Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים

Published: October 29, 2017 doi: 10.3791/56547

Summary

אנו מתארים הליך פתולוגיה המגלה אבץ למינריות, אריאל האופיינית מכתים דפוסי באזורים שונים במוח. התבנית מכתים אבץ עשוי לשמש בשילוב עם סמנים אנטומיים אחרים להבחין בצורה אמינה שכבות של אזורים במוח המתפתח, למבוגרים.

Abstract

אפיון של הארגון האנטומי ופונקציונלי המוח ופיתוח דורש זיהוי מדויק של המעגלים העצביים ברורים אזורים במוח ילדותי. ולא למבוגרים. כאן נתאר אבץ פתולוגיה מכתימים הליך זה מגלה הבדלים בדפוסי מכתימים בין שכבות שונות ואזורי המוח. אחרים נעזרו הליך זה לא רק כדי לחשוף את ההתפלגות של נוירונים, מעגלים במוח המכילים אבץ, אלא גם על בהצלחה גבולות אמיתיות ולא למינריות במוח המתפתח, למבוגרים מספר מינים. כאן אנחנו להמחיש זאת מכתים הליך עם תמונות של פיתוח והמוח פארט למבוגרים. אנחנו חושפים תבנית מכתים אבץ משמש סמן האנטומי של אזורים ושכבות, יכול לשמש באופן אמין להבחנה חזותית באזורים קורטיקליים הראייה בקליפת המוח המתפתח, למבוגרים. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להציג שיטה פתולוגיה המאפשר זיהוי מדויק של שכבות, אזורים במוח המתפתח, למבוגרים בו שיטות אחרות לא תעשה. שנית, בשילוב עם ניתוח תמונות densitometric, שיטה זו מאפשרת לו להעריך את ההתפלגות של אבץ סינפטית לחשיפת פוטנציאל שינויים במהלך הפיתוח. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ריאגנטים, ' כלים ' השלבים הנחוצים להפיכת במרוכז כתם מוח קפוא מקטעים. למרות פרוטוקול זה מתואר באמצעות רקמת המוח חמוס, זה בקלות יכול להיות מותאם לשימוש מכרסמים, חתולים או קופים גם ואזורים נוספים במוח.

Introduction

כתמי היסטולוגית שימשו באופן מסורתי כדי לסייע בזיהוי אזורים קורטיקליים במינים שונים על ידי חשיפת ההבדלים בתכונות ארכיטקטוני. השימוש המשולב של פתולוגיה טכניקות כגון חומר Nissl, תגובתיות ציטוכרום אוקסידאז (CO) או המיאלין יכול להוכיח פורה כפי הם חושפים דומה גבולות המכסים איזורים במוח למבוגרים. עם זאת, הכתמים פתולוגיה האלה לא תמיד מספקת לחשוף גבולות ברורים בין אזורים קורטיקליים ושכבות במוח לא בוגר.

במערכת העצבים המרכזית, אבץ יש כמה תפקידים קריטיים הכוללים ייצוב מבנה ה-DNA, מתנהג כמו קופקטור האנזים, השתתפות פונקציות רגולטוריות רבות, מתנהג כמו המודל העצבי דרך נוכחותה הסינפטיות 1. אבץ סינפטית היא ייחודית כמו זה ניתן לאבחן באמצעות שיטות היסטולוגית, ואילו חלבון מכורך אבץ לא יכול להיות מטמיעים2. תכונה זו נוצלה כדי לחשוף את התבנית אבץ סינפטית אזורים קורטיקליים שונים, אבץ סינפטית להסטולוגיה שימש במספר מחקרים. תת-קבוצה של glutamatergic נוירונים בקליפת מכילים אבץ השלפוחיות המוגלתיות presynaptic בתוך3,שלהם מסופי האקסון4. לימודי מעבדה הומנית נחשפו התפלגות הטרוגנית של אבץ סינפטית קליפת המוח5,6,7. נראה שיש חלוקה אמיתיות ולא למינריות שונה של האבץ ריאקטיבי histochemically אזורים קורטיקליים שונים (למשל, חזותית לעומת קליפה המגע), או שכבות (למשל, רמות אבץ supragranular, שכבות infragranular של קליפת הראיה העיקרית הם התלמידות-גבוה בהרבה thalamocortical קלט שכבה IV עם רמות אבץ סינפטית נמוכה יחסית)5,8,9. הטרוגניות של אבץ סינפטית מכתים שנצפתה קליפת יש יתרון במיוחד הוא מקל זיהוי אמיתיות, אביזרים.

כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הליך פתולוגיה אבץ סינפטית, אשר יש את הגירסה של Danscher-1982-שיטה-10. שיטה זו משתמשת הסלנייט מוזרק intraperitoneally (IP) חיות כמו חומר מכלט. הסלנייט נוסע אל המוח כדי להגיב עם שלוליות חינם אבץ שנמצאו ב שלפוחית של קבוצת משנה של glutamatergic הסינפסות במוח. התגובה הזו מניבה התמיסה זה יכול להיות מוגברת לאחר מכן על ידי פיתוח כסף2,10,11.

הליך זה חושף למינריות אמיתיות דפוסי אבץ סינפטית מכתימה; ניתוח densitometric עשוי לשמש כדי להעריך הדפוסים הללו איכותית והן באופן כמותי במוח למבוגרים ולא בוגרת כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות אחרות, כגון מניפולציות חושית, איכות הסביבה, תרופתי או גנטית. יתר על כן, אחד מומלץ גם להעריך את פוטנציאל שינויים התפתחותיים בתחום ההפצה של אבץ סינפטית במבנים אחרים בקליפת המוח או subcortical במערכות אחרות מודל. המידע הכמותי המספק ניתוח densitometric בשיטה זו יכול להיות יתרון להתפתחות המוח הבאות לאורך זמן. פרוטוקול זה מספק חבר של אחרים חיסונית - וסמנים פתולוגיה כדי לחשוף את גבולות למינריות ולא אמיתיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול הבאים מנחים את טיפול בבעלי חיים נוסדה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב- מכללת ניו יורק, אשר לציית כל המדינה המתאימה והנחיות הפדרלי. הרדמה מתאים חמוסים, צריך להיות שונה לפי מינים למד.

Figure 1
איור 1: תרשים זרימה בהתוויית הצעדים העיקריים המעורבים ב-3 שלבים של הפרוטוקול ואת הזמן הדרוש להשלמת כל צעד. תקופות דרישת סעיפים להתייבש לגמרי מוצגים עיגולים ירוקים טקסט, בעוד כל צעדים אחרים נמצאים במעגלים טקסט לבן. תיבת הטקסט בצורת יהלום ירוק מהווה נקודת ההחלטה, ואילו המלבן האדום הוא שלב קריטי יש לבצע עם טיפול נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. פעולות הכנה (שקופית ממלא מקום, ביצוע פתרון)

  1. לרחוץ שקופיות unsubbed עם חומר ניקוי במים חמים ולשטוף מספר פעמים במים חמים ולאחר מכן עם שטיפה מים מזוקקים להסרת ביסודיות כל לכלוך או פסולת. לאפשר שקופיות לייבוש בטמפרטורת החדר או בתנור ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. ברגע המגלשות יבש לחלוטין, שכבה מעיל אפילו דקה של ביצה-לבן בכל שקופית בעזרת האצבעות או במכחול. אפשר לייבש בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. לקבלת תוצאות מיטביות, וכדי להימנע מקטעים מאובדן, להוסיף שכבה שנייה של חלבון ביצה ולאפשר להתייבש פעם נוספת בתנור ב-60 מעלות צלזיוס
  3. להכין פתרון ג'לטין 1% על ידי המסת 1 גרם של ג'לטין ב- 100 מ של מים חמים (60 ° C) ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
  4. להכין 200 מ של מפתח הפתרון כפי שמתואר להלן לשימוש בסעיף 4.
    1. הכן שסחרה פתרון על-ידי לאט הוספת 40 g במרווחים של 120 מ ל מים חמים (הוא מתמוסס בקלות רבה יותר בדרך זו). להמשיך לבחוש את הפתרון עם זכוכית זע רוד. ברגע הפתרון יש התפרקה לחלוטין, להסירו מהאש ולאפשר לו להתקרר למשך כמה דקות, ואז לסנן בין 6-8 שכבות של בד גזה משפך.
    2. מאגר
    3. ציטראט הכן על-ידי הוספת ציטראט נתרן חומצה ציטרית ועוד 4.7 g 5.04 g 20 מ ל dH 2 O את התערובת. ודא כי ה-pH של פתרון זה 4.0-25 ° C. התאם ה-pH במידת הצורך על-ידי הוספת סודיום הידרוקסיד או חומצה הידרוכלורית הפתרון.
    4. להכין את הפתרון הידרוקינון על ידי חימום 30 מ ל dH 2 O, המסת 1.7 g של הידרוקינון.
      הערה: מתחמם הפתרון הידרוקינון חיוני כדי לאפשר לו מתמוסס בקלות במים, הידרוקינון אינה ברצון נמסים במים בטמפרטורת החדר. יש להקפיד לשמור על הטמפרטורה של המים מתחת 60 ° C, אחרת עלולה להיות תחמוצת הידרוקינון. אם הפתרון לצהוב, למחוק ולהכין פתרון טרי אחר.
    5. הכנת כסף לקטט פתרון על ידי המסת 0.22 g ב- 30 מ של dH 2 O.
    6. לערבב את הפתרונות (1.4.1 - 1.4.4) לפי הסדר שבו הם מתוארים כשאתה מוכן לבצע את התגובות (דהיינו, לאחר חלוקתה, ייבוש, ולתקן) ( איור 2). הוסף את הפתרון לקטט כסף בסוף. להבטיח כי צעד זה הושלם במהירות, הפתרון מפתח מושם בחושך עד שהגיע הזמן להגיב הסעיפים כפי לקטט כסף רגישה לאור.

Figure 2
איור 2: מפרטים טכניים, הממחישות את רצף השלבים המעורבים ערבוב של ריאגנטים בשלב להסטולוגיה אבץ של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. הרדמה וטיפול חיה

  1. לפני לסמם את החיה, להכין פתרון הסלנייט (נה 2 SeO 3) 1% נתרן על ידי המסת 10 מ ג של סודיום סלניט 1 מ"ל dH 2 O.
  2. עזים ומתנגד החיה עם זריקה תוך שרירית של קטאמין (25 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (2 מ ג/ק ג).
    הערה: ודא כי רמה מתאימה של הרדמה מושגת באמצעות תגובת רפלקס פדלים.
  3. הכנס אבץ chelator סודיום סלניט פתרון (15 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally (IP).
    הערה: הרעילות של סודיום סלניט בגילאים שונים או מינים אחרים יכול להשתנות.
  4. אפשר 60 עד 90 דקות עבור הנתרן הסלנייט לנסוע אל המוח. במהלך תקופה זו, זה הכרחי כדי להבטיח כי החיה מורדמת כראוי והוא לא מגיב, אז בדוק את עומק ההרדמה כל 5 דק
  5. במהלך תקופת סלניט, בעוד החיה. הוא מורדם, להבטיח כי לעצום העיניים למניעת יובש, או לנהל אופטלמולוגיות משחה כדי לשמור על לחות.

3. רקמות והכנה Staining

  1. להרדימו על ידי מתן מנת יתר של סודיום פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג, מקומות).
  2. זלוף transcardial בצע עם תמיסת מלח רגיל עבור 1 דקות, ועם 4% paraformaldehyde עבור 20 דק. לבסוף, לנהל פתרון עם 4% paraformaldehyde ו 10% סוכרוז (תקופה קיבוע מוחלט של 1 h).
  3. להסיר את הראש באמצעות זוג מספריים גדולים.
  4. עושים חתך קו האמצע באמצעות אזמל של האף בצוואר כדי לחשוף את הגולגולת.
  5. בזהירות להסיר את המוח ולהפריד את ההמיספרות עם להב-
  6. לחסום את החלק האחורי של המוח, postfix ב 4% paraformaldehyde במאגר פוספט 0.1 M (PB) במשך כמה שעות.
  7. מקום הבלוקים לתוך 30% סוכרוז פתרון ב 0.1 M PB ולאפשר המוח לשקוע.
    הערה: החלפת 4% paraformaldehyde 30% סוכרוז הפתרון, עם 30% סוכרוז הפתרון ב 0.1 M PB לשקוע המוח מגביל את המוח ' s חשיפה paraformaldehyde כמו זה יכול להשפיע על רקמות מכתים איכות.
  8. פעם המוח כיורים, לחתוך חצי וצורניים מיקרומטר 40 מקטעים עבה דרך קליפת הראייה או אזור עניין על הקפאה, הזזה מיקרוטום או cryostat. זה יכול להתבצע על ידי הצבת הרחוב עם המדיאלי פני השטח למטה, השיטוח בעדינות עם זכוכית-
  9. לאסוף במקטעים עם מכחול, בחנות קופסת הכלים המכיל באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
  10. להפריד בין החלקים לתוך סדרה ממוספרת בנפרד. מיד הר אחד או שתי סדרות של המוח מקטעים בשקופיות מחלבונים לספסל (סעיף 1), מאפשרים לינה יבש בטמפרטורת החדר, ולעבד מקטעים histochemically עבור אבץ סינפטית.
    הערה: סדרות אחרות עשויים להיות מעובד עבור סמנים אחרים לשם השוואה, כגון המיאלין 12 או אוקסידאז ציטוכרום באמצעות פרוטוקול ששונה 13: תקופת דגירה של 2-8 h ב 40 מעלות צלזיוס עם 3% סוכרוז, 0.015% ציטוכרום C, קטלאז 0.015%, diaminobenzidine 0.02% ב PB 0.1 M. Nissl חומר עשוי גם לשמש כסמן היסטולוגית להבחנה חזותית אזורים קורטיקליים. אלה כתמים היסטולוגית אחרים אינם מחייבים כי חלקים במוח הם רכובים בשקופיות לספסל מחלבונים, אז השקופיות ג'לטין מסורתי מצופה ניתן להשתמש במקום זאת.

4. להסטולוגיה אבץ סינפטית

  1. לתקן מקטעים שקופית רכוב המוחלט אלכוהול למשך 15 דקות, אפשר להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר במשך ה 1
  2. < lאני > בקצרה לטבול מקטעים עבור 10 s בפתרון ג'לטין 1% (סעיף 1) וגם תאפשר לילה יבש בטמפרטורת החדר.
    הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות מאפשר מקטעים כדי לילה יבש. מאפשר מקטעים לילה יבש על התשואות צביעת רקמות טוב יותר.
  3. מערבבים את הפתרונות יחד כפי שמתואר בשלב 1.8 ברגע מקטעים מוכנים להיות הגיבו.
    1. להגיב הסעיפים על ידי הסדרת השקופיות לצד בכוס, או מגש פלסטיק, לשפוך את הפתרון המתפתח על השקופיות. לוודא כי שקופיות הם שקועים לחלוטין הפתרון ולא להעביר את המגש לתוך חלל חשוך, או לכסות עם תיבת אור חזק-
      הערה: מגש פלסטיק זה כ 12 אינצ'ים ארוך על ידי 8 אינץ ' רחב יכול לשמש, מה שמתאים בדיוק 18 שקופיות. הנפח הכולל של 200 מ ל מפתחת פתרון מספיקה לגמרי להטביע את השקופיות, אז ודא כי אמצעי האחסון הנכון משמש עבור מספר השקופיות כדי להיות הגיבו ולהתאים את המתכון בהתאם. השימוש מגש פלסטיק או זכוכית לעומת שימוש מגש מתכת מומלץ יש מידה מסוימת של צלב תגובתיות בין של לקטט כסף בפתרון מפתח הברזל או מתכות השני מגשי מתכת שנמצא ב-
  4. לפקח על התפתחות התגובה על-ידי בדיקה חזותית של הסעיפים כל 30 דקות. הסעיפים דורשים בדרך כלל 120-180 דקות להתפתחות מלאה.
  5. אם המקטעים יהפכו overstained (ראה איור 3 א), להבדיל אצל 2% חקלאי ' s פתרון (9 חלקים 2% נתרן תיוסולפט dH 2 O ו- 1 חלק 2% אשלגן Ferricyanide dH 2 O) עבור 1-2 דקות
    הערה: סעיף מדגם זה יהיה מוכתם לקוי מוצג באיור 3b.
  6. פעם העוצמה הרצויה מושגת, לסיים את התגובה על ידי הסרת את השקופית רכוב מקטעים של המגש והצבת השקופיות על מתלה שקופיות.
  7. למקם את המדף שקופית בכוס גדולה להכתים את המנה, לשטוף את השקופיות חמים (40-50 ° C) זורמים במשך 10 דקות להסיר את המעיל הג'לטין ואת ההפקדה כסף החיצוני.
    הערה: יש להיזהר לא להתסיס המדף שקופית כדי למנוע מקטעים מאובדן. העוצמה הרצויה של המקטע מושגת כאשר מספיק וריאציה למינריות מתבטא מקטעים מספיק חשוך אבל לא הגבתי (ראה איור 4a).
  8. לאפשר את השקופיות יבש בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מייבשים 100% EtOH (5 דקות), ברור של קסילן (5 דקות), כיסוי להחליק עם מדיום הרכבה. לחלופין, למקם את השקופיות סדרות בסדר עולה של אלכוהול, ואז מייבשים, נקי, coverslip.
  9. שימוש בסעיפים מחיות ללא טיפול הסלנייט הקודם כדי לשמש פקד שלילי. כסף הגברה של סעיפים אלה אמור להניב לא מכתים.

Figure 3
איור 3: אבץ סינפטית מכתים במוח פארט לנוער- Photomicrographs למחצה וצורניים שהוכתמו אבץ בסעיפים א). overstained, ב) understained במוח פארט לנוער. גבולות אמיתיות הן קשה להבחין כמו וריאציה למינריות לוקה בחסר. חומר לבן גם בכבדות מוכתם. Ssy Suprasylvian cortex, WM לבן משנה, קדמי, D הגבי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (-b). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. הבחנה גבולות אמיתיות ורכישת תמונות

  1. שימוש בתכונות ארכיטקטוני של אזורי מוח שונים לזיהוי אמיתיות ולא למינריות.
    הערה: לדוגמה, פיתוח עכברוש retrosplenial cortex 14, המחברים חשף מודולריות ארעי המאופיינת על ידי צביעת כבד עבור אבץ, אשר לא קיים אצל אדם בוגר, אבל יכול להיות מנוצל כדי לתאר קורטיקלית ארגון במהלך הפיתוח של מין זה. מחקר אחר 15, המחברים חשף ירידה לפרטים בהפצה אבץ סינפטית של גרעינים שונים נמצאו באמיגדלה קוף מקוק, המספקות זיהוי של החטיבות. אזורים קורטיקליים חזותי במוח פארט המתפתח ומבוגרים כבר 17 , שתואר לעיל 16 , 18, חלוקה ארכיטקטוני של קליפת ב הסנאי האפור היו שתואר 19. יתר על כן, שבעבר שימשה להסטולוגיה אבץ להבחין בין אזורים קוף למבוגרים קליפת 8, בפיתוח של מבוגר החתול קליפת 5, פיתוח קליפה המגע עכברוש 9 , 20, העכבר למבוגרים קליפה המגע 6 , 21. אם הוא זמין, להשוות את דפוס ההגדלה של המיאלין צבעונית, ציטוכרום אוקסידאז (CO) צבעונית, ואבץ סינפטית צבעונית מקטעים המוח, כדי לאשר את גבולות אמיתיות אצל אדם בוגר. בסעיפים למחצה וקולו של חמוס קליפת מוכתם אבץ סינפטית, ישנם הבדלים בולטים בין אזורים קורטיקליים חזותי המאפשרים זיהוי אמיתיות. לדוגמה, אזורים 17 ו-18 שחמוס למבוגרים חושפים כי אבץ סינפטית מכתים הוא גבוה ב שכבות I-III, (פ') שכבה VI כתמי פחות בעוצמה, בעוד שכבה IV כמעט חסר אבץ. בולט חוסר אבץ צביעת שכבה IV או אזורים 17 ו-18 ניגודים כשהרצועה ויטראז'ים בקדרות למצוא שכבה ש-IV ב- CO צבעונית מקטעים. עם זאת, שכבה IV באזור 17 ב CO סעיפים מוכתמים שומרת על גבול חד עם שכבות III ו- V, אבל שכבה IV באזור 18 מאופיין על ידי ירידה עדין מכתים בעוצמה, הגבול העליון שלה נמצאו בשכבה השלישי הוא פחות ניתן להבחנה.
  2. לבחון למקטעים באמצעות מיקרוסקופ brightfield עם מטרה צריכת חשמל נמוכה (2 X או 4 X הגדלה) ולצלם תחומי עניין-
  3. שפר את החדות והבהירות של photomicrographs באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. תמונות שהושג עבור מדידות צפיפות אופטית לא צריך להשתנות בצורה כלשהי.

Figure 4
איור 4: אבץ סינפטית מכתים במוח חמוס בוגר מבדיל אזורים שונים בקליפת המוח החזותי. Photomicrographs של חלקים למחצה וצורניים סמוכים מוכתם () סינפטית אבץ או (b) ציטוכרום אוקסידאז (CO) אצל אדם בוגר. החצים מסמנים גבולות אמיתיות. Ssy Suprasylvian cortex, קדמי, D הגבי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

6-Densitometry (אופציונלי)

הערה: Densitometric ניתוח עשוי לשמש כדי להעריך את ההתפלגות של אבץ סינפטיים במוח על ידי מדידת צפיפות אופטית של אבץ נציג צבעונית מקטעים באזורי עניין. שיטה זו שימושית גם עבור מעקב אחר שינויים פוטנציאליים רמות אבץ סינפטית במהלך פיתוח.

  1. שימוש שנבחרו שהוכתמו אבץ מקטעים, בחר באופן אקראי קורטיקלית (טורי photomicrographs) של רוחב המתאימה (עמודה רחב מיקרומטר 450 יכול לשמש) רכשה photomicrographs של האזור בעל עניין. עמודה קורטיקלית הוא אזור המתפרסות על-פני כל השכבות בקליפת המוח מפני השטח pial בחומר הלבן.
  2. לבחור מספר מתאים של עמודות מדגם בכמה סעיפים מוח שונים בכל אזור עניין.
  3. להעביר תמונות לדוגמה של עמודות נציג לתוך תמונה בתוכנת עיבוד.
  4. השתמש בכלי בחירה מלבנית כדי להקיף את העמודה כולה קליפתי.
  5. להשתמש בכלי ' היפוך ' כדי ליצור תמונת ניגודיות הפוך הדומה תשליל של צילום של העמודה.
    הערה: היפוך החדות של התמונות מתבצעת להניב צפיפות אופטית גבוהה עבור רמות אבץ סינפטית גבוה וערכי נמוך צפיפות אופטית עבור רמות נמוכות של אבץ סינפטית. זוהי דרך אינטואיטיבית יותר לעיבוד מגרש פרופיל גרפים זהים לאלו ראה באיור 5.
  6. לייצר צפיפות אופטית פרופילים מתמונות אלה באמצעות הכלי פרופיל מגרש כדי ליצור גרף דו מימדי של עוצמות פיקסל לאורך קו-
  7. השתמש באפשרויות מגרש כדי להמיר את הגרף פרופיל מגרש פרופיל אנכי ולחץ על מגרש פרופיל פעם יותר.
    הערה: המרחק מייצג ציר ה-x לאורך הקו, ציר ה-y מייצג את עוצמת פיקסל. לכן, כל ערך פרופיל מגרש משקף את הערך הממוצע סולם אפור בעומק כל לרוחב העמודה.
  8. מגרש פתוח פרופיל כקבצי טקסט בגיליון האלקטרוני, לנרמל, וערכים מגרש כמו גרפים (ראה איור 5).
    הערה: מומלץ להשתמש צפיפותה היחסית של אבץ סינפטית להשוואה של מדידות כמותיים תוצאות יכול להיות מבולבל על ידי וריאציה בעוצמתם מכתימים הכוללת כתוצאה זמני תגובה שונה, ההכתמה של רקמות, כמו גם את השני משתנים.
  9. לחשב צפיפות אבץ היחסי על-ידי ממוצע לקרון של הערכים פרופיל מגרש כדי להחליק את הנתונים לבצע תחילה.
    הערה: פעולה זו מושגת באמצעות חישוב ממוצע, לדוגמה, כל הפיקסלים רצופים של 20 או 30 (1 פיקסל = 2.5 מיקרומטר) עומק, נרמול אז אל העוצמה המקסימלית עבור כל דגימה. לכן, כל ערך פרופיל מגרש הממוצע משקף את הערך הממוצע סולם אפור בעומק זה (סולם אפור טווח ערכים מ- 0 עד 255). שיטה לנרמול שונים עשויים לשמש הראשון ערכי צפיפות אופטית רכישת חומר לבן (WM) מאזורים מדגם הכוללים בחומר הלבן שמתחת את תחומי עניין. באופן אידיאלי, לבחור מספר אזורים מוכתמים קלילה ככל האפשר כדי לקבל ממוצע WM ערך. צפיפות אופטית ממוצע הערכים מחולקים ואז בערכים WM מתכוון להשיג ערכי WM מנורמל.
  10. לקבוע כלומר ערכים צפיפות אופטית בשכבות ספציפיות של אזורים מעניינים להשוואות כמותיות.
    הערה: לדוגמה, הערך רשע צפיפות אופטית מינימלית בשכבת הרביעי של אזורים קורטיקליים חזותי של שחמוס נקבעים על-ידי המקיף את האזור המוכתם לפחות על ±5 פיקסלים-
  11. חישוב צפיפות אופטית רשע ערכים הרבדים supragranular ו- infragranular של אזורים קורטיקליים חזותי של שחמוס מאת המקיף את האזור המוכתם האפלים ביותר על ±5 פיקסלים כדי לקבוע את הערך המרבי רשע.
  12. ודא זה אומר ערכי צפיפות אופטית התקבלו בתוך שכבות מסוים.
    הערה: זה הכרחי כדי לאמת את גבולות הגוף האנושי של תמונות חדות הפוכה על-ידי השוואתם את photomicrographs המקורי, כמו גם הסעיף CO סמוכים. זה מבטיח כי אחד לא להפריע בשכבות סמוכות.

Figure 5
איור 5: למינריות הפצה של אבץ סינפטית חזותיים שונים בקליפת המוח באזורים בוגרים שחמוס. Photomicrographs נציג של עמודות דרך כל השכבות קורטיקלית עם פרופילים המתאימים מנורמל צפיפות אופטית של אדם מבוגר. צפיפות נמוכה אבץ סינפטית בשכבה הרביעי של אזורים למבוגרים 17 ו-18 מציינים את השוקת בעלילה פרופיל. בפרופיל בכל מגרש, אליפסות מלא בשוקת של שכבה IV מציינים הערכים בהם משתמשים כדי לקבוע את הערך בעוצמה של הפיקסל המזעריות הממוצע. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצעדים העיקריים המעורבים פרוטוקול זה כתם המוח מקטעים עבור אבץ סינפטית מוצגים בתרשים זרימה באיור1. הפרוטוקול יכול להיות מחולק לשלושה שלבים: 1) זלוף, אוסף רקמה, הכנה 2) רקמת מכתים ואני להסטולוגיה 3) אבץ. בקצרה, במהלך השלב הראשון של הפרוטוקול, החיה הוא מורדם, הזריקו המינון המתאים של סודיום סלניט IP. אחרי מספיק זמן תקופה (אידיאלי 60-90 דקות), החיה היא לאחר מכן מורדמים, perfused עם 0.9% NaCl פתרון ואחריו פתרון paraformaldehyde 4%. הוא ערף את הראש, המוח יוסר במהירות הגולגולת. המוח מותר ואז לשקוע paraformaldehyde 4% בתוספת 30% סוכרוז פתרון cryoprotectant. בשלב השני של הפרוטוקול, סעיפים קפוא על מיקרוטום הזזה-40 µm לחתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), הפרדתו סדרות ממוספרות. חשוב לעלות קטעים בשקופיות לספסל מחלבונים מיד לאחר חלוקתה, משאיר מקטעים לילה יבש לקבלת תוצאות אופטימליות. ג'לטין לספסל שקופיות לא מומלצים כמו כרום אשלגן גופרתי המשמש בדרך כלל הפתרון subbing cross-reacts עם לקטט כסף, ובכך מוביל שיוצרת מכתים. סעיפים ואז מודגרת למשך 15 דקות המוחלט אלכוהול, נותר יבש לחלוטין בטמפרטורת החדר. שלב זה ואחריו של צלילה קצרה של הסעיפים נטען בפתרון ג'לטין 1% שהוכנו מבעוד מועד, להתייבש במשך הלילה לקבלת תוצאות אופטימליות. בשלב האחרון של הפרוטוקול (להסטולוגיה אבץ), הפתרון מפתח מוכן בהתאם לשלבים המפורטים בסעיף שיטות ולאחר השקופיות ממוקמים מגש פלסטיק או זכוכית שקועים הפתרון. התפתחות הכתם בדרך כלל לוקח מקום בין 2-3 h, אבל בדיקה ויזואלית קרוב יש צורך להימנע overstaining את הסעיפים. כאשר העוצמה המתאימה מושגת, שקופיות צריך הסיר, מניחים על מתלה שקופיות, לשטוף במים חמים למשך 5-10 דקות להסיר את הפיקדון כסף החיצוני. ואז ניתן לייבש את המקטעים בטמפרטורת החדר, מנוקה, coverslipped. תיאור סכמטי של הצעדים הספציפיים הדרושים להשלמת השלב להסטולוגיה אבץ של הפרוטוקול מוצג באיור2.

פרוטוקול זה משתמש להסטולוגיה אבץ סינפטית לחשוף אמיתיות ולא למינריות וריאציה ברמות מכתימים בין אזורים קורטיקליים החזותי במוח חמוס. פרוטוקול זה ניתן להתאים לשימוש במינים אחרים, כמו גם ואזורים נוספים במוח. לדוגמה, החוקרים ללמוד נוספים cortices חושי כמו קליפת המגע, שמיעתי או פרונטלי שחמוס או בכל מערכת אחרת דגם ירוויחו באופן משמעותי באמצעות הכתם הזה פתולוגיה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ברור מעברים בין אזורים כדי להקל על זיהוי אמיתיות אצל מבוגרים, כמו גם אמינה להבדיל בין אזורים קורטיקליים בבעלי חיים צעירים כגון מכרסמים, חמוסים, חתולים, קופים.

איור 3a מראה דוגמה אבץ מוכתם סעיף זה פיתחנו עבור בשוגג. יותר מדי זמן ובכך היה overstained בתהליך. רקמת overstained מאופיין בצבע חום כהה מאוד, חוסר למינריות וריאציה, והמוכתמות בכבדות חומר לבן. עם זאת, לפעמים יכול להיות understained מקטעים שהוכתמו אבץ במוח כפי שמוצג באיור 3b. קטעים understained יכול להתרחש לפעמים אם החיה לא שרד עבור כמות מספקת של זמן (לפחות 60 דקות), שמונע את כל הסלנייט מוזרקים על נסיעה אל המוח. Understaining של רקמת עלול להתרחש גם אם הסלנייט לא היה מנוהל כראוי, ולכן לא לנסוע אל המוח.

התפלגות הטרוגנית של אבץ סינפטית מכתים באזורים מרובים חזותי קורטיקלית חמוס בוגר מוצג במקטע למחצה וצורניים נציג ב איור 4a. החצים הצבע גבולות אמיתיות. באזורים 17 ו-18, עוצמת ההגדלה של אבץ סינפטית הוא בדרך כלל גבוה שכבות, השני, השלישי, החמישי, נמוך ב שכבה IV (שכבה thalamorecipient), ואני בינוני ב שכבה VI. הנוכחות של מעבר בבירור בין אזורים 17 ו- 18 מתבטא, איור 4a. שכבה IV בעוצמה מכתימים באזור 18 מגדיל מעט, שכבה V מקטין והוא בעוצמה משתנה. איור 4b הוא מקטע הסמוך מוכתם ציטוכרום אוקסידאז (CO) הממחיש את המיקומים דומה של גבולות אמיתיות לאלו שהבחנו עם הכתם אבץ. אזורים של אזורים 17 ו-18 בעלי רמות גבוהות של אבץ בדרך כלל מופיעים יש רמות נמוכות של CO מכתים.

ההתפלגות של אבץ סינפטית באזורים 19 ו-21 דומה איכותית בזה בשני התחומים יש וריאציה למינריות פחות מאשר באזורים 17 ו-18. שכבה IV של אזורים 19 ו- 21 הוא בבירור שונה שכבה IV באזורים 17 ו-18 כי זה יהיה מוכתם במתינות. שכבות supragranular ו- infragranular של אזור 19 בעוצמה דומה, אך שכבה V כתמים כהים במקצת. אזור 21 יש התפלגות אבץ סינפטית דומה לזה באזור 19. עם זאת, שכבה VI של אזור 21 מאופיין על ידי רמות אבץ סינפטית גדול יותר מאשר שכבה IV של אזור 19. שכבות השישי, הרביעי של Suprasylvian (Ssy) מופיעים כדי להיות צבעונית למדי, הם בעוצמה דומה, בעוד שכבה V מאופיין על ידי רמות אבץ סינפטית ועל הרבדים supragranular מסומנים באמצעות דפוס המשתנות של רמות אבץ סינפטית.

הערכה כמותית של ההתפלגות של אבץ סינפטית באזורי מוח שונים, עם טיפולים שונים, או בגילאים שונים, ניתן להשיג, אם כל כך השתוקקה. למשל, אחד רצוי להעריך שינויים בתחום ההפצה של אבץ סינפטית אצל מבוגרים או במהלך התפתחות אצל ראשי חזותי, שמיעתי, ואת המגע cortices בכל מערכת מודל. באמצעות ניתוח densitometric, אנחנו בעבר הראו כי ההתפלגות של אבץ סינפטית בתחומים חזותיים רבים (17, 18, 19, 21, ו Suprasylvian) של המוח המתפתח חמוס, ירידה משמעותית מ-5 עד 6 שבועות של גיל17. כאן נתאר את הצעדים הדרושים כדי להעריך את ההבדלים בהפצה של אבץ סינפטית נציג הדגימות שנלקחו על חמוס בוגר כדי להמחיש את התהליך. שלבים אלה ניתן בעקבות לעקוב אחר שינויים בתחום ההפצה של אבץ סינפטית פארט לנוער קליפת הראייה גם כל ואזורים נוספים מינים או המוח. איור 5 מראה photomicrographs טורי נציג ממקטעים המוח למבוגרים מעובד עבור להסטולוגיה אבץ יחד עם פרופילי מגרש שלהם משלימים צפיפות אופטית מנורמל. מגרשים המנורמל של ערכי צפיפות אופטית נוצרו כדי לשקף את השינויים על פי עומק קורטיקלית. לפיכך, כל ערך פרופיל מגרש משקף הערך הממוצע סולם אפור בעומק קורטיקלית רצופים. למשל, אזורי 17 ו-18 מאופיינים על ידי ירידה ניכרת אבץ צביעת שכבה הרביעי (המיוצגים על ידי השוקת), אשר מתבטא מפרופילים מגרש שלהם. זאת אומרת ערכי מינימום צפיפות אופטית באזורים 17 ו-18 מסומנים באמצעות שמילאו אליפסות שחור. אבץ נמוך מכתים שנצפה בשכבה הרביעי של אזורים 17 ו-18 ניגודים עם היחידה טבילה עדינה אבץ רמות באזורים 19, 21, ו Ssy. באופן קולקטיבי, אזורים 19, 21 Ssy הן שונה מאשר אזורים 17 ו- 18 רמות אבץ לאורך כל השכבות היא הומוגנית מאשר באזורים 17 ו-18. יתר על כן, ' supragranular שכבות ' שכבה V של אזורים 17 ו-18 בדרך כלל כתם יותר חזק מאשר שכבה VI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המחקר הנוכחי מעסיקה פתולוגיה טכניקה המבוססת על גירסה שונה של Danscher (1982) שיטת10, לפיו אבץ סינפטית לוקליזציה ייתכן ועוזרת דמיינו במוח. שיטה זו פועלת בעיקר באמצעות הזרקת החיה עם הסלנייט נתרן chelator אבץ (נה2SeO3) (15 מ"ג/ק"ג). בעקבות זריקה, סלנייט נוסע אל המוח ומאגד אבץ חינם זה הוא מקומי כדי presynaptic שלפוחית של אבץ המכיל נוירונים. אבץ יונים מאוגדים מולקולות בתוך התמיסה הסינפטיות, ניתן לאבחן לאחר מכן דרך התפתחות גופנית2,11. גופריתי כסף של טים המקורית מכתים השיטה נועדה לזהות והמחש מספר של מתכות כבדות כגון Au, Ag, Pt, Fe, תקליטור, Cu, ני ו- Zn רקמה ביולוגית22. מכלט לשימוש בשיטה זו הוא סודיום. לכן, בעיה רצינית עם שיטת גופריתי של טים הוא העדר ירידה לפרטים כמו כל מתכת יכול להיהפך ל גופריתי מתכת אכן יכול להיות כסף מוגבר על ידי התפתחות גופנית. עם זאת, הגירסה של שיטת Danscher המשמש במחקר הנוכחי הוא ספציפי אבץ, אין מתכות כבדות אחרות. ישנם מספר הבדלים בין שיטת 1982 של Danscher לבין השיטה הנוכחית שאנו מתארים במחקר זה. השיטה של Danscher משתמשת רקמת המוח מבולבל טריים בזמן שאנחנו נשתמש רקמות קפוא. Danscher משתמש גם גלוטראלדהיד עבור זלוף, בעוד אנו משתמשים paraformaldehyde כמו זה תואם יותר עם immunohistochemical וסמנים היסטולוגית אחרים שאנחנו באופן שגרתי כתם במעבדה שלנו. Danscher משתמש גם poststaining במחטים טולדין כחול (1%), אשר אנחנו לא לבצע בשיטה שלנו.

מגבלה אחת של הטכניקה הנוכחית היא החריפו המשויכים סודיום סלניט סובלנות על-ידי בעלי-חיים. אנו מוצאים כי לאחר ניהול של סודיום סלניט, לפעמים בעלי חיים אינם שורדים זמן רב יותר כשעתיים וחצי. מצב זה מהווה בעיה כפי אינו מאפשר מספיק זמן הסלנייט לנסוע אל המוח, עוקבות התפתחות המוח מקטעים בדרך כלל מוביל צביעת רקמות לא אחידה. הגבלה פוטנציאלית נוספת קשורה הזרקה בקרום הבטן של סודיום סלניט למינהל התקין. אחד צריך למשוך את העור מעל חלל הבטן התחתונה, הכנס את צד שיקוע את המחט למעלה בזווית של 15-20 מעלות, חודר רק לקיר הבטן. המחט צריך להיות נסוג מעט כדי להבטיח אברי הבטן לא חדרו חומר לא aspirated. המחט צריך להיות מסולק והחליף אם מצב זה מתרחש.

כדי להבטיח תוצאות מכתימים באיכות גבוהה הפארמצבטית, אנו ממליצים על הצעדים הבאים מתרה. המינהל התקין של סודיום סלניט הזמן הישרדות בעלי חיים, ועל הגדלת של החיה (60 עד 90 דקות הוא אופטימלי) לפני המתות חסד, הם קריטיים כדי להבטיח מספיק זמן ניתנת על הסלנייט לנסוע אל המוח. מצאנו את תקופות הישרדות קצר יותר (30 דקות או פחות) בדרך כלל להוביל צביעת רקמות לא אחידה. באופן דומה, הרכבה סעיפים על גבי מחלבונים לספסל שקופיות מיד לאחר חלוקתה הרחוב הוא שלב קריטי. עוזב טריות לחתוך קטעים קפוא ב- PBS במשך מספר ימים בחריפות נגד כיוון שלעתים אבץ יונים ליץ לתוך פתרון. במהלך הכנת הפתרון מפתח, חיוני להבטיח שהמאגר ציטראט הוא של ה-pH נכונה (4.0) כמו התגובה הזו הוא מאוד רגיש לשינויים קטנים ב- pH. באופן דומה, כאשר חימום הפתרון הידרוקינון זה הכרחי כדי לשמור על הטמפרטורה מתחת 60 ° C, כמו חימום נוסף נישחק הפתרון ומעכבות את הכתם. בדומה, השוקע בקצרה בסעיפים רכוב שקופית ג'לטין הוא ביקורתי זה מונע שאינם ספציפיים הפקדת כסף על פני השטח של המקטע. עם זאת, חלקים לא אמורים להישאר בפתרון ג'לטין יותר מ 10 s כמו זה תגרום להם תצטמק? המובילים לא אחיד רקמות מכתים. תקופתיים בדיקה ויזואלית של הסעיפים תוך כדי פיתוח פתרון מומלץ מאז שעזבנו את שהסעיפים במשך זמן רב מדי יכול להוביל overstaining. הכתם הזה הוא די רגיש, הטמפרטורה כך סעיפים נוטים לפתח מהר יותר כאשר טמפרטורת הסביבה של חם לאט יותר כאשר הטמפרטורה הוא קריר יותר. לבסוף, שרוצים בעדינות לנער את השקופיות בארון שקופיות במהלך השלב השטיפה במים חמים כדי להקל על הסרת הג'לטין ואת שיורי הפקדת כסף מהשקופיות. עם זאת, עצבנות מוגזמת ורשלני של מקטעים בזמן השטיפה שקופיות עם מים חמים יכול לגרום מקטעים כדי להחליק את השקופיות לסירוגין להימנע. חשוב גם כדי להבטיח שפקד תקין משמש מדידות densitometric לערוך השוואות כמותית. אחד יכול להיעזר אזור בקלילות מוכתם או אינו מכתים כמו בקרה פנימית. בחומר שלנו, אנו משתמשים חומר לבן כפקד לנרמל את ערכי צפיפות אופטית באזורים קורטיקליים שונים חזותי במהלך הפיתוח. אנו מוצאים כי חומר לבן ערכים דומים ברחבי בגילאים שונים, ה-17למבוגרים. לכן, בהתחשב בכך חומר לבן ערכים אינם משתנים כפונקציה של גיל, חומר לבן משמש פקד חוקי עבור ניתוח densitometric.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי זה כתם פתולוגיה פשוטה ואמינה ותפוצתם יכול לשמש, כמו סמנים אחרים פתולוגיה, כדי להבחין בין אזורי המוח. עם זאת, השימוש בשיטה זו פתולוגיה בהכרח מתאים ללמוד מסוימים אוכלוסיות תאים (אלה חסר אבץ), או בבעלי חיים צעירים מאוד אבץ סינפטית רמות נמוכות בתחילה בלידה כפי שמוצג בפיתוח בעכבר המגע קליפת החתול5 ,20. יתרון נוסף של פרוטוקול זה היא כי ניתן להשתמש בשילוב עם מעקב neuroanatomical הזרקת ניסויים. במעבדה שלנו, אנחנו בדרך כלל להחדיר מכשיר מעקב עצביים דו-כיווני לתוך קליפת הראיה העיקרית של חמוסים לנוער ללמוד שינויים התפתחותיים התבנית קישוריות בין אזורים מרובים בקליפת הראיה. לכן, חיות צריך ולא אך ורק לשמש להסטולוגיה אבץ אם ניתן לנצל את החיות עבור מחקר ניסיוני שונים. היתרון העיקרי של השיטה המתוארת היא כי זה עשוי להיות מותאם לשימוש בחיות אחרות, באזורים אחרים במוח. למרות שאנחנו הדגימו שיטה זו באמצעות רקמת המוח חמוס, ייתכנו הבדלים עדינים בחלק מהשלבים כשלומדים על רקמת המוח מפני מכרסמים, חתולים או קופים. אחרים השתמשו בהצלחה שיטה פתולוגיה זו אבץ כדי להמחיש את הבדלי מכתים דפוס קוף למבוגרים קליפת8, בפיתוח של מבוגר החתול קליפת5, פיתוח החולדה קליפה המגע9 , 20, העכבר למבוגרים קליפה המגע6,21, ו למבוגרים פארמה וולבי קליפת7.

כאן אנחנו חלוקה לרמות את השלבים הבסיסיים של הפרמטרים החשובים פרוטוקול ומקף תחתון חייבים להיות מבוקרים כדי להגיע באופן עקבי באיכות גבוהה אבץ מכתים. מומלץ להעריך שינויים רמות אבץ סינפטית אחרים תחושתיות או cortices או מבנים subcortical בחיות מודל אחרים. כך densitometric כמותייםnalysis מספק בזה שיטה יכול להיות יתרון עבור בעקבות פיתוח בקליפת המוח לאורך זמן יתכן חושפניים פרופילים התפתחותיים שונים של רמות אבץ סינפטיים בין אזורים שונים במוח (כפי בעבר הראינו17). שיקול חשוב הוא השאלה התפתחותית לגיל המתאים בעלי חיים כדי ללמוד. להסטולוגיה אבץ סינפטית מגלה בבירור אזורים קורטיקליים חזותי חמוסים, עשוי לשרת כמדריך שימושי במחקרים נוספים של הארגון בקליפת המוח ותפקוד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך על ידי מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (2G12RR03060-26A1); המכון הלאומי על מיעוט בריאות פערים בשרותי בריאות (8G12MD007603-27) מ המכונים הלאומיים לבריאות; צוות מקצועי הקונגרס-סיטי יוניברסיטי בניו-יורק (PSC-הנטר); ומחקר בפקולטה גרנט (FRG II) האוניברסיטה האמריקאית של שארג'ה. אנו מודים Vidyasagar Sriramoju על שהכרת בינינו לשיטות אלו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).

Tags

נוירואנטומיה לנוירוביולוגיה גיליון 128 קליפת המוח striate בקליפת המוח סמן אנטומיים שיטת ההגדלה וריאציה למינריות
השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Khalil, R., Levitt, J. B. Use ofMore

Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter