell personal kongressen-City University of New York (PSC-CUNY); och fakulteten Research Grant (FRG II) amerikanska universitetet i Sharjah. Vi tackar Vidyasagar Sriramoju för att införa oss till dessa metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
