استخدام هيستوتشيميستري الزنك متشابك للكشف عن مختلف المناطق وعن في الدماغ النامي والكبار

Summary

يصف لنا إجراء histochemical الذي يكشف عن الزنك الصفحي ومساحية مميزة تلطيخ أنماط في مناطق مختلفة من الدماغ. قد تستخدم نمط تلوين الزنك بالاقتران مع علامات تشريحية أخرى موثوق بها التمييز بين الطبقات والمناطق في الدماغ النامي والكبار.

Abstract

وصف المنظمة الدماغ التشريحية والوظيفية والتنمية يتطلب التحديد الدقيق للدوائر العصبية متميزة ومناطق في الدماغ غير ناضجة والكبار. هنا يصف لنا إجراء زنك المصبوغة histochemical الذي يكشف عن الاختلافات في أنماط المصبوغة بين طبقات مختلفة ومناطق الدماغ. الآخرين قد تستخدم هذا الإجراء ليس فقط لتكشف عن توزيع الدوائر في الدماغ والخلايا العصبية المحتوية على الزنك، ولكن أيضا لترسيم الحدود المساحية وطبقية في الدماغ النامي والكبار في العديد من الأنواع بنجاح. هنا يمكننا توضيح هذا تلطيخ الإجراء مع الصور من البلدان النامية والعقول النمس الكبار. ونحن تكشف عن نمط تلوين الزنك بمثابة علامة تشريحية للمناطق والطبقات، ويمكن استخدامها للتمييز بين المناطق القشرية البصرية في القشرة البصرية النامية والكبار موثوق بها. والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تقديم أسلوب histochemical التي تسمح تحديد دقيق للطبقات والمناطق في الدماغ النامي والكبار حيث تفشل الطرق الأخرى للقيام بذلك. ثانوي، بالاقتران مع تحليل الصورة دينسيتوميتريك، هذا الأسلوب يسمح أحد لتقييم توزيع الزنك متشابك للكشف عن التغيرات المحتملة في جميع أنحاء التنمية. ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل الكواشف، والأدوات والخطوات اللازمة تباعا وصمة عار أقسام الدماغ المجمدة. على الرغم من أن يتم وصف هذا البروتوكول باستخدام أنسجة المخ النمس، بسهولة يمكن تكييفها للاستخدام في القوارض أو القطط أو القرود، وكذلك كما هو الحال في مناطق أخرى من الدماغ.

Introduction

وقد استخدمت تقليديا البقع النسيجي للمساعدة في تحديد المناطق القشرية في الأنواع المختلفة عن طريق الكشف عن الاختلافات في ملامح معمارية. الجمع بين استخدام تقنيات histochemical مثل لمادة نسل أو مفاعليه السيتوكروم أوكسيديز (CO)، أو المايلين يمكن أن يكون مثمرا كما أنها تكشف عن الحدود المساحية مشابهة في الدماغ الكبار. ومع ذلك، لا تكشف هذه البقع histochemical دائماً على نحو كاف حدود واضحة بين المناطق القشرية والطبقات في الدماغ غير ناضجة.

في الجهاز العصبي المركزي، الزنك لديه العديد من الوظائف الحيوية التي تشمل استقرار بنية الحمض النووي، بوصفها مساعد إنزيم، المشاركة في العديد من المهام التنظيمية، ووصفها نيورومودولاتور من خلال وجودها في حويصلات متشابك ¹-الزنك متشابك فريدة من نوعها، فإنه يمكن تصور استخدام أساليب غذائها، بينما الزنك البروتين زمنياً لا يمكن تصور². وقد استغلت هذه الميزة لتكشف عن نمط متشابك الزنك في مختلف المناطق القشرية، والزنك متشابك هيستوتشيميستري وقد استخدمت في عدد من الدراسات. مجموعة فرعية من جلوتاماتيرجيك الخلايا العصبية في قشرة الدماغ تحتوي على الزنك في الحويصلات presynaptic داخل تلك المحطات إكسون^3،4. وقد كشفت الدراسات histochemical توزيع غير متجانس من الزنك متشابك في قشرة الدماغ^5،،من⁶⁷. يبدو أن هناك توزيعاً مساحية وطبقية مختلفة من الزنك هيستوتشيميكالي رد الفعل في مختلف المناطق القشرية (مثلاً، البصرية مقابل قشرة somatosensory)، أو طبقات (مثلاً، مستويات الزنك في سوبراجرانولار و إينفراجرانولار طبقات من القشرة البصرية الأولية أعلى بكثير من طبقة الإدخال الرابع ثالاموكورتيكال مع مستويات منخفضة نسبيا من الزنك متشابك)^5،،من⁸⁹. عدم تجانس في تلوين الزنك متشابك في القشرة مفيد خاصة حيث أنها تسهل تحديد مساحية وطبقية.

وهنا يقدم وصفاً مفصلاً لإجراء histochemical الزنك متشابك، ونسخة معدلة من دانشير في عام 1982 الأسلوب¹⁰. ويستخدم هذا الأسلوب سيلينيت حقن إينترابيريتونيلي (IP) إلى الحيوانات كعامل شيلاتينغ. سيلينيت يسافر إلى الدماغ لتتفاعل مع تجمعات الزنك الحرة الموجودة في حويصلات من مجموعة فرعية من جلوتاماتيرجيك نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ. رد الفعل هذا غلة متسرعا التي يمكن تعزيزها بعد ذلك بوضع الفضة^2،،من¹⁰¹¹.

ويكشف هذا الإجراء الأنماط الصفحي والمساحية لتلوين الزنك متشابك؛ يمكن استخدام تحليل دينسيتوميتريك لتقييم هذه الأنماط كمياً ونوعيا في الدماغ الكبار وغير ناضجة لدراسة تأثيرات التدخلات الأخرى، مثل التلاعب الحسية والبيئية والدوائية، أو الوراثية. وعلاوة على ذلك، واحد قد تحتاج أيضا لتقييم التغيرات الإنمائية المحتملة في توزيع الزنك متشابك في الهياكل القشرية أو سوبكورتيكال الأخرى في نظم نموذجية أخرى. المعلومات الكمية التي يوفر تحليل دينسيتوميتريك في هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة لنمو الدماغ التالية مع مرور الوقت. يوفر هذا البروتوكول مصاحب لغيرها المناعية-وعلامات histochemical للكشف عن حدود الصفحي والمساحية.

Protocol

البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان أنشأ "مؤسسات الرعاية الحيوانية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في "مدينة كلية نيويورك"، التي تتوافق مع كل دولة مناسبة والمبادئ التوجيهية الاتحادية. التخدير المناسب لفرت، وينبغي تعديلها وفقا للأنواع التي شملتها الدراسة.

رقم 1: مخطط انسيابي يبين الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها في المراحل 3 من هذا البروتوكول والوقت اللازم لإتمام كل خطوة. الفترات التي تتطلب الأقسام لتجف تماما ترد في نص أخضر دوائر، بينما جميع الخطوات الأخرى في دوائر نص أبيض. مربع النص على شكل الماس الأخضر نقطة قرار، بينما المستطيل الأحمر خطوة بالغة الأهمية، وينبغي أن يقوم بمزيد من العناية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1-"الخطوات التحضيرية" (الشريحة سوبينج ويجعل الحل)

1. تغسل شرائح أونسوبيد بمطهر في الماء الساخن ويشطف عدة مرات في المياه الدافئة التي اتبعت مع شطف ماء مقطر دقة إزالة أي أوساخ أو الحطام. السماح للشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة أو في فرن في 37 درجة مئوية.
2. بمجرد شرائح جافة تماما، طبقة طبقة حتى رقيقة من البيض الأبيض على كل شريحة باستخدام الأصابع أو الرسام. السماح لتجف في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. لتحقيق أفضل النتائج وتجنب الانزلاق خارج أبواب، إضافة طبقة ثانية من البيض الأبيض والسماح لتجف مرة أخرى في الفرن 60 ° C.
3. تعد حلاً جيلاتين 1% بإذابة 1 غرام من الجيلاتين في 100 مل ماء الساخن (60 درجة مئوية) والسماح لتبرد بدرجة حرارة الغرفة-
4. إعداد 200 مل من محلول المطور كما هو موضح أدناه للاستخدام في الفرع 4-
   1. تحضير الصمغ العربي الحل بإضافة 40 ز ببطء في زيادات إلى 120 مل ماء الساخن (أنه يذوب بسهولة بهذه الطريقة). تواصل إثارة الحل مع كوب إثارة رود. بمجرد أن الحل قد حلت تماما، إزالته من الحرارة، والسماح لها ببارد لبضع دقائق، ثم تصفيتها من خلال 6-8 طبقات من القماش الشاش في قمع-
   2. سترات إعداد المخزن المؤقت عن طريق إضافة سترات الصوديوم حمض الستريك بالإضافة إلى 4.7 ز ز 5.04 في 20 مل dH ₂ س وتذويب الخليط. التأكد من أن الرقم الهيدروجيني لهذا الحل هو 4.0 في 25 ° جيم ضبط الأس الهيدروجيني إذا لزم الأمر بإضافة هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك إلى الحل.
   3. إعداد حل الهيدروكينون بتدفئة 30 مل dH ₂ س وتذويب ز 1.7 من الهيدروكينون-
      ملاحظة: تسخين الهيدروكينون الحل ضروري للسماح تذوب بسهولة في الماء كما الهيدروكينون ليس ديسولفابل سهولة في الماء في درجة حرارة الغرفة. كن حذراً الحفاظ على درجة حرارة الماء أقل من 60 درجة مئوية، وإلا قد تكون تتأكسد الهيدروكينون. إذا كان الحل الذي يتحول إلى اللون الأصفر، تجاهل وتعد حلاً جديداً آخر.
   4. لاكتات الفضة تحضير الحل بتذويب ز 0.22 في 30 مل من dH ₂ o.
   5. ميكس الحلول (1.4.1-1-4-4) في النظام التي يرد فيها عندما تكون جاهزاً القيام بردود فعل (أي، بعد تمزيقها والتجفيف، وإصلاح) ( الشكل 2). إضافة حل لاكتات الفضة في النهاية. ضمان أن يتم إكمال هذه الخطوة بسرعة ويتم وضع الحل المطور في الظلام حتى حان الوقت للرد الأقسام كما لاكتات الفضة حساس.

رقم 2: التخطيطي يوضح تسلسل الخطوات التي تنطوي عليها في خلط الكواشف في المرحلة هيستوتشيميستري الزنك البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2-معاملة الحيوان والتخدير

1. قبل المسكنة الحيوان، وتعد حلاً سيلينيت (نا ₂ كبار المسئولين الاقتصاديين ₃) صوديوم 1% بتذويب 10 مغ سيلينيت الصوديوم في 1 مل dH ₂ o.
2. تخدير الحيوان مع حقن العضلي من الكيتامين (25 ملغ/كغ) وإكسيلازيني (2 مغ/كغ)-
   ملاحظة: ضمان تحقيق مستوى مناسب من التخدير باستخدام استجابة منعكس الدواسة.
3. إدخال الزنك chelator الحل سيلينيت الصوديوم (15 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي (IP)-
   ملاحظة: يمكن أن تختلف سمية سيلينيت الصوديوم في إعمار مختلفة أو في الأنواع الأخرى-
السماح
4. 60 إلى 90 دقيقة سيلينيت الصوديوم للسفر إلى الدماغ. وخلال هذه الفترة، لا بد من التأكد من أن الحيوان هو مخدراً بشكل صحيح، وهو لا يستجيب، حتى تحقق عمق التخدير كل دقيقة 5
5. خلال فترة سيلينيت، بينما تم تخديره من الحيوان، ضمان أن يتم إغلاق العينين لمنع جفاف، أو إدارة مرهم العيون لإبقائها رطبة.

3. إعداد الأنسجة وستينينج

1. Euthanize الحيوان بالدولة القائمة بجرعة زائدة من الصوديوم بينتوباربيتال (100 مغ/كغ، والملكية الفكرية)-
2. إجراء نضح ترانسكارديال مع المحلول الملحي العادي لمدة 1 دقيقة، ومع بارافورمالدهيد 4% عن 20 دقيقة وأخيراً، إدارة حلاً مع السكروز بارافورمالدهيد و 10% 4% (فترة تثبيت الكامل من ح 1)-
3. إزالة الرأس باستخدام زوج من مقص كبير.
4. جعل شق خط الوسط باستخدام مشرط من الآنف في الرقبة لفضح الجمجمة.
5. بعناية إزالة الدماغ وفصل في نصفي الكرة الأرضية مع شفرة-
6. بلوك في الجزء الخلفي من الدماغ و postfix في بارافورمالدهيد 4 ٪ في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (الجريدة الرسمية) لعدة ساعات-
7. وضع الكتل في حل سكروز 30% في الجريدة الرسمية م 0.1 وتسمح للدماغ بالوعة.
   ملاحظة: استبدال محلول السكروز بارافورمالدهيد و 30% 4% مع محلول السكروز 30% في الجريدة الرسمية م 0.1 بالوعة الدماغ يحد المخ ' s التعرض إلى بارافورمالدهيد كهذا يمكن أن يؤثر على الأنسجة تلطيخ الجودة.
المصارف
8. مرة واحدة في الدماغ، قطع شبه عرضية 40 ميكرومتر أبواب سميكة من خلال القشرة البصرية أو المنطقة لمصلحة في تجميد أو انزلاق مبضع أو كريوستات. يمكن تحقيق هذا عن طريق وضع الكتلة مع الآنسي السطحية إلى أسفل والتسوية بلطف مع شريحة زجاجية.
9. جمع المقاطع مع الرسام ومخزن في مواجهة صندوق يحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
10. فصل المقاطع إلى سلسلة رقمية منفصلة. جبل فورا واحدة أو سلسلتين من أقسام الدماغ على الشرائح subbed البيض الأبيض (الجزء 1)، تسمح للمبيت جاف في درجة حرارة الغرفة، وعملية الأقسام هيستوتشيميكالي بالنسبة للزنك متشابك.
    ملاحظة: قد يتم معالجة سلسلة أخرى لعلامات أخرى للمقارنة، مثل المايلين ¹² أو السيتوكروم أوكسيديز باستخدام بروتوكول تعديل ¹³: احتضانها ح 2-8 عند 40 درجة مئوية مع السكروز 3%، 0.015% السيتوكروم ج، كاتالاز 0.015%، و 0.02% ديامينوبينزيديني في الجريدة الرسمية م 0.1. قد تستعمل أيضا مادة نسل كعلامة النسيجي لتمييز المناطق القشرية البصرية. لا تتطلب هذه البقع النسيجي الأخرى أن أقسام الدماغ هي التي شنت على الشرائح subbed البيض الأبيض، حيث يمكن استخدام الشرائح التقليدية الجيلاتين المغلفة بدلاً من ذلك.

4. متشابك "الزنك هيستوتشيميستري"

1. إصلاح أقسام الشريحة التي شنت في الكحول المطلق لمدة 15 دقيقة، والسماح لتجف تماما في درجة حرارة الغرفة حاء – 1
< lأنا > تزج بإيجاز مقاطع ل 10 ق في محلول جيلاتين 1% (القسم 1) والسماح للمبيت جاف في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: للحصول على النتائج المثلى تسمح المقاطع إلى الجافة بين عشية وضحاها. السماح بالمقاطع إلى الجافة بين عشية وضحاها غلة تلطيخ الأنسجة أفضل.
2. معا كما هو موضح في الخطوة 1.8 أقرب الفروع على استعداد لأن يكون رد فعل مزيج الحلول.
   1. الرد الأقسام حسب ترتيب الشرائح جنبا إلى جنب في الزجاج أو علبة بلاستيكية، وصب محلول النامي على الشرائح. تحقق من أن الشرائح مغمورة تماما في الحل ونقل العلبة في الفضاء مظلم، أو تغطية مع مربع ضوء محكم.
      ملاحظة: علبة بلاستيكية أن حوالي 12 بوصة يمكن استخدامها منذ فترة طويلة قبل 8 بوصة، مما يناسب الشرائح بالضبط 18. إجمالي حجم 200 مل مطور الحل غير كافية لغمر الشرائح تماما، حتى تضمن أن يستخدم وحدة التخزين الصحيحة لعدد الشرائح ليكون رد فعل وضبط الوصفة تبعاً لذلك. من المستحسن استخدام علبة بلاستيكية أو زجاجية بدلاً من استخدام علبة معدنية كما أن هناك درجة معينة من الصليب تفاعلية بين لاكتات الفضة في الحل المطور والحديد أو المعادن الأخرى الموجودة في علب معدنية.
3. رصد تطور رد الفعل بتفتيش بصريا المقاطع كل 30 دقيقة. الأقسام عموما تتطلب 120-180 دقيقة لاستكمال تطوير.
4. إذا أصبحت أوفيرستينيد الأقسام (انظر الشكل 3 ألف)، تفرق في 2% مزارع ' حل s (9 أجزاء ثيوكبريتات الصوديوم 2% في dH ₂ س وجزء 1 2% "سيانيد البوتاسيوم" في dH ₂ س) لدقيقة 1-2
   ملاحظة: يظهر المقطع عينة الذي هو ضعيف الملون في الشكل 3b.
5. متى تحقق كثافة المرجوة، إنهاء رد فعل عن طريق إزالة الشريحة تحميل المقاطع من الدرج ووضع الشرائح على حامل شرائح.
6. وضع على الرف الشرائح في زجاج كبيرة تلطيخ طبق ويغسل الشرائح في الحارة (40-50 درجة مئوية) تشغيل المياه لمدة 10 دقيقة لإزالة طبقة الجيلاتين وإيداع الفضة الخارجي.
   ملاحظة: كن حذراً لا تحرض حامل الشرائح للحيلولة دون الانزلاق خارج أبواب. كثافة المرجوة من المقطع ويتحقق عندما يتضح التباين الصفحي كافية والمقاطع الظلام ما يكفي ولكن لا تفرط (انظر الشكل 4a).
7. السماح للشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة، ويذوي ثم في 100% EtOH (5 دقائق)، واضحة في زيلين نفط (5 دقائق)، وكشف الغطاء مع وسيلة متزايدة. وبدلاً من ذلك، وضع الشرائح في سلسلة تصاعدي من الكحول، ثم يذوي، واضحة، وساترة-
8. استخدام أقسام من الحيوانات دون علاج سيلينيت السابقة ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبية. فضة التضخيم من هذه الأقسام ينبغي أن تسفر عن لا تلطيخ.

رقم 3: الزنك متشابك تلطيخ في الدماغ النمس الأحداث. Photomicrographs شبه عرضية الأقسام الملطخة بالزنك أ) أوفيرستينيد وب) أونديرستينيد في الدماغ النمس الأحداث. الحدود المساحية من الصعب أن نتبين كما تفتقر إلى تباين الصفحي. هو الملون الأبيض هذه المسألة أيضا بشكل كبير. سوبراسيلفيان Ssy اللحاء، الأبيض WM يهم، الأمامي، د الظهرية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (أ-ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

5-التمييز بين الحدود المساحية والحصول على الصور

1. استخدام ميزات معمارية لمناطق الدماغ المختلفة لتحديد مساحية وطبقية.
   ملاحظة: على سبيل المثال، في وضع الفئران ريتروسبلينيال اللحاء ¹⁴، المؤلفين كشف نمطية عابرة تتسم بصبغة ثقيلة بالنسبة للزنك، الذي لم يكن موجوداً في تعليم الكبار ولكن يمكن أن تستخدم لوصف القشرية المنظمة خلال التنمية في هذه الأنواع. في آخر دراسة ¹⁵، كشف الكتاب خصوصية في توزيع الزنك متشابك الأنوية المختلفة الموجودة في اللوزة القرد المكاك، مما يسهل تحديد هذه الانقسامات. المناطق القشرية البصرية في الدماغ النمس النامية والكبار قد تم وصفه سابقا ^{16 ، 17 ، 18}، تقسيم معمارية اللحاء الجديد في وكان السنجاب الرمادي وصف ¹⁹. وعلاوة على ذلك، هيستوتشيميستري الزنك كان يستخدم للتمييز بين المناطق في القرد الكبار القشرة البصرية ⁸ ووضع بالغ القط القشرة البصرية ⁵، وضع قشرة somatosensory الفئران ^{9 ، 20}، والكبار الماوس قشرة سوماتوسينسوري ^{6 ، 21}. إذا كان متوفراً، مقارنة نمط المصبوغة في المايلين الملون، السيتوكروم أوكسيديز (CO) الملون، والزنك متشابك الملون أقسام الدماغ، لتأكيد الحدود المساحية في الكبار. في أقسام شبه عرضية من القشرة البصرية النمس الملون للزنك متشابك، هناك اختلافات بارزة بين المناطق القشرية المرئية التي تسهل تحديد مساحية. على سبيل المثال، والمناطق 17 و 18 من النمس الكبار تكشف أن تلوين الزنك متشابك مرتفع في طبقات من الأول إلى الثالث والسادس طبقة ف البقع أقل مكثف، بينما يفتقر الطبقة الرابعة تقريبا الزنك. وجدت نقص الزنك تلطيخ في الطبقة الرابعة أو المناطق 17 و 18 يتناقض مع الفرقة الملون مظلم واضح في طبقة الرابع في أول أكسيد الكربون الملون المقاطع. ومع ذلك، الطبقة الرابعة منطقة 17 في ثاني الملون المقاطع يحافظ على حدود حادة مع طبقات الثالث والخامس ولكن تتميز بانخفاض خفية في تلطيخ كثافة الطبقة الرابعة في المنطقة 18 وحدودها العليا الموجودة في طبقة الثالث أقل يمكن تمييزها.
2. دراسة أقسام استخدام الفحص المجهري برايتفيلد مع هدفا طاقة منخفضة (2 X أو 4 X التكبير) وتصوير مجالات الاهتمام.
3. تعزيز التباين والسطوع من photomicrographs استخدام برامج معالجة الصورة. الحصول على صور لقياسات الكثافة البصرية لا ينبغي تغيير في أي حال من الأحوال-

الرقم 4: يميز الزنك متشابك تلطيخ في الدماغ النمس الكبار مختلف المناطق القشرية البصرية- Photomicrographs الأقسام شبه عرضية المتاخمة الملون على () متشابك الزنك أو (ب) السيتوكروم أوكسيديز (CO) في الكبار. سهام علامة الحدود المساحية. سوبراسيلفيان Ssy اللحاء، الأمامي، د الظهرية. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

6-قياس كثافة (اختياري)

ملاحظة: دينسيتوميمكن استخدام تحليل اتريك لتقييم توزيع الزنك متشابك في الدماغ بقياس الكثافة البصرية من الزنك الممثل الملون الفروع في المناطق ذات الاهتمام. هذا الأسلوب أيضا مفيدة لتتبع التغيرات المحتملة في مستويات الزنك متشابك في جميع أنحاء التنمية-

1. استخدام تحديد المقاطع الملطخة بالزنك، عشوائياً اختر الأعمدة القشرية (photomicrographs عمودي) للعرض المناسب (يمكن استخدام عمود واسعة 450 ميكرون) من photomicrographs المكتسبة من منطقة الاهتمام. عمود القشرية ومنطقة تغطي كل الطبقات القشرية من السطح بيال للمسألة الأبيض.
2. اختيار عدد مناسب من أعمدة عينة من عدة أقسام مختلفة من الدماغ في كل منطقة من مناطق الاهتمام.
3. نقل الصور عينة تمثيلية الأعمدة في برامج معالجة صور-
4. استخدام أداة التحديد المستطيل لكي يشمل العمود بأكمله القشرية.
5. استخدام أداة المقلوب لإنشاء صورة تباين عكس مماثلة إلى سلبية فوتوغرافية العمود.
   ملاحظة: يتم انعكاس على النقيض من الصور تسفر عن قيم عالية الكثافة البصرية لمستويات عالية من الزنك متشابك وقيم منخفضة الكثافة البصرية لمستويات منخفضة من الزنك متشابك. هذه طريقة أكثر بديهية لتقديم الرسوم البيانية الشخصية مؤامرة مشابهة لتلك التي ينظر إليها في الشكل 5-
6. إنتاج ملفات تعريف الكثافة البصرية من هذه الصور باستخدام أداة الشخصية مؤامرة لإنشاء رسم بياني ثنائي الأبعاد من كثافة بكسل على طول خط-
7. خيارات استخدام الأرض لتحويل الرسم البياني مؤامرة الشخصية إلى تشكيل جانبي عمودي انقر فوق الأرض الشخصية مرة واحدة أكثر.
   ملاحظة: المسافة ويمثل المحور السيني على طول الخط، والمحور الصادي يمثل كثافة بكسل. ولذلك، يعكس كل قيمة الشخصية في الأرض قيمة مقياس رمادي متوسط في عمق كل عبر عرض العمود.
8. الأرض المفتوحة القيم الشخصية كملفات نصية في جدول البيانات، وتطبيع، والأرض كالرسوم البيانية (انظر الشكل 5)-
   ملاحظة: من المستحسن استخدام الكثافة النسبية للزنك متشابك لمقارنة القياسات الكمية كما يمكن مرتبك النتائج حسب الاختلاف في كثافة المصبوغة عموما نتيجة لرد فعل أوقات مختلفة، ستينابيليتي من الأنسجة، فضلا عن غيرها المتغيرات-
9. حساب الكثافة النسبية الزنك عن طريق إجراء أول متوسط النقل القيم الشخصية مؤامرة البيانات على نحو سلس.
   ملاحظة: هذا هو إنجاز بالمتوسط، على سبيل المثال، كل بكسل 20 أو 30 المتعاقبة (1 بيكسل = 2.5 ميكرومتر) في العمق، وتطبيع ثم إلى حدة الأقصى لكل عينة. ولذلك، يعكس كل الأرض متوسط قيمة الشخصية القيمة مقياس رمادي متوسط في هذا العمق (تدرج الرمادي قيم تتراوح بين 0 إلى 255). يمكن استخدام أسلوب تطبيع مختلفة بقيم الكثافة البصرية المسألة الأبيض (WM) المقتني الأولى من مناطق العينة تتضمن المسألة الأبيض الكامنة في المجالات التي تهم. ومن الناحية المثالية، اختيار عدة مناطق ملطخة رفق قدر الإمكان للحصول على متوسط قيمة WM. قيم متوسط الكثافة البصرية هي ثم مقسوماً على متوسط القيم وات للحصول على قيم WM تطبيع.
يعني
10. تحديد قيم الكثافة البصرية في طبقات معينة من المناطق ذات الاهتمام بالنسبة للمقارنات الكمية.
    ملاحظة: على سبيل المثال، قيمة متوسط الكثافة البصرية الحد الأدنى في الطبقة الرابعة من المناطق القشرية البصرية للنمس تتحدد يشمل المنطقة الأقل ملطخة بدقة ± 5 بكسل-
11. حساب متوسط الكثافة البصرية القيم الموجودة في طبقات سوبراجرانولار وإينفراجرانولار من المناطق القشرية البصرية للنمس التي تشمل منطقة أحلك ملطخة بدقة ± 5 بكسل لتحديد الحد الأقصى لقيمة متوسط-
12. التأكد من أن يعني قيم الكثافة البصرية يتم الحصول عليها من داخل طبقات معينة.
    ملاحظة: من الضروري التحقق من حدود هذه الطبقات في الصور التباين مقلوب بمقارنتها photomicrographs الأصلي، فضلا عن قسم أول أكسيد الكربون المجاور. وهذا يضمن أن المرء لا تتدخل في الطبقات المجاورة.

رقم 5: توزيع الصفحي الزنك متشابك في القشرية المختلفة البصرية المناطق في النمس الكبار- الممثل photomicrographs الأعمدة عبر جميع الطبقات القشرية مع ملامح الكثافة البصرية تطبيع المقابلة في الكبار. يشار إلى الزنك متشابك منخفضة الكثافة في الطبقة الرابعة من المناطق البالغين 17 و 18 بالحوض الصغير في المؤامرة الشخصية. في كل ملف تعريف المؤامرة، تشير الأشكال البيضاوية شغلها في الحوض الصغير الطبقة الرابعة إلى القيم المستخدمة لتحديد قيمة بكسل الحد الأدنى متوسط الكثافة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

وترد الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها في هذا البروتوكول وصمة عار أقسام الدماغ للزنك متشابك في المخطط انسيابي في الشكل 1. البروتوكول يمكن تقسيمها إلى ثلاث مراحل: 1) نضح وجمع الأنسجة وإعداد 2) الأنسجة وتلطيخ والزنك 3) هيستوتشيميستري. باختصار، خلال المرحلة الأولى من البروتوكول، الحيوان تم تخديره وحقن IP مع الجرعة المناسبة من سيلينيت الصوديوم. بعد فترة زمنية كافية (من الناحية المثالية 60-90 دقيقة)، يتم بعد ذلك euthanized الحيوان perfused مع محلول كلوريد الصوديوم 0.9% تليها حل بارافورمالدهيد 4%. هو مقطوعة الرأس في الرأس والدماغ هو إزالتها بسرعة من الجمجمة. ثم يسمح لتغرق في بارافورمالدهيد 4% بالإضافة إلى 30% من محلول السكروز ك cryoprotectant الدماغ. في المرحلة الثانية من البروتوكول، يقتطع على مبضع انزلاق في 40 ميكرومتر مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) الأجزاء المجمدة وتقسيمها إلى سلسلة مرقمة. من المهم لتحميل المقاطع على الشرائح subbed البيض الأبيض فورا بعد تمزيقها، تاركاً الأجزاء الجافة بين عشية وضحاها لتحقيق أفضل النتائج. Subbed الجيلاتين لا ينصح الشرائح كما كروسرياكتس "كبريتات البوتاسيوم الكروم" عادة ما تستخدم في الحل تدرج مع لاكتات الفضة، مما أدى إلى تلطيخ دون الحد الأمثل. ثم هي المحتضنة الأقسام لمدة 15 دقيقة في الكحول المطلق وتركت لتجف تماما في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة متبوعاً غمر موجزة من المقاطع المحملة في محلول الجيلاتين 1% أعد قبل الوقت المحدد، والسماح لتجف بين عشية وضحاها لتحقيق أفضل النتائج. في المرحلة الأخيرة من البروتوكول (هيستوتشيميستري الزنك)، على استعداد الحل المطور وفقا للخطوات المذكورة في هذا القسم الأساليب، والشرائح وتوضع في علبة بلاستيكية أو زجاجية مغمورة في الحل. وضع وصمة عار يستغرق عادة في أي مكان بين 2-3 ح، ولكن الفحص البصري الوثيق ضروري لتجنب أوفيرستاينينج المقاطع. عندما يتم تحقيق كثافة مناسبة، الشرائح ينبغي إزالتها، وضعت على رف شرائح وتشطف بماء دافئ لمدة 5-10 دقيقة لإزالة إيداع الفضة الخارجي. ثم يمكن أن تجفف المقاطع في درجة حرارة الغرفة، وتطهيرها وكوفيرسليبيد. ويرد في الشكل 2تخطيطي للخطوات المحددة اللازمة لإتمام المرحلة هيستوتشيميستري الزنك من البروتوكول.

هذا البروتوكول يستخدم هيستوتشيميستري الزنك متشابك لتكشف عن تباين مساحية وطبقية في مستويات المصبوغة بين المناطق القشرية البصرية في الدماغ النمس. هذا البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام في الأنواع الأخرى، وكذلك كما هو الحال في مناطق أخرى من الدماغ. على سبيل المثال، أن الباحثين دراسة أخرى كورتيسيس الحسية مثل قشرة somatosensory أو السمعية أو أمامي النمس أو أي نظام آخر في نموذج سيستفيد كثيرا من استخدام هذه وصمة عار histochemical. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب أنه يوفر انتقالات واضحة بين المناطق لتسهيل تحديد مساحية في الكبار، فضلا عن موثوق بها التفريق بين المناطق القشرية في صغار الحيوانات مثل القوارض، فرت والقطط والقرود.

يبين الشكل 3 ألف مثال للزنك المقطع الملون الذي وضعنا عن غير قصد لفترة طويلة جداً ومن ثم كان أوفيرستينيد في العملية. ويتميز بلون بني داكن جداً، عدم وجود تباين الصفحي، الأنسجة أوفيرستاينيد الملون الأبيض هذه المسألة بشكل كبير. ومع ذلك، يمكن في بعض الأحيان أونديرستاينيد أقسام الدماغ الملطخة بالزنك كما هو موضح في الشكل 3. أقسام أونديرستاينيد يمكن أن يحدث أحياناً إذا لم ينج الحيوان لمدة كافية من الزمن (على الأقل 60 دقيقة)، الذي يحول دون جميع سيلينيت حقن السفر إلى الدماغ. أونديرستاينينج للنسيج قد تحدث أيضا إذا سيلينيت لا تدار بشكل صحيح وذلك عدم السفر إلى الدماغ.

ويرد التوزيع غير متجانسة من الزنك متشابك تلطيخ في المناطق القشرية البصرية متعددة في النمس الكبار في مقطع شبه عرضية ممثل في الشكل 4a. تشير الأسهم إلى الحدود المساحية. في المناطق 17 و 18، كثافة المصبوغة من الزنك متشابك مرتفع عموما في طبقات أنا والثاني والثالث والخامس، وانخفاض في الطبقة الرابعة (طبقة ثالاموريسيبينت)، ومعتدلة في الطبقة السادسة. ويتجلى وجود مرحلة انتقالية محددة بوضوح بين المناطق 17 و 18 في الشكل 4a. الطبقة الرابعة كثافة المصبوغة في المنطقة 18 يزيد قليلاً ويقلل من طبقة الخامس وهو متغير الشدة. هو الشكل 4b قسما المتاخمة الملون السيتوكروم أوكسيديز (CO) الذي يوضح مواقع مماثلة للحدود المساحية لأننا لاحظنا مع وصمة عار الزنك. تظهر مناطق مناطق 17 و 18 التي تحتوي على مستويات عالية من الزنك عموما مستويات منخفضة من شركة تلطيخ.

توزيع الزنك متشابك في المناطق 19 و 21 يشبه نوعيا في كلا المجالين بتباين الصفحي أقل مما في المناطق 17 و 18. الطبقة الرابعة من مناطق 19 و 21 وضوح مختلفة من الطبقة الرابعة في المناطق 17 و 18 في هذا معتدل الملون. طبقات سوبراجرانولار وإينفراجرانولار من منطقة 19 من كثافة مماثلة، ولكن طبقة الخامس بقع أغمق قليلاً. المنطقة 21 بتوزيع زنك متشابك مماثلة إلى أن في المنطقة 19. ومع ذلك، الطبقة السادسة من منطقة 21 يتسم بمستويات الزنك متشابك أكبر من الطبقة الرابعة من منطقة 19. طبقات السادس والرابع سوبراسيلفيان (Ssy) ويبدو أن تكون معتدلة الملون وكثافة قابلة للمقارنة، بينما الطبقة الخامس يتسم بزيادة مستويات الزنك متشابك وطبقات سوبراجرانولار تميزت بنمط تقلب مستويات الزنك متشابك.

التقييم الكمي لتوزيع الزنك متشابك في مناطق الدماغ المختلفة، مع المعالجات المختلفة، أو في إعمار مختلفة، يمكن أن يتحقق، إذا رغبت في ذلك. على سبيل المثال، واحد قد ترغب في تقييم التغيرات في توزيع الزنك متشابك في البالغين أو في جميع أنحاء التنمية في الابتدائي البصرية والسمعية، وكورتيسيس سوماتوسينسوري في أي نموذج النظام. باستخدام تحليل دينسيتوميتريك، نحن سابقا أظهرت أن توزيع الزنك متشابك في المناطق البصرية متعددة (17، 18، 19 و 21 وسوبراسيلفيان) للدماغ النمس، تنخفض إلى حد كبير من خمسة إلى ستة أسابيع من العمر¹⁷. هنا يصف لنا الخطوات المطلوبة لتقييم الاختلافات في توزيع الزنك متشابك في عينات تمثيلية مأخوذة من النمس الكبار توضيح هذه العملية. يمكن أن تتبع هذه الخطوات لتعقب التغييرات في توزيع الزنك متشابك في القشرة البصرية النمس الأحداث، وكذلك كما هو الحال في أي مناطق أخرى من الأنواع أو الدماغ. يبين الشكل 5 photomicrographs عمودي الممثل من أقسام الدماغ الكبار المجهزة للزنك هيستوتشيميستري جنبا إلى جنب مع ملفاتهم الأرض كثافة بصرية طبيعية مكملة. تم إنشاؤها مؤامرات طبيعية لقيم الكثافة البصرية لكي يعكس التغييرات وفقا لعمق القشرية. ومن ثم، يعكس كل قيمة الشخصية مؤامرة القيمة تدرج الرمادي المتوسط في أعماق القشرية على التوالي. على سبيل المثال، تتسم بانخفاض ملحوظ في الزنك تلطيخ في الطبقة الرابعة (ممثلة بواسطة الحوض الصغير)، وواضح من ملامح مؤامرة المناطق 17 و 18. يعني يتم الإشارة إلى قيم الكثافة البصرية الحد الأدنى في مجالات 17 و 18 بالأشكال البيضاوية السوداء شغلها. الزنك منخفض تلطيخ الملاحظ في الطبقة الرابعة من المناطق 17 و 18 يتناقض مع فقط المستويات تراجع خفية في الزنك في المناطق 19 و 21 و Ssy. المجالات مجتمعة، 19 و 21 و Ssy تختلف نوعيا عن المناطق 17 و 18 في هذا أكثر تجانساً من مستويات الزنك في جميع أنحاء كل الطبقات في مناطق 17 و 18. وعلاوة على ذلك، طبقات سوبراجرانولار وطبقة الخامس من المناطق 17 و 18 عادة وصمة عار أكثر كثافة من الطبقة السادسة.

Discussion

وتستخدم الدراسة الحالية أسلوب histochemical استناداً إلى نسخة معدلة من دانشير الأسلوب (1982)¹⁰، حيث يمكن الكشف عن التعريب الزنك متشابك وتصور في الدماغ. ويعمل هذا الأسلوب أساسا عن طريق حقن الحيوان مع سيلينيت الصوديوم تشيلاتور الزنك (نا₂كبار المسئولين الاقتصاديين₃) (15 مغ/كغ). بعد الحقن، سيلينيت يسافر إلى الدماغ ويربط الزنك الحرة مترجمة إلى حويصلات presynaptic الزنك التي تحتوي على الخلايا العصبية. أيونات الزنك منضمة إلى جزيئات داخل ترسبات حويصلات متشابك، ويمكن تصور فيما بعد من خلال التنمية العمرانية^2،11. كبريتيد الفضة تيم الأصلي لتلطيخ أسلوب يهدف إلى اكتشاف ووضع تصور لعدد من الفلزات الثقيلة مثل الاتحاد الأفريقي، Ag، Pt، Fe، ومؤتمر نزع السلاح، Cu، ني، والزنك في الأنسجة البيولوجية²². أن عامل شيلاتينغ المستخدمة لهذا الأسلوب كبريتيد الصوديوم. ولذلك، هو مشكلة رئيسية مع استخدام أسلوب كبريتيد تيم لعدم وجود خصوصية كما يمكن أن يكون أي المعادن التي يمكن أن تتحول إلى كبريتيد معادن الواقع فضة تضخيمه بالتنمية العمرانية. الإصدار المعدل من الأسلوب دانشير المستخدمة في الدراسة الحالية غير محددة للزنك ولا المعادن الثقيلة الأخرى. وهناك العديد من الاختلافات بين عام 1982 الأسلوب في دانشير والأسلوب الحالي الذي يصف لنا في هذه الدراسة. يستخدم الأسلوب دانشير في أنسجة المخ غير المثبتة الطازجة في حين أننا نستخدم الأنسجة المجمدة. كما يستخدم دانشير glutaraldehyde التروية، بينما نحن نستخدم بارافورمالدهيد أن هذا أكثر توافقاً مع المناعي وعلامات نسيجية أخرى نحن بشكل روتيني وصمة عار لفي المختبر لدينا. كما يستخدم دانشير إجراءات بوستستاينينج مثل تولويدين الأزرق (1%)، التي نحن لا تؤدي في أسلوبنا.

واحد الحد من الأسلوب الحالي هو عدم القدرة على التنبؤ المرتبطة بالتسامح سيلينيت الصوديوم بالحيوانات. ونجد أن بعد إدارة سيلينيت الصوديوم، في بعض الأحيان الحيوانات لا البقاء على قيد الحياة أطول من 30 دقيقة. ويطرح هذا الوضع مشكلة كما أنه لا يتيح وقتاً كافياً سيلينيت السفر إلى الدماغ، والتنمية اللاحقة من أقسام الدماغ يؤدي عادة إلى تلطيخ الأنسجة غير متكافئ. قيود محتملة أخرى تتصل بالإدارة السليمة لحقن داخل سيلينيت الصوديوم. واحد ينبغي سحب على الجلد أعلاه تجويف البطن السفلي وإدراج الجانب المشطوف إبرة حتى الساعة بزاوية 15-20 درجة، اختراق جدار البطن فقط. الإبرة ينبغي أن تكون انسحبت قليلاً التأكد من أنه قد لا تم اختراق أجهزة البطن وقد تم ولا يستنشق المواد. وينبغي التخلص من الإبرة واستبدالها في حالة حدوث ذلك.

ولضمان نتائج المصبوغة ذات جودة عالية وإمكانية تكرار نتائج، نوصي باتخاذ التدابير التحذيرية التالية. الإدارة السليمة سيلينيت الصوديوم داخل الوقت البقاء على قيد الحياة الحيوانية، وتحقيق الحد الأقصى من الحيوان (60 إلى 90 دقيقة الأمثل) قبل يوثانيزينج، ذات الأهمية الحاسمة لضمان إعطاء الوقت الكافي سيلينيت السفر إلى الدماغ. وقد وجدنا أن أقصر فترات بقاء (30 دقيقة أو أقل) عادة ما تؤدي إلى تلطيخ الأنسجة غير متكافئ. وبالمثل، تركيب المقاطع على الشرائح subbed البيض الأبيض مباشرة بعد تقطيع الكتلة خطوة حاسمة. ترك طازجة قطع المقاطع المجمدة في برنامج تلفزيوني لعدد من الأيام بشدة ينصح ضد كما سوف ليتش أيونات الزنك في الحل. أثناء إعداد الحل المطور، أنها حاسمة لضمان المخزن المؤقت سترات ذات الرقم الهيدروجيني الصحيح (4.0) كما رد الفعل هذا حساس جداً للتغيرات الصغيرة في درجة الحموضة. وبالمثل، عند تدفئة حل الهيدروكينون أنه لا بد من الحفاظ على درجة حرارة أقل من 60 درجة مئوية، كزيادة تدفئة سوف أكسدة الحل وتعوق وصمة عار. وبالمثل، غمر أقسام الشريحة التي شنت في الجيلاتين بإيجاز الحاسمة كما أنه يمنع ترسب الفضة على سطح المقطع غير محددة. ومع ذلك، لا ينبغي ترك المقاطع في الحل الجيلاتين أطول من 10 s كهذا سيؤدي إلى تذبل حتى تؤدي إلى تلطيخ الأنسجة غير متكافئ. وينصح دورية التفتيش البصري للمقاطع بينما في الحل المطور منذ أن ترك المقاطع لفترة طويلة جداً يمكن أن يؤدي إلى أوفيرستينينج. هذا وصمة هو إلى حد ما درجة الحرارة الحساسة، حيث الأقسام تميل إلى وضع أكثر بسرعة عندما تكون درجة الحرارة المحيطة دافئة، وأكثر ببطء عندما تكون درجة الحرارة أكثر برودة. وأخيراً، واحد قد ترغب في هزة بلطف الشرائح في حامل الشريحة أثناء الخطوة الشطف بالماء الدافئ لتسهيل إزالة الجيلاتين وإيداع الفضة المتبقية من الشرائح. ومع ذلك، التحريض المفرط والإهمال من أقسام بينما الشطف الشرائح بماء دافئ يمكن أن يسبب المقاطع إلى كشف قبالة الشرائح وينبغي تجنبها. من المهم أيضا لضمان استخدام عنصر تحكم مناسب للقياسات دينسيتوميتريك لإجراء مقارنات كمية. يمكن استخدام منطقة طفيفة الملون أو غير تلطيخ يحتمل أن تكون كرقابة داخلية. في حياتنا المادية، نستخدم الأمر الأبيض كعنصر تحكم لتطبيع قيم الكثافة البصرية في مختلف المناطق القشرية البصرية في جميع أنحاء التنمية. ونجد أن المسألة الأبيض قيم قابلة للمقارنة عبر مختلف الإعمار وفي البالغين¹⁷. ولذلك، نظراً لأن لا تقم بتغيير قيم هذه المسألة الأبيض كدالة للعمر، يخدم المسألة الأبيض كعنصر تحكم صالحة لتحليل دينسيتوميتريك.

والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه وصمة histochemical بسيطة وموثوق بها يمكن استخدامها له توزيع، مثل علامات أخرى histochemical، للتمييز بين مناطق الدماغ. ومع ذلك، استخدام هذا الأسلوب histochemical قد لا تكون مناسبة لدراسة السكان خلية معينة (تلك التي تفتقر إلى الزنك)، أو في الحيوانات الصغار جداً كالزنك متشابك مستويات منخفضة في البداية عند الولادة كما هو مبين في وضع الماوس سوماتوسينسوري والقط القشرة البصرية^{5 ،20}. وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول أنه يمكن استخدامه بالتزامن مع تجارب حقن الراسم نيورواناتوميكال. في المختبر لدينا، نحن عادة حقن الراسم العصبية ثنائي الاتجاه في قشرة البصرية الأولية فرت الأحداث لدراسة التغيرات الإنمائية في نمط الاتصال بين مناطق متعددة في القشرة البصرية. ولذلك، الحيوانات تحتاج فقط إلا للزنك هيستوتشيميستري إذا كان يمكن استغلال الحيوانات لدراسة تجريبية مختلفة. والميزة الرئيسية لطريقة وصف إمكانية تكييفها للاستخدام في الأنواع الأخرى وفي مناطق أخرى من الدماغ. على الرغم من أن قد أثبتنا هذا الأسلوب استخدام أنسجة المخ النمس، قد تكون هناك اختلافات طفيفة في بعض الخطوات عند دراسة أنسجة المخ من القوارض أو القطط أو القرود. أخرى استخدمت بنجاح هذا الأسلوب histochemical الزنك لتوضيح الاختلافات في تلطيخ نمط في القرد الكبار القشرة البصرية⁸ووضع بالغ القط القشرة البصرية⁵، وضع الفئران قشرة سوماتوسينسوري^{9 , 20}والماوس الكبار قشرة سوماتوسينسوري^6،21والكبار بارما الكئيب القشرة البصرية⁷.

هنا علينا تحديد الخطوات الأساسية للبروتوكول وتسطير أسفل السطر المعلمات الهامة التي يجب أن تسيطر على الدوام تحقيق تلوين الزنك عالية الجودة. واحد قد ترغب في تقييم التغيرات في مستويات الزنك متشابك في الأخرى كورتيسيس الحسية أو الحركية أو هياكل سوبكورتيكال في الحيوانات النموذجية الأخرى. المعلومات الكمية التي دينسيتوميتريكويوفر تحليل في هذا الأسلوب يمكن أن يكون مفيداً لبعد التنمية القشرية على مر الزمن وربما تكشف ملامح إنمائية مختلفة مستويات الزنك متشابك بين مناطق مختلفة من الدماغ (كما أننا أظهرنا سابقا¹⁷). ثمة اعتبار هام هو مسألة إنمائية والمقابلة لسن من الحيوانات لدراسة. يكشف عن المناطق القشرية البصرية يمكن تحديده بوضوح في فرت هيستوتشيميستري الزنك متشابك وتصلح دليلاً مفيداً في إجراء المزيد من الدراسات للمنظمة القشرية ووظيفة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euthasol (Euthanasia solution)	Henry Schein	710101
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	214485
Ketamine (Ketaved)	Henry Schein	48858	100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased)	Henry Schein	33198	100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Gum arabic	Sigma-Aldrich	G9752-500G
Citric acid	Sigma-Aldrich	C1909
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Hydroquinone	Sigma-Aldrich	H9003
Silver lactate	Sigma-Aldrich	85210
Fish gelatine	Sigma-Aldrich	G7765
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506	(Type III, from equine heart)
Catalse	Sigma-Aldrich	C10
Sucrose	Domino
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
100% Ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips	Brain Research Laboratories	#3660-1
Frosted unsubbed slides	Brain Research Laboratories	#3875-FR
Microtome	American Optical Company	860
Microscope	Olympus	BX-60
Adope Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images
ImageJ	Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/		For densometric measurements
Plastic tray	Any standard plastic tray may be used		to immerse slides in developer solution
Hot plate	Any standard hotplate may be used