Summary
我们描述了一个组织化学过程, 揭示特征的层流和区域锌染色模式在不同的脑区。锌染色模式可与其他解剖标记一起使用, 以可靠地区分发育中和成人大脑的层和区域。
Abstract
解剖和功能性脑组织和发展的特征, 需要准确识别不同的神经回路和未成熟和成人大脑的区域。在这里, 我们描述了一个锌组织化学染色程序, 揭示不同的染色模式之间的各层和脑区。其他人利用这一程序不仅揭示了含锌神经元的分布和大脑中的电路, 而且成功地描绘了几个物种的发育中和成年大脑的区域和层流边界。在这里, 我们说明这个染色程序与图像从开发和成人鼬脑。我们揭示了一个锌染色模式, 作为一个解剖标记的地区和层, 并可以可靠地用于区分视觉皮层区域的发展和成人视觉皮层。本议定书的主要目的是提出一种组织化学方法, 允许准确地识别发育中和成人大脑中其他方法无法做到的层和区域。其次, 结合密度图像分析, 这种方法可以评估突触锌的分布, 以揭示整个开发过程中的潜在变化。本协议详细描述了连续染色冰冻脑切片所需的试剂、工具和步骤。虽然这个协议被描述使用鼬脑组织, 它可以很容易地被适应用于啮齿目动物, 猫, 或猴子并且在其他脑子区域。
Introduction
组织学上的污点传统上被用来帮助鉴别不同物种的皮质区, 揭示不同的建筑特征。联合使用的组织化学技术, 如尼物质, 细胞色素氧化酶 (CO) 的反应性, 或髓鞘可以证明是卓有成效的, 因为他们揭示了类似的区域边界在成人的大脑。然而, 这些组织化学染色并不总能充分揭示未成熟大脑皮层区和层间的明显界限。
在中枢神经系统, 锌有几个关键的功能, 包括稳定 DNA 结构, 作为一个酶因子, 参与许多调节功能, 并作为一个调通过其存在的突触囊泡1. 突触锌是独一无二的, 因为它可以使用组织学方法进行可视化, 而蛋白质结合的锌则不能被形象化2。该功能已被用来揭示不同皮层区的突触锌模式, 并在许多研究中使用突触锌组织化学。大脑皮层中谷氨酸神经元的一个子集在其轴突末端的前泡内含有锌,3,4。组织化学研究揭示了脑皮层突触锌的异质分布5,6,7。在不同皮层区 (如, 视觉与体感皮层) 或层 (如如, 锌含量在 supragranular 和infragranular 层的初级视觉皮层大大高于丘脑输入层 IV 与相对较低的突触锌水平)5,8,9。在皮层中观察到的突触锌染色的异质性特别有利, 因为它能促进区域和层流的识别。
在这里, 我们提出了一个突触锌组织化学过程的详细描述, 这是一个修改版本的 Danscher 的1982方法10。该方法利用亚硒酸腹腔 (IP) 作为螯合剂。亚硒酸的移动到大脑, 以反应池的自由锌发现在囊泡的一个子集的谷氨酸突触在大脑中。这种反应产生的沉淀, 可以提高随后由银开发2,10,11。
这一过程揭示了突触锌染色的层流和区域模式;密度分析可用于评估这些模式的质量和数量在成人和未成熟的大脑, 以研究影响的其他干预, 如感官, 环境, 药理, 或基因的操纵。此外, 人们还可能希望评估其他模型系统中其他皮层或皮层下结构中的突触锌分布的潜在发展变化。密度分析提供的定量信息对后续的脑发育具有一定的优势。该协议提供了一个同伴的其他免疫和组织化学标记, 以揭示层流和区域边界。
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Protocol
以下协议遵循由纽约市城市学院机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 建立的动物保育指导方针, 该准则符合所有适当的州和联邦准则。麻醉适合于雪貂, 并应根据所研究的物种进行修改.
图 1: 流程图概述了本协议3阶段涉及的主要步骤以及完成每个步骤所需的时间. 要求部分完全干燥的期间显示在绿色文本圆圈中, 而所有其他步骤都在白色文本圆圈中。绿色菱形文本框是一个决策点, 而红色矩形是一个关键步骤, 应该格外小心地执行。 请单击此处查看此图的较大版本.
1. 准备步骤 (幻灯片单调和解决方案)
- 在热水中用洗涤剂清洗 unsubbed 的幻灯片, 然后在温水中冲洗几次, 然后用蒸馏水冲洗, 彻底清除污垢或碎屑。允许幻灯片在室温或 37 #176 的烤箱中干燥; C.
- 一旦幻灯片完全干燥, 每张幻灯片上都用手指或画笔将一层薄薄的蛋清均匀地涂上。允许干燥在烤箱在60和 #176; C 为 20-30 min。为了获得最佳效果, 并避免部分滑脱, 添加第二层蛋清, 并允许在60和 #176 的烤箱再干一次; C.
- 在100毫升和 #160 中溶解1克的明胶, 在热水 (60 和 #176; C) 中制备1% 明胶溶液, 使其冷却至室温.
- 准备 200 mL 开发人员解决方案, 如下所述, 供4节使用.
- 通过缓慢地将40克加到120毫升的热水中来准备阿拉伯树胶解决方案 (这种方法更容易溶解)。继续搅拌的解决方案与玻璃搅拌棒。一旦溶液完全溶解, 将其从热量中取出, 让它冷却几分钟, 然后在漏斗中通过 6-8 层纱布滤布.
- 在20毫升 dH 中加入5.04 克柠檬酸加4.7 克柠檬酸钠, 配制柠檬酸缓冲液 2 O 溶解混合物。确保本解决方案的 ph 值为 4.0, 在25和 #176; c. 在必要时通过在溶液中加入氢氧化钠或盐酸来调节 ph 值.
- 通过加热30毫升 dH 2 O 并溶解1.7 克氢醌来制备氢醌溶液.
注: 加热氢醌溶液对于使其在水中容易溶解很重要, 因为氢醌在室温下不易溶解于水中。注意保持水温低于 60 #176; C, 否则氢醌可能被氧化。如果解决方案变成黄色, 丢弃并准备另一个新的解决方案. - 在30毫升的 dH 中溶解0.22 克, 制备银乳酸溶液 2 O.
- 将解决方案 (1.4.1-1.4.4) 按它们在准备执行反应时所描述的顺序 (即, 切片、干燥和固定后) ( 图 2 ) 混合。最后加入乳酸银溶液。确保此步骤很快完成, 开发人员解决方案被放置在黑暗中, 直到它是反应的部分, 因为银乳酸是光敏.
图 2: 示意图中涉及的步骤序列在该协议的锌组织化学阶段混合试剂. 请单击此处查看此图的较大版本.
2. 动物治疗和麻醉
- 在镇静动物之前, 准备1% 亚硒酸钠 (Na 2 SeO 3 ) 解决方案, 在10毫升 dH 1 O 中溶解2毫克的亚硒酸钠。
- 麻醉肌肉注射氯胺酮 (25 毫克/千克) 和嗪 (2 毫克/千克) 的动物.
注意: 通过使用踏板反射反应, 确保达到适当的麻醉水平. - 注入锌合剂亚硒酸钠溶液 (15 毫克/千克) 腹腔 (IP).
注意: 亚硒酸钠在不同年龄或其他种类的毒性可能有所不同. - 允许60至90分钟的亚硒酸钠前往大脑。在此期间, 必须确保该动物是适当的镇静剂和没有反应, 所以检查深度的麻醉每5分钟.
- 在亚硒酸盐期间, 当动物被麻醉时, 确保眼睛关闭以防止干燥, 或管理眼部药膏以保持湿润.
3。组织准备和染色
- 通过管理戊巴比妥钠过量 (100 毫克/千克, i. p) 来安乐该动物.
- 用生理盐水进行 transcardial 灌注1分钟, 并与4% 甲醛20分钟, 最后, 管理一个解决方案与4% 甲醛和10% 蔗糖 (总固定期 1 h).
- 使用一对大剪刀移除磁头.
- 用手术刀从鼻子到颈部进行中线切口, 以露出颅骨.
- 小心地取出大脑, 用刀片将半球分开.
- 在0.1 米磷酸缓冲液 (PB) 中阻断大脑后部和4% 甲醛的后缀数小时.
- 将块放入30% 的蔗糖溶液中, 在0.1 米 PB 中, 并允许大脑下沉.
注: 在0.1 米 PB 中, 用30% 蔗糖溶液取代4% 甲醛和30% 蔗糖溶液, 使大脑的大脑和 #39; 甲醛的暴露, 这会影响组织染色质量. - 一旦大脑下沉, 切割 semi-tangential 40 和 #181; m 厚部分通过视觉皮层或区域的兴趣在冻结, 滑动切片或低温。这可以通过放置块与内侧表面下来, 并轻轻地拼合玻璃幻灯片.
- 用画笔收集剖面, 并将其存储在含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的钓具盒中.
- 将各节分隔为单独的编号系列。立即登上一个或两个系列的大脑部分的卵白色眼见幻灯片 (1 节), 允许干燥过夜在室温下, 和工艺部分 histochemically 突触锌.
注: 其他系列可以处理其他标记进行比较, 如髓鞘 12 或细胞色素氧化酶使用修改后的协议 13 : 孵育 2-8 h 在40和 #176; c 与3% 蔗糖, 0.015% 细胞色素 c,0.015% 过氧化氢酶, 0.02% diaminobenzidine 0.1 米 PB。尼物质也可被用作鉴别视觉皮层区域的组织学标记。这些其他组织学污点不要求大脑部分安装在蛋清眼见片上, 因此可以改用传统的明胶涂层的幻灯片.
4。突触锌组织化学
- 在绝对酒精中固定滑动段15分钟, 并允许在室温下完全干燥1小时. 我我简要地沉浸在十年代的1% 明胶溶液 (第1节), 并允许在室温下过夜干燥.
- 将这些解决方案混合在一起, 如步骤1.8 中所述, 一旦部分准备就绪, 将立即做出反应.
- 通过在玻璃或塑料托盘中并排排列幻灯片, 并将开发的解决方案倒在幻灯片上, 来响应各节。验证幻灯片是否完全淹没在解决方案中, 并将纸盒传输到暗空间, 或用光框覆盖.
注: 大约12英寸长8英寸宽的塑料托盘可以使用, 正好适合18张幻灯片。200 mL 开发人员解决方案的总容量足以完全淹没幻灯片, 因此请确保正确的音量用于幻灯片的数量, 并相应地调整食谱。使用塑料或玻璃托盘, 而不是使用金属托盘是可取的, 因为有一定程度的交叉反应之间的银乳酸的开发商解决方案和铁或其他金属发现金属托盘.
- 通过在玻璃或塑料托盘中并排排列幻灯片, 并将开发的解决方案倒在幻灯片上, 来响应各节。验证幻灯片是否完全淹没在解决方案中, 并将纸盒传输到暗空间, 或用光框覆盖.
- 通过直观地检查每30分钟的节来监视该反应的发展。这些部分一般需要 120-180 分钟的完整开发.
- 如果部分变为 overstained (请参见 图 3a ), 请在2% 农民和 #39; s 解决方案 (dh 中9份2% 硫代硫酸钠 2 o 和1部分2% 钾氰化钾在 dh 2 o) 中 1-2 min.
注意: 未着色的样本部分显示在 图 3b 中. - 达到所需强度后, 通过从纸盒中卸下幻灯片安装的部分并将幻灯片放在幻灯片机架上来终止反应.
- 将滑轨架放在一个大的玻璃染色盘中, 然后在温水 (40-50 和 #176; C) 中冲洗幻灯片10分钟以除去明胶涂层和外银沉积物.
注意: 小心不要搅动滑动架以防止部分滑落。当充分的层流变化是明显的, 并且区段是足够黑暗的, 但没有反应过度 (参见 图 4a ) 时, 期望的部分的强度达到. - 允许幻灯片在室温下干燥, 然后在100% 乙醇 (5 分钟) 内脱水, 在二甲苯 (5 分钟) 内清除, 并以安装介质覆盖滑块。或者, 将幻灯片放在上升的酒精系列中, 然后脱水、清除和片.
- 使用不含亚硒酸前处理的动物的切片作为阴性对照。这些部分的银放大不应产生染色.
注意: 为了获得最佳效果, 允许部分在一夜之间干燥。允许部分干燥过夜会产生更好的组织染色.
图 3: 幼鼬脑中的突触锌染色. 显微 semi-tangential overstained 和 b) understained 在幼年的雪貂脑中。由于缺乏层流变化, 区域边界难以辨别。白色物质也被严重污染。Ssy Suprasylvian 皮质, WM 白质, 前, D 背。缩放条 = 500 和 #181; m (a-b)。 请单击此处查看此图的较大版本.
5. 区分区域边界和图像获取
- 使用不同脑区的建筑特征进行平面和层流识别.
注: 例如, 在发育中的大鼠压皮层 14 中, 作者揭示了一种瞬态模块化的特点是锌的重染色, 这是不存在于成人, 但可以用来描述皮质在这个物种的发展过程中的组织。在另一项研究 15 中, 作者揭示了猕猴杏仁核中发现的不同核的突触锌分布的特异性, 这有助于鉴别这些分裂。在发育和成人鼬脑的视觉皮层区域以前被描述了 16 , 17 , 18 , 建筑中大脑皮层的细分灰松鼠被描述了 19 。此外, 锌的组织化学以前被用来区分成年猴视觉皮层的区域 8 , 发育和成年猫视觉皮层 5 , 发育中的大鼠体感皮层 9 , 20 和成年老鼠体感皮层 6 , 21 。如果可用, 比较髓磷脂染色, 细胞色素氧化酶 (CO) 染色, 和突触锌染脑切片, 以确认在成人的区域边界。在 semi-tangential 部分的雪貂视觉皮层染色的突触锌, 有明显的差异, 在视觉皮层区, 以促进区域识别。例如, 17 区和18的成人鼬揭示, 突触锌染色是高的层 I III 和 v 层的污渍不太强烈, 而第四层几乎缺乏锌。明显缺乏锌染色在 iv 层或区域17和18对比与黑暗地被发现的色带在 CO 被染色的部分。然而, 在 CO 染色的区域中, 17 的第四层保持了与 iii 和 V 层的尖锐边界, 但18区的第四层的特征是染色强度有细微的下降, 第三层中发现的上边界较不易区分. - 使用低功耗目标 (2X 或4X 放大倍数) 的明显微镜检查剖面, 并拍摄感兴趣的区域.
- 使用图像处理软件增强显微的对比度和亮度。光学密度测量所获得的图像不应以任何方式改变.
图 4: 成人雪貂脑中的突触锌染色区别不同的视觉皮层区域. 显微相邻的 semi-tangential 部分染色为 ( a ) 突触锌或 ( b ) 细胞色素氧化酶 (CO) 在成年。箭头标记区域边界。Ssy Suprasylvian 皮层, 前, D 背。标尺 = 500 和 #181; m. 请单击此处查看此图的较大版本.
6. 密度测定 (可选)
注意: Densitometric 分析可用于评估在感兴趣的区域内有代表性的锌染色切片的光学密度, 从而评价突触锌在大脑中的分布。这种方法也有助于跟踪整个开发过程中突触锌水平的潜在变化.
- 使用选定的锌染色切片, 随机选择适当宽度的皮质柱 (柱状显微) (450 和 #181; m 宽柱) 从所获得的感兴趣区域的显微。皮质柱是横跨所有皮层层从脑膜表面到白质的区域.
- 从每个感兴趣区域的几个不同的大脑部分中选择适当数量的样本列.
- 将具有代表性的列的示例图像传输到图像处理软件中.
- 使用矩形选择工具来包含整个皮质列.
- 使用反转工具创建与该列的负片类似的对比度反转图像.
注: 对高突触锌水平和低突触锌含量低的光学密度值, 图像进行对比反演, 以产生高的光学密度值。这是一种更直观的方式来呈现类似于 图 5 中所示的图形轮廓图. - 通过使用绘图剖面工具生成这些图像中的光学密度剖面图, 以便沿直线产生像素强度的 two-dimensional 图形.
- 使用绘图选项将绘图剖面图转换为垂直配置文件, 然后再次单击 "绘图" 配置文件.
注意: x 轴表示沿直线的距离, y-axis 表示像素强度。因此, 每个图块配置文件值都反映了跨列宽的每个深度的平均灰度值. - 将绘图配置文件值作为电子表格中的文本文件打开, 将其规范化并绘制为图形 (请参见 图 5 ).
注意: 最好使用突触锌的相对密度作为定量测量的比较结果, 由于不同的反应时间、组织的 stainability 以及其他变量. - 通过首先执行车厢平均的绘图剖面值来计算相对锌密度, 以平滑数据.
注意: 这是通过平均, 例如, 每连续20或30像素 (1 像素 = 2.5 和 #181; m) 的深度, 然后正常化, 以最大强度为每个样本。因此, 每个平均绘图剖面值反映的是该深度的平均灰度值 (灰度值范围从0到 255)。一种不同的归一化方法可用于首先获取样本区域的白质 (WM) 光学密度值, 其中包括感兴趣区域中的底层白质。理想情况下, 选择几个区域, 尽可能轻的染色, 获得一个平均 WM 值。平均光学密度值然后除以平均值 wm 值, 以获得 wm 正常化值. - 确定在感兴趣区域的特定层中的平均光学密度值以进行定量比较.
注: 例如, 雪貂视觉皮层区第四层的平均最小光学密度值是由包含最小染色区域的 #177; 5 像素. - 在雪貂的视觉皮层区域的 supragranular 和 infragranular 层中计算平均光学密度值, 由 #177 的最暗的区域组成; 5 像素以确定平均值的最大值.
- 确保平均光学密度值是从特定的层中获得的.
注意: 在对比反转图像中, 通过将它们与原显微以及相邻的 CO 剖面进行比较, 验证这些层的极限是非常必要的。这保证了一个不会侵入相邻的层.
图 5: 不同视觉皮层突触锌的层流分布区域在成人雪貂. 有代表性的显微的柱子通过所有皮层层与相应的规范化的光学密度剖面在成人。低突触锌密度在成人地区 IV 层17和18是由槽在剖面图中表示。在每个绘图剖面中, IV 层槽中的填充椭圆表示用于确定平均最小像素强度值的值。标尺 = 200 和 #181; m. 请单击此处查看此图的较大版本.
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Representative Results
在图 1的流程图中, 本协议中涉及的主要步骤是为突触锌的大脑切片着色。该协议可分为三阶段: 1) 灌注和组织收集, 2) 组织制备和染色, 3) 锌组化学。简单地, 在协议的第一阶段, 动物被麻醉并且注射了 IP 以适当的剂量亚硒酸钠。在一个充足的时间段 (理想情况下 60-90 min) 之后, 该动物随后被安乐死, 用 0.9% NaCl 溶液灌流, 然后是4% 甲醛溶液。头部被斩首, 大脑迅速从头骨中移除。然后, 大脑被允许下沉4% 甲醛加30% 蔗糖溶液作为剂。在该协议的第二阶段, 冰冻切片在40µm 的滑动切片上被切割成磷酸缓冲盐 (PBS), 并分成编号系列。在切片后立即将切片放在卵白色的眼见上是很重要的, 留下部分在夜间晾干以获得最佳效果。明胶眼见玻片不推荐为铬酸钾, 通常用于单调溶液 cross-reacts 与银乳酸, 从而导致次优染色。然后在绝对酒精中孵育15分钟, 在室温下完全干燥。这一步, 其次是在1% 明胶溶液提前准备的安装部分的短暂淹没, 并允许干燥过夜, 以最佳的结果。在协议的最后阶段 (锌组织化学) 中, 开发人员解决方案是根据 "方法" 部分中列出的步骤编写的, 而幻灯片放置在水溶液中的塑料或玻璃托盘中。该污点的发展通常需要在 2-3 小时之间, 但密切的目视检查是必要的, 以避免 overstaining 的部分。当达到适当强度时, 应将滑块移除, 放在滑动架上, 然后在温水中冲洗 5-10 分钟, 除去外银沉积物。这些部分可以在室温下干燥, 清除和 coverslipped。图 2显示了完成该协议的锌组织化学阶段所需具体步骤的示意图。
这项协议使用突触锌组织化学, 以揭示区域和层流变化的染色水平之间的视觉皮层区的鼬脑。这个协议可以适应其他物种以及其他大脑区域的使用。例如, 研究其他感官皮层的研究人员, 如雪貂或其他模型系统的体感、听觉或额叶皮质, 将极大地受益于使用这种组织化学染色。这项技术的主要优势是, 它提供了明确的区域之间的过渡, 以方便在成人的地区识别以及可靠地区分皮层地区的年轻动物, 如啮齿动物, 雪貂, 猫, 猴子。
图 3a显示了一个锌染色切片的示例, 我们无意间开发了太长时间, 因此在过程中 overstained。Overstained 组织的特点是一个非常暗褐色的颜色, 缺乏层流变化, 和大量染色的白色物质。然而, 锌染的大脑部分有时可以 understained, 如图 3b所示。Understained 部分有时会发生, 如果动物没有生存足够的时间 (至少60分钟), 这就排除了所有注射亚硒酸的旅行到大脑。如果亚硒酸的管理不当, 因此也可能发生组织 Understaining, 因此不会向大脑传播。
在图 4a中的一个具有代表性的 semi-tangential 部分中显示了成人鼬中多个视觉皮层区突触锌染色的异质分布。箭头指向区域边界。在17和18区, 突触锌的染色强度一般在 I、II、III、V 层中高, IV 层 (thalamorecipient 层) 低, 在层 VI. 中适中。在图 4a中, 17 和18区域之间存在明显的可识别转换。第四层18区染色强度略有增加, V 层减少, 强度变小。图 4b是染色细胞色素氧化酶 (CO) 的相邻部分, 它说明了与锌染色所观察到的区域边界的相似位置。地区的17和 18, 有高水平的锌通常似乎有较低的 CO 染色水平。
在19和21区, 突触锌的分布在定性上是相似的, 因为两个区域的层流变化比17和18区低。19和21区的第四层明显不同于17和18区的第四层, 因为它是适度染色的。19区的 supragranular 和 infragranular 层具有相似的强度, 但 V 层的染色略暗。21区有一个类似的突触锌分布, 在19区。然而, 21 区的第六层的特征是, 突触锌水平比19区第四层高。Suprasylvian (Ssy) 的层 VI 和 IV 表面上有中等程度的染色, 强度也相当, 而 V 层的特征是更大的突触锌水平, 而 supragranular 层则以突触锌水平的波动模式为标志。
在不同的脑区, 不同的治疗, 或不同的年龄, 对突触锌分布的定量评估是可以完成的, 如果需要的话。例如, 你可能想要评估成人的突触锌的分布变化, 或在任何模型系统中的初级视觉、听觉和体感皮质的发育过程。使用密度分析, 我们以前已经表明, 在发展的雪貂脑的多个视觉区域 (17, 18, 19, 21, 和 Suprasylvian) 的突触锌的分布, 从五到六周的年龄17显著下降。在这里, 我们描述的步骤, 以评估不同的分布的突触锌的代表性样本取自成人雪貂说明的过程。这些步骤可以跟踪在幼鼬视觉皮层以及其他任何物种或脑区的突触锌分布的变化。图 5显示了具有代表性的柱状显微, 从成人脑部进行锌组织化学处理, 以及它们的互补的归一化光学密度剖面图。根据皮层深度的变化, 生成了光学密度值的归一化图形。因此, 每个图的剖面值反映了在连续皮层深度的平均灰度值。例如, 区域17和18的特征是, 在 IV 层 (以槽为代表) 的锌染色明显下降, 这从他们的地块剖面可见一斑。17和18区的平均最小光学密度值由填写的黑色椭圆表示。在17和18区的第四层中观察到的低锌染色与19、21和 Ssy 区的锌含量只有细微的下降形成对照。集体地, 区域 19, 21 和 Ssy 是定性地不同于区域17和18由于锌水平在所有层数是更加同类的比在区域17和18。此外, 17 和18区的 supragranular 层和层 V 通常比层 VI. 更强烈地染色。
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Discussion
目前的研究采用了基于改进版本的 Danscher (1982) 方法10的组织化学技术, 据此可以在大脑中检测到突触锌的定位并进行可视化。这种方法基本上是通过注射合剂酸钠 (Na2SeO3) (15 毫克/千克) 的动物。在注射后, 亚硒酸向脑部移动, 并与游离锌结合, 前囊泡中含有锌的神经元。锌离子与突触囊泡内的分子结合沉淀, 并可通过物理发育2,11来进行可视化。原蒂姆·波顿的硫化银染色法的目的是检测和可视化的一些重金属, 如 Au, 银, 铂, 铁, 镉, 铜, 镍, 锌在生物组织22。这种方法所用的螯合剂是硫化钠。因此, 使用蒂姆·波顿的硫化物方法的一个主要问题是缺乏特异性, 因为任何能转化为金属硫化物的金属都可以通过物理发展而被银放大。然而, 在目前的研究中使用的 Danscher 方法的修改版是特定于锌和其他重金属。Danscher 的1982方法与本研究中所描述的方法有许多不同之处。Danscher 的方法使用新鲜的未固定的脑组织, 而我们用冰冻组织。Danscher 也使用戊二醛的灌注, 而我们使用甲醛, 因为这是更符合免疫组织化学和其他组织学标记, 我们经常在我们的实验室染色。Danscher 也使用 poststaining 的程序, 如甲苯胺蓝 (1%), 我们不执行我们的方法。
目前这种技术的一个局限性是, 动物对亚硒酸钠的耐受性是不可预知的。我们发现, 在管理亚硒酸钠后, 有时动物的存活时间超过30分钟。这种情况造成了一个问题, 因为它不允许足够的时间, 亚硒酸的旅行到大脑, 并随后发展的大脑部分通常导致不均匀的组织染色。另一个潜在的局限性是与正确管理腹腔注射亚硒酸钠有关。你应该拉上腹部上方的皮肤, 并插入针锥一侧的角度 15-20 度, 穿透只有腹壁。针应稍微向后拉, 以确保腹部器官没有被穿透, 材料没有被吸入。如果发生这种情况, 应将针头处理并更换。
为确保高质量的染色效果和重现性, 我们建议采取以下警示措施。适当管理亚硒酸钠到动物, 并最大限度地提高动物的生存时间 (60 至90分钟是最佳) 前安乐, 是至关重要的, 以确保足够的时间, 以亚硒酸的旅行到大脑。我们发现缩短生存期 (30 分钟或更短) 通常会导致组织染色不均匀。同样, 在切片后立即在卵白色眼见幻灯片上安装切片是一个关键的步骤。强烈建议不要在 PBS 中留下新鲜的冰冻切片, 因为锌离子会渗入溶液中。在开发人员解决方案的准备过程中, 确保柠檬酸盐缓冲器的 ph 值正确 (4.0) 是至关重要的, 因为这种反应对 ph 值的细微变化非常敏感。同样, 当加热的氢醌溶液是必须保持温度低于60° c, 进一步加热将氧化溶液和抑制污渍。类似地, 在明胶中短暂地淹没滑动安装的部分是至关重要的, 因为它可以防止部分表面上的银的非特异性沉积。然而, 节不应留在明胶溶液长于十年代, 因为这将导致他们萎缩导致不均匀的组织染色。建议在开发人员解决方案中对节进行周期性的目视检查, 因为离开这些部分太长可能导致 overstaining。这个污点是相当温度敏感, 因此部分倾向于发展更快, 当环境温度是温暖的, 并且更慢当温度是凉快的。最后, 你可能要轻轻地摇动幻灯片机架在温水冲洗步骤, 以方便去除的明胶和剩余的银沉积从幻灯片。然而, 过度和粗心的路段, 而用温水冲洗幻灯片, 可能会导致部分滑出幻灯片, 应避免。这也是至关重要的, 以确保适当的控制是用于密度测量, 以进行定量比较。一个人可能会使用一个轻度染色或染色区域作为内部控制。在我们的材料中, 我们使用白色物质作为一种控制, 在整个发育过程中, 在不同的视觉皮层区域规范光学密度值。我们发现, 在不同的年龄和成人17中, 白色物质的价值是可比较的。因此, 由于白质值不会随着年龄的变化而改变, 白物质作为密度分析的有效控制。
该方法的主要优点是, 它是一种简单而可靠的组织化学染色, 其分布可以与其他组织化学标记一样, 用于区分脑区。然而, 使用这种组织化学方法可能不适合研究某些细胞群体 (那些缺乏锌), 或在非常幼小的动物, 因为突触锌水平最初低在出生时显示在发育的小鼠体感和猫视觉皮层5 ,20。该协议的另一个优点是它可以与神经示踪剂注入实验结合使用。在我们的实验室里, 我们通常会向幼鼬的主要视觉皮层注入一个双向的神经元示踪剂, 以研究视觉皮层中多个区域之间的连接模式的发展变化。因此, 如果动物可以被利用来进行不同的实验研究, 动物就不需要单独用于锌的组织化学。所述方法的主要优点是它可以适应其他物种和其他脑区的使用。虽然我们已经证明了这种方法使用鼬脑组织, 可能有细微的差异, 在一些步骤时, 研究的脑组织从啮齿动物, 猫, 或猴子。其他人已经成功地使用这种锌组织化学方法来说明成人猴视觉皮层的染色模式的差异8, 发育和成年猫视觉皮层5, 发育中的大鼠体感皮层9,20, 成年老鼠体感皮层6,21, 和成人帕尔马袋鼠视觉皮层7。
在这里, 我们概述了协议的基本步骤, 并强调必须控制的重要参数, 以始终如一地实现高质量的锌染色。人们可能希望评估其他模型动物中其他感觉或运动神经皮层或皮层下结构中突触锌水平的变化。密度的定量信息分析提供这种方法可以有利于后续皮质发育随着时间的推移, 并可能揭示不同的发展概况的突触锌水平不同的大脑区域 (正如我们以前显示17)。一个重要的考虑是发展问题和相应的动物年龄的研究。突触锌组织化学揭示了雪貂中明显可见的皮层区, 并可作为进一步研究皮质的机构和功能的有用指南。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家研究资源中心 (2G12RR03060-26A1) 的赠款的支持;国立卫生研究院的少数群体健康和健康差异 (8G12MD007603-27);纽约市立大学专业工作人员代表大会和教职员研究津贴 (悬浮角速度陀螺仪 II) 美国沙迦大学。我们感谢维德雅瑟格 Sriramoju 向我们介绍这些方法。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
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