Summary
Vi beskriver en histochemical prosedyre som avslører karakteristiske laminær og areal sink flekker mønstre i forskjellige hjernen regioner. Sink flekker mønsteret kan brukes sammen med andre anatomiske markører pålitelig skille lag og regioner i hjernen utvikle og voksne.
Abstract
Karakteristikk av anatomiske og funksjonelle hjernen organisering og utvikling krever nøyaktig identifikasjon av forskjellige nevrale kretser og regioner i hjernen umodne og voksne. Her beskriver vi en sink histochemical flekker prosedyre som avslører forskjeller i flekker bruksmønstre blant ulike lag og områder av hjernen. Andre har utnyttet denne prosedyren ikke bare å avsløre fordelingen av sink inneholder nevroner og kretser i hjernen, men også å avgrense vellykket areal og laminær grenser i utvikling og voksen hjernen i flere arter. Her vi illustrerer dette flekker prosedyre med bilder fra utviklingsland og voksen oppspore hjerner. Vi avslører et sink flekker mønster som fungerer som en anatomisk markør for områder og lag og pålitelig kan brukes til å skille visuelle kortikale områder i utvikling og voksen hjernebarken. Hovedmålet med denne protokollen er å presentere en histochemical metode som gir nøyaktig identifikasjon av lag og områder i utvikling og voksen hjernen hvor andre metoder ikke gjør det. Sekundært, i forbindelse med densitometric bildeanalyser gjør denne metoden det mulig å vurdere fordelingen av synaptic sink å avdekke mulige endringer i utvikling. Denne protokollen beskriver i detalj reagenser, verktøy og trinn nødvendig suksessivt stain frosne hjernen deler. Selv om denne protokollen er beskrevet ved hjelp oppspore hjernevev, kan det lett tilpasses for bruk i Red, katter, eller aper så vel som i andre områder av hjernen.
Introduction
Histologiske flekker har tradisjonelt blitt brukt å hjelpe med identifikasjonen av kortikale områder i ulike arter av avslørende forskjeller i arkitektoniske funksjoner. Kombinert bruk av histochemical teknikker som Nissl substans, cytochrome oxidase (CO) reaktivitet eller myelin kan bevise fruktbart som avslører de lignende areal grenser i voksen hjernen. Men avslører disse histochemical flekk alltid tilstrekkelig ikke klare grenser mellom kortikale områder og lag i umodne hjernen.
I det sentrale nervesystemet har sink flere viktige funksjoner inkluderer stabilisere DNA struktur, fungerer som et enzym kofaktor, deltar i tallrike regulatoriske funksjoner, og fungerer som en neuromodulator gjennom sin tilstedeværelse i synaptic blemmer 1. synaptic sink er unik som den kan visualiseres ved hjelp av histologiske metoder, mens protein-bundet sink ikke kan bli visualisert2. Denne funksjonen har blitt utnyttet for å avsløre synaptic sink mønsteret i kortikale regioner og synaptic sink histochemistry har vært brukt i en rekke studier. Et delsett av glutamatergic nerveceller i hjernebarken inneholder sink i presynaptic blemmer i deres axon terminaler3,4. Histochemical undersøkelser avdekket en heterogen fordeling av synaptic sink i hjernebarken5,6,7. Det synes å være en annen areal og laminær fordeling av histochemically reaktive sink i kortikale regioner (f.eksvisuelle versus somatosensory cortex) eller lag (f.ekssink nivåer i supragranular og infragranular lag av primære hjernebarken er betydelig høyere enn i thalamocortical input lag IV med relativt lav synaptic sink nivåer)5,8,9. Heterogenitet i synaptic sink flekker observert i cortex er spesielt fordelaktige som det muliggjør areal og laminær identifikasjon.
Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av en synaptic sink histochemical prosedyre, som er en modifisert versjon av Danscher's 1982 metoden10. Denne metoden bruker selenitt injisert intraperitoneally (IP) til dyr som chelaterande agent. Selenitt reiser til hjernen reagerer med bassenger med gratis sink finnes i blemmer av et delsett av glutamatergic synapser i hjernen. Dette gir en føre som kan forbedres senere av sølv utvikling2,10,11.
Denne prosedyren avslører laminær og areal mønstre av synaptic sink flekker; densitometric analyse kan brukes til å vurdere disse mønstrene både kvalitativt og kvantitativt i voksen og umodne hjernen å studere virkningene av andre tiltak, som sensoriske, miljø, farmakologiske eller genetisk manipulasjoner. Videre kan en også ønsker å vurdere potensielle utviklingsmessige endringer i fordelingen av synaptic sink i andre kortikale eller subkortikal strukturer i andre modellsystemer. Kvantitativ informasjon densitometric analysen gir i denne metoden kan være fordelaktig for følgende hjernens utvikling over tid. Denne protokollen gir en følgesvenn til andre negative og histochemical indikatorer for å vise grenselinjer laminær og areal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
følgende protokollen følger dyr pleie-retningslinjene som er fastlagt av dyr institusjon og bruk Committee (IACUC) på The City College of New York, som svarer til alle egnet statlige og føderale retningslinjer. Anestesi passer for oppspore og bør endres etter arten studerte.
figur 1: flytskjema som viser hovedtrinnene involvert i 3 faser av denne protokollen og tiden det tar å fullføre hvert trinn. Perioder krever å tørke vises med grønn tekst sirkler, mens alle andre tiltak er i hvit tekst sirkler. Den grønne diamant-formet tekstboksen er et vedtak punkt, mens den røde rektangelet er en avgjørende skritt og bør utføres med ekstra omsorg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. forberedende trinn (Skyv undertekstingsbehov og løsning å gjøre)
- vask unsubbed lysbilder med vaskemiddel i varmt vann og skyll flere ganger i varmt vann med en destillert vann skyll grundig fjerne skitt eller rusk. Tillate lysbilder tørke ved romtemperatur eller i en ovn på 37 ° C.
- Når lysbilder er helt tørr, laget en tynn selv strøk av egg-hvit på hvert lysbilde finger eller en pensel. La tørke i ovnen på 60 ° C i 20-30 min. For optimale resultater og å unngå deler glir av, legge til en andre strøk av eggehvite og la tørke igjen i ovnen på 60 ° C.
- Utarbeide en 1% gelatin løsning ved å løse opp 1 gram gelatin i 100 mL varmt vann (60 ° C) og la den avkjøles til romtemperatur.
- Forberede 200 mL utvikler løsning som beskrevet nedenfor for bruk i Seksjon 4.
- Forberede tannkjøtt arabisk løsning av sakte legger 40 g i intervaller til 120 mL varmt vann (det oppløses lettere denne måten). Fortsett å røre løsningen med et glass røring stang. Når løsningen har fullstendig oppløst, fjernes fra varmen og la den avkjøles i noen minutter, og deretter filtrere gjennom 6-8 lag med gasbind klut i en trakt.
- Forberede citrate buffer ved å legge ca 5,04 g sitronsyre pluss 4.7 g natriumsitrat i 20 mL dH 2 O og oppløsning blandingen. Kontroller at pH i denne løsningen er 4.0 på 25 ° C. justere pH eventuelt legge til natriumhydroksid eller saltsyre løsningen.
- Forberede hydrokinon løsningen ved oppvarming 30 mL dH 2 O og oppløsning 1,7 g av hydrokinon.
Merk: Varme opp hydrokinon løsningen er viktig å tillate den å oppløse lett i vann som hydrokinon ikke er lett dissolvable i vann ved romtemperatur. Pass på å holde temperaturen på vannet under 60 ° C, ellers hydrokinon kan oksideres. Hvis løsningen blir gule, kaste og forberede en annen frisk løsning. - Forbered sølv laktat løsning av oppløsende 0.22 g i 30 mL av dH 2 O.
- Blande løsninger (1.4.1 - 1.4.4) i rekkefølgen som de er beskrevet når klar til å utføre reaksjonene (dvs. etter skjæring, tørking og fikse) ( figur 2). Legg sølv laktat løsningen på slutten. Sikre at dette trinnet er fullført raskt og utvikler løsningen er plassert i mørket før det er tid til å reagere delene som sølv laktat er lysfølsomme.
figur 2: skjematisk illustrere rekkefølgen på trinnene involvert i blande reagenser i sink histochemistry fasen av protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. dyr behandling og Anesthesia
- før sedating dyret, utarbeide en 1% natrium selenitt (Na 2 SeO 3) løsning ved å løse opp 10 mg av natrium selenitt i 1 mL dH 2 O.
- Bedøve dyret med en intramuskulær injeksjon av ketamin (25 mg/kg) og xylazine (2 mg/kg).
Merk: Kontroller at et passende nivå av anestesi oppnås ved hjelp av pedal refleks svaret. - Injisere sink chelator natrium selenitt løsning (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
Merk: Toksisitet av natrium selenitt på ulike aldersgrupper eller i andre arter kan variere. - Tillat 60 til 90 min for natrium selenitt reise til hjernen. I denne perioden, er det viktig å sikre at dyret er skikkelig bedøvet og ikke svarer, så sjekk dybden av anestesi hver 5 min.
- i selenitt perioden, mens dyret er anesthetized, sikre at øynene er lukket for å unngå tørrhet, eller administrere ophthalmica salve for å holde dem fuktige.
3. Vev forberedelse og Beising
- Euthanize dyr ved å tilsette en overdose av natrium pentobarbital (100 mg/kg, i.p).
- Utføre transcardial perfusjon med vanlig saltvann for 1 min, og med 4% paraformaldehyde i 20 min. endelig administrere en løsning med 4% paraformaldehyde og 10% sukrose (en total fiksering periode på 1 h).
- Fjerne hodet med en stor hagesaks.
- Gjør en midtlinjen snitt ved hjelp av en skalpell fra nesen til halsen for å avsløre skallen.
- Nøye fjerne hjernen og skille halvkuler med blad.
- Blokkerer den bakre delen av hjernen og postfix i 4% paraformaldehyde inne 0.1 M fosfatbuffer (PB) i flere timer.
- Plasserer blokker i en 30% sukrose løsning i 0.1 M PB og at hjernen til å synke.
Merk: Erstatte 4% paraformaldehyde og 30% sukrose løsningen med 30% sucrose løsning i 0.1 M PB å synke hjernen begrenser hjernen ' s avsøring å paraformaldehyde som dette kan påvirke vev flekker kvalitet. - En gang hjernen vasker, kuttet semi tangentiell 40 µm tykke snitt gjennom hjernebarken eller områder av interesse på en frysing, glidende mikrotom eller kryostaten. Dette kan oppnås ved å plassere i blokk med medialt overflaten ned og forsiktig sammenslåing med et glass lysbilde.
- Samle deler med pensel og butikk i et takle-boks som inneholder fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Skille delene i egen nummererte serien. Umiddelbart montere en eller to rekke hjernen deler på egg-hvit subbed lysbilder (del 1), la det tørre over natten i romtemperatur, og behandle deler histochemically for synaptic sink.
Merk: Andre serier kan behandles for andre markører for sammenligning, som myelin 12 eller cytochrome oxidase bruker endret protokollen 13: ruge for 2-8 h på 40 ° C med 3% sukrose, 0.015% Cytochrome C, 0.015% catalase og 0.02% diaminobenzidine i 0.1 M PB. Nissl stoff kan også brukes som en histologiske markør for å skille visuelle kortikale områder. Disse andre histologiske flekker krever ikke at hjernen delene er montert på egg-hvit subbed lysbilder, slik tradisjonelle gelatin belagt lysbildene kan brukes i stedet.
4. Synaptiske sink Histochemistry
- fikse lysbilde montert seksjoner i absolutt alkohol i 15 min og la tørke helt ved romtemperatur for 1 h. < ljeg > kort fordype seksjoner for 10 s i en 1% gelatin løsning (del 1) og tørre over natten i romtemperatur.
- Blandes løsninger som beskrevet i trinn 1.8 når delene er klar til å bli reagerte.
- Reagere delene ved å ordne lysbildene side ved side i et glass eller plast brett og helle utvikle løsningen på lysbildene. Kontroller at lysbildene er helt neddykket i løsningen og overføre skuffen i et mørkt rom, eller dekke med en lys stramt.
Merk: En plast brett som er omtrent 12 inches lang av 8 tommer bredt kan brukes som passer nøyaktig 18 lysbilder. Et totalt volum på 200 mL utvikler løsning er nok å absolutt dykke lysbildene, så sikre at riktig volum brukes for antall lysbilder å være reagerte og justere oppskriften tilsvarende. Bruk av plast eller glass skuff i motsetning til benytter en metallbrettet er tilrådelig som det er en viss cross reaktivitet mellom den sølv laktat i utvikler løsningen og jern eller andre metaller i metall skuffer.
- Reagere delene ved å ordne lysbildene side ved side i et glass eller plast brett og helle utvikle løsningen på lysbildene. Kontroller at lysbildene er helt neddykket i løsningen og overføre skuffen i et mørkt rom, eller dekke med en lys stramt.
- Overvåke utviklingen av reaksjonen av visuelt inspisere delene hver 30 min. Delene krever vanligvis 120-180 min for komplett utvikling.
- Hvis delene blir overstained (se figur 3a), differensiere i 2% bonde ' s løsning (9 deler 2% natrium tiosulfat i dH 2 O og 1 del 2% kalium Ferricyanide i dH 2 O) i 1-2 min.
Merk: Utvalg delen er dårlig farget vises i figur 3b. - Når ønsket intensitet er oppnådd, avslutte reaksjonen ved å fjerne lysbildet montert seksjoner fra skuffen og plassere lysbildene på en objektglasstativet.
- Plasserer objektglasstativet i et stort glass flekker retten og vaske lysbildene i varm (40-50 ° C) rennende vann i 10 min å fjerne gelatin frakken og ytre sølv innskudd.
Merk: Vær forsiktig med å agitere objektglasstativet for å hindre deler sklir av. Ønsket intensitet i delen oppnås når tilstrekkelig laminær variasjon er tydelig og delene er mørkt nok men ikke overreagert (se figur 4a). - Tillate lysbildene tørke i romtemperatur, og deretter tørke i 100% EtOH (5 min), klart i xylen (5 min) og cover slip med et montering medium. Alternativt, plassere lysbildene i en stigende serie med alkohol, så tørke, klart og dekkglassvæske.
- Bruke deler fra dyr uten tidligere selenitt behandling å tjene som en negativ kontroll. Sølv forsterkning av disse delene skal gi ingen flekker.
Merk: For optimale resultater tillater å tørre over natten. Tillater å tørr overnatting gir bedre vev farging.
Figur 3: Synaptic sink flekker i juvenile oppspore hjernen. Photomicrographs semi tangentiell sink-farget deler som en) overstained og b) understained i juvenile oppspore hjernen. Areal grenser er vanskelig å skjelne som laminær variant mangler. Hvit substans er også sterkt farget. Ssy Suprasylvian cortex, WM hvit rolle, en fremre, D dorsal. Skala bar = 500 µm (a-b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. skille Areal grenser og bilde
- Bruk arkitektoniske funksjoner forskjellige hjernen regioner for areal og laminær identifikasjon.
Merk: For eksempel i den utvikle rotte retrosplenial cortex 14, forfatterne avslørte en forbigående modularitet preget av tunge flekker for sink, som finnes ikke i voksen, men kan benyttes for å beskrive kortikale organisasjon under utviklingen i denne arten. I en annen studie 15 avslørte forfatterne spesifisitet i synaptic sink fordelingen av forskjellige kjerner i macaque monkey amygdala, som letter identifikasjon av disse divisjoner. Visuelle kortikale områder i utvikling og voksen oppspore hjernen blitt beskrevet tidligere 16 , 17 , 18, arkitektoniske underinndeling av neocortex i det grå ekornet ble beskrevet 19. Videre ble sink histochemistry tidligere brukt til å skille mellom områder i voksen monkey hjernebarken 8, utvikle og voksen katt hjernebarken 5, utvikle rotte somatosensory cortex 9 , 20 og voksen mus somatosensory cortex 6 , 21. Hvis tilgjengelig, kan du sammenligne flekker mønsteret i myelin beiset, cytochrome oxidase (CO) farget og synaptic sink farget hjernen deler, for å bekrefte areal grenser i voksen. I semi tangentiell deler av oppspore hjernebarken farget for synaptic sink, finnes det fremtredende forskjeller visuelle kortikale områder som letter areal identifikasjon. For eksempel avslører 17 og 18 av det voksne oppspore at synaptic sink flekker er høy i lag I-III og V. lag VI flekker mindre intenst, mens lag IV nesten mangler sink. Iøynefallende mangelen på sink farging i lag IV eller områder 17 og 18 kontraster med mørkt farget bandet funnet i lag IV i CO farget deler. Men lag IV av 17 i CO farget deler opprettholder en skarp kant med lag III og V, men lag IV i området 18 er preget av en subtil nedgang i flekker intensitet og øvre grensen funnet i layer III er mindre skjelnes. - Undersøke deler brightfield mikroskopi med en lav makt-målsetting (2 X eller 4 X forstørrelse) og fotografere interesseområder.
- Forbedre kontrasten og lysstyrken i photomicrographs bruke bildebehandling. Bildene oppnådd for optisk densitet mål ikke bør endres på noen måte.
Figur 4: Synaptic sink flekker i voksen oppspore hjernen skiller ulike visuelle kortikale områder. Photomicrographs av tilstøtende semi tangentiell deler farget for (en) synaptic sink eller (b) cytochrome oxidase (CO) i voksen. Piler merke areal grenser. Ssy Suprasylvian-cortex, anterior, D dorsal. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Densitometry (valgfritt)
Merk: Densitometric analyse kan brukes til å anslå fordelingen av synaptic sink i hjernen ved å måle optisk densitet representant sink farget deler i områder av interesse. Denne metoden er også nyttig for å spore mulige endringer i synaptic sink nivåer gjennom utvikling.
- Bruke valgt sink-farget deler, velger tilfeldig kortikale kolonner (kolonne photomicrographs) med riktig bredde (en 450 µm bred kolonne kan brukes) ervervet photomicrographs i regionen rundt. En kortikale kolonne er et område som dekker alle kortikale lag fra pial overflaten til hvit saken.
- Velge et passende antall utvalg kolonner fra flere forskjellige hjernen seksjoner i hver region av interesse.
- Overføre Bildeeksempler representant kolonner i en bildebehandling.
- Bruker rektangulære markeringsverktøyet til å omfatte hele kortikale kolonnen.
- Bruke Inverter verktøyet for å opprette en kontrast snudd bilde ligner et fotografisk negativ av kolonnen.
Merk: Kontrast inversjon av bildene utføres for å gi høy optisk densitet for høy synaptic sink nivåer og lav optisk densitet for lav synaptic sink nivåer. Dette er en mer intuitiv måte å gjengi tomten profil grafer ligner på de som ses i figur 5. - Produsere optisk densitet profiler fra bildene ved hjelp av verktøyet tomt profil for å generere en todimensjonal grafikk med pixel intensiteten på en linje.
- Bruke plott alternativer å konvertere tomten profil grafen til en vertikal profil og klikk på tomten profil når flere.
Merk: X-aksen representerer avstanden langs linjen og y-aksen representerer pixel intensiteten. Derfor hver tomt profil verdi gjenspeiler gjennomsnittet gråtoner verdien på hver dybde over bredden på kolonnen. - Åpen tomten profil som tekstfiler i regneark normalisere og plot som grafer (se figur 5).
Merk: Det anbefales å bruke synaptic sink relativ tetthet for sammenligning av kvantitative mål som resultatene kan bli tilbakevist av variant total flekker intensitet som følge av ulike reaksjonstid, stainability vev, i tillegg til andre variabler. - Beregne relative sink tetthet ved først å utføre en boxcar gjennomsnittet av tomten profil verdiene å glatte dataene.
Merk: Dette oppnås ved gjennomsnitt, for eksempel hver etterfølgende 20 eller 30 piksler (1 bildepunkt = 2,5 µm) i dybden, og deretter normalisere til maksimal intensitet for hvert utvalg. Derfor gjenspeiler hver gjennomsnittlig tomten profil verdi gjennomsnittet gråtoner verdien på den dybden (gråtoner verdier varierer fra 0 til 255). En annen normalisering metode kan brukes av første overtakende hvit substans (WM) optisk densitet fra prøven regioner som inkluderer de underliggende hvit substans i områder av interesse. Ideelt sett, velge flere regioner er så lett farget som mulig å få en gjennomsnittlig WM verdi. Gjennomsnittlig optisk densitet er deretter delt betyr WM verdier å få WM normaliserte verdier. - Bestem mener optisk densitet i bestemte lag av regioner av interesse for kvantitative sammenligninger.
Merk: For eksempel bety minimum optisk densitet verdien i lag IV av visuelle kortikale områder av oppspore bestemmes av omfatter minst farget regionen ±5 piksler. - Beregn mener optisk densitet verdier i supragranular og infragranular lag av visuelle kortikale områder av oppspore av omfatter mørkeste farget regionen ±5 piksler å bestemme maksimal middelverdien.
- Sikrer det optisk densitet hentes fra innenfor bestemte lag.
Merk: Det er viktig å kontrollere grensene for disse lagene i kontrast invertert bilder ved å sammenligne dem med de opprinnelige photomicrographs samt den tilstøtende CO-delen. Dette garanterer at en ikke koble på tilstøtende lag.
figur 5: laminær distribusjon av synaptic sink i forskjellige visual kortikale områder i det voksne oppspore. Representant photomicrographs kolonner gjennom alle kortikale lag med tilsvarende normalisert optisk densitet profiler i en voksen. Lav synaptic sink tetthet i layer IV av voksen 17 og 18 angis av bunnen i profil plottet. I hver tomt profil indikerer fylt ovaler i bunnen av lag IV verdiene brukes til å bestemme intensiteten gjennomsnittlig minste piksel. Skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De viktigste trinnene involvert i denne protokollen stain hjernen seksjoner for synaptic sink presenteres i et flytskjema i figur 1. Protokollen kan deles inn i tre faser: 1) perfusjon og vev innsamling, 2) vev forberedelse og flekker og 3) sink histochemistry. Kort, i den første fasen av protokollen, dyret er anesthetized og injisert IP med den passende dosen av natrium selenitt. Etter en tilstrekkelig tidsperiode (ideelt 60-90 min) euthanized dyret senere, parfyme med 0,9% NaCl løsning etterfulgt av en 4% paraformaldehyde løsning. Hodet er decapitated og hjernen fjernet raskt fra skallen. Hjernen er da lov å synke 4% paraformaldehyde pluss 30% sucrose løsning som kryoprotektant. I den andre fasen av protokollen, er frosne snitt skåret på en glidende mikrotom på 40 µm i fosfat-bufret saltvann (PBS) og delt inn i nummererte serien. Det er viktig å montere deler på egg-hvit subbed lysbilder umiddelbart etter snitting forlate deler til tørr overnatting for optimale resultater. Gelatin subbed lysbildene er ikke anbefalt som krom kalium Sulfate brukes vanligvis i subbing løsningen cross-reacts med sølv laktat, dermed fører til suboptimal flekker. Delene er deretter ruges i 15 min absolutte alkohol og venstre tørke helt ved romtemperatur. Dette trinnet er etterfulgt av en kort neddykking montert seksjoner i 1% gelatin løsning forberedt på forhånd, og lov til å tørke over natten for optimale resultater. I den siste fasen av protokollen (sink histochemistry), utvikler løsningen er utarbeidet etter fremgangsmåten i avsnittet metoder og lysbilder er plassert i en plast eller glass skuff neddykket i løsningen. Utviklingen av flekken vanligvis tar hvor som helst mellom 2-3 h, men nær visuell inspeksjon er nødvendig for å unngå overstaining delene. Når riktig intensitet er oppnådd, bør lysbilder fjernes, plasseres på en objektglasstativet og skylles i varmt vann i 5-10 min å fjerne ytre sølv innskudd. Delene kan deretter tørkes ved romtemperatur, ryddet og coverslipped. En skjematisk av bestemte trinn kreves for å fullføre den sink histochemistry fasen av protokollen er vist i figur 2.
Denne protokollen bruker synaptic sink histochemistry for å avsløre areal og laminær variasjon i flekker nivåer blant visuelle kortikale områder i oppspore hjernen. Denne protokollen kan tilpasses for bruk i andre arter så vel som i andre områder av hjernen. For eksempel forskere studere andre sensoriske halvdelene som somatosensory, auditiv eller frontal cortex oppspore eller andre modellen systemet stor fordel av å bruke denne histochemical flekken. Den største fordelen med denne teknikken er at det gir klare overganger mellom områder forenkle areal identifikasjon i voksne samt pålitelig skille kortikale områder i små dyr som gnagere, oppspore, kattene og aper.
Figur 3a viser et eksempel på en sink farget delen som vi utilsiktet utviklet for også lang, og dermed ble overstained i prosessen. Overstained vev er preget av en veldig mørk brun farge, mangel på laminær variasjon, og sterkt farget hvit substans. Sink-farget hjernen inndelinger kan imidlertid noen ganger bli understained som vist i figur 3b. Understained inndelinger kan noen ganger oppstå hvis dyret ikke overleve en tilstrekkelig mengde tid (minst 60 min), som utelukker alle de injiserte selenitt fra reiser til hjernen. Understaining av vev kan også oppstå hvis selenitt var forvaltes riktig, og derfor ikke reiste til hjernen.
Heterogen fordelingen av synaptic sink farging i flere visuelle kortikale områder i en voksen oppspore vises i en representant semi tangentiell delen figur 4a. Pilene peker til areal grenser. I områder 17 og 18, farging intensiteten av synaptic sink er generelt høy i lag jeg, II, III og V, lite lag IV (thalamorecipient lag) og moderat lag VI. Tilstedeværelsen av en klart identifiserbare overgang mellom områder 17 og 18 er tydelig i figur 4a. Lag IV flekker intensiteten i området 18 øker litt og lag V reduseres og er av varierende intensitet. Figur 4b er et tilstøtende farget for cytochrome oxidase (CO) som viser lignende steder areal grenser til de observerte vi med sink flekken. Regionene områder 17 og 18 som har høye nivåer av sink generelt synes å ha lave nivåer av CO flekker.
Fordelingen av synaptic sink i 19 og 21 er kvalitativt lignende begge områdene har mindre laminær variasjon enn i områder 17 og 18. Lag IV av 19 og 21 er klart forskjellig fra lag IV i områder 17 og 18 det er moderat farget. Supragranular og infragranular lag av 19 er av samme intensitet, men lag V flekker litt mørkere. 21 har en tilsvarende synaptic sink distribusjon som i området 19. Men er laget VI området 21 preget av større synaptic sink nivåer enn lag IV av 19. Lag VI og IV av Suprasylvian (Ssy) synes å være moderat farget og er sammenlignbare intensitet, mens lag V er preget av større synaptic sink nivåer og supragranular lag er preget av et varierende mønster av synaptic sink nivåer.
Kvantitativ vurdering av fordelingen av synaptic sink i forskjellige hjernen regioner med ulike behandlinger, eller i ulike aldre, kan gjøres, om ønskelig. For eksempel, kanskje ettall vil gjerne vurdere endringer i fordelingen av synaptic sink i voksne eller gjennom utvikling i primære visuell, auditiv, og somatosensory halvdelene i ethvert modellsystem med. Bruker densitometric analyse, vi har tidligere vist at fordelingen av synaptic sink i flere visuelle områder (17, 18, 19, 21 og Suprasylvian) av utvikle oppspore hjernen, avta betydelig fra fem til seks ukers alder17. Her beskriver vi trinnene som er nødvendig å vurdere forskjeller i fordelingen av synaptic sink i representant prøver tatt fra en voksen oppspore å illustrere prosessen. Følgende fremgangsmåte kan følges for å spore endringer i fordelingen av synaptic sink i juvenile oppspore hjernebarken så vel som i andre arter eller hjernen regioner. Figur 5 viser representant kolonne photomicrographs fra voksen hjernen deler behandlet for sink histochemistry sammen med deres komplementære normalisert optisk densitet tomten profiler. Normalisert plott av optisk densitet ble generert for å gjenspeile endringer etter kortikale dybde. Derfor gjenspeiler hver tomt profil verdi gjennomsnittet gråtoner verdien på rad kortikale dyp. For eksempel er 17 og 18 preget av en merkbar nedgang i sink farging i lag IV (representert ved bunnen), som er tydelig fra deres tomten profiler. Mener minimum optisk densitet i områder 17 og 18 angis av de utfylte svart ovaler. Lav sink flekker observert i laget IV av 17 og 18 kontraster med bare en subtil dukkert i sink nivåer i områder 19, 21 og Ssy. Kollektivt, områder 19, 21 og Ssy er kvalitativt annerledes enn områder 17 og 18 i at sink nivåer gjennom alle lagene er mer homogen enn i områder 17 og 18. Videre flekken supragranular lag og lag V av 17 og 18 vanligvis mer intenst enn lag VI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien har en histochemical teknikk basert på en modifisert versjon av Danscher (1982) metoden10, der synaptic sink lokalisering kan oppdages og visualisert i hjernen. Denne metoden fungerer i hovedsak ved å injisere dyret med sink chelator natrium selenitt (Na2SeO3) (15 mg/kg). Etter injeksjon, selenitt reiser til hjernen og binder seg til gratis sink som er lokalisert til presynaptic blemmer sink som inneholder neurons. Sink ionene bundet til molekyler innenfor synaptic vabler føre, og senere kan visualiseres gjennom fysisk utvikling2,11. Den opprinnelige Timm sulphide sølv flekker metoden var ment å oppdage og visualisere en rekke tungmetaller som Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni og Zn i biologisk vev22. Chelaterande agent brukt for denne metoden er natrium sulphide. Derfor er et stort problem med bruke Timm's sulphide metoden mangelen på eventuelle metall som kan forvandles til en metall sulphide kan faktisk være sølv forsterket av fysisk utvikling. Den endrede versjonen av metoden Danscher som brukes i denne studien er imidlertid spesifikt for sink og ingen andre tungmetaller. Det er flere forskjeller mellom Danscher's 1982 og den nåværende metoden vi beskriver i denne studien. Danschers metoden bruker ferske unfixed hjernevev mens vi bruker frossent. Danscher bruker også glutaraldehyde for perfusjon, mens vi bruker paraformaldehyde som dette er mer kompatibel med immunohistochemical og andre histologiske indikatorer vi rutinemessig flekken i vår lab. Danscher bruker også poststaining prosedyrer som toluidine blå (1%), som vi ikke utfører i vår metode.
En begrensning av nåværende teknikken er uforutsigbarheten forbundet med natrium selenitt toleranse av dyr. Vi finner at etter administrasjon av natrium selenitt, noen ganger dyr ikke overleve mer enn 30 minutter. Denne situasjonen utgjør et problem som ikke tillater nok tid for selenitt å reise til hjernen, og utvikling av hjernen deler vanligvis fører til ujevne vev flekker. En annen potensiell begrensning gjelder riktig administrasjon av intraperitoneal injeksjon av natrium selenitt. En bør trekke på huden over lavere bukhulen og sett inn nålen skråkant siden opp i en vinkel på 15-20 grader, gjennomtrengende bare bukveggen. Nålen skal trekkes tilbake litt abdominal organer ikke har brutt og materiale har ikke vært pustende. Nålen skal avhendes og erstattet hvis dette skjer.
For å sikre høy kvalitet flekker resultater og reproduserbarhet, anbefaler vi følgende forbehold tiltak. Riktig administrasjon av natrium selenitt til dyr og maksimere overlevelse tidspunktet for dyret (60 til 90 min er optimale) før euthanizing, er avgjørende for å sikre tilstrekkelig tid er gitt for selenitt å reise til hjernen. Vi har funnet at kortere overlevelse perioder (30 minutter eller mindre) vanligvis føre til ujevn vev flekker. Likeledes, montering deler på egg-hvit subbed lysbilder straks snitting blokken er et kritisk punkt. Forlate fersk kuttet frosne snitt i PBS for et antall dager anbefales sterkt mot som sink ioner vil lekke til løsning. Under utarbeidelsen av utvikler løsningen er det avgjørende å sikre citrate bufferen er av riktig pH (4.0) som denne reaksjonen er ganske følsomme for små endringer i pH. Likeledes, når varme hydrokinon løsning er det viktig å holde temperaturen under 60 ° C, som ytterligere oppvarming vil oksidere løsningen og hemme flekken. Tilsvarende er kort submerging avsnittene lysbilde montert i gelatin kritisk som hindrer uspesifisert deponering av sølv på overflaten av delen. Imidlertid deler bør ikke stå i gelatin løsningen lengre enn 10 s da dette vil føre dem til å skrumpe opp som fører til ujevne vev flekker. Periodiske visuell inspeksjon av delene i utvikler løsning anbefales siden vi forlot avsnittene for lenge kan føre til overstaining. Denne flekken er ganske ømfintlig, så deler pleier å utvikle raskere når temperaturen er varmt og saktere når temperaturen er kjøligere. Til slutt kan en du forsiktig risting lysbildene i objektglasstativet under skyllingsprosess trinnet i varmt vann for å lette fjerning av gelatin og resterende sølv innskudd fra lysbildene. Men overdreven og uforsiktig agitasjon deler mens skylling lysbilder med varmt vann, kan det føre til at deler å skli av lysbildene, og bør unngås. Det er også avgjørende for å sikre en forsvarlig kontroll brukes for densitometric mål for å gjøre kvantitative sammenligninger. Man kan potensielt bruke et lett farget eller ikke flekker område som en intern kontroll. I vårt materiale bruker vi hvit substans som en kontroll normalisere optisk densitet i ulike visuelle kortikale områder gjennom utvikling. Vi finner at hvit substans verdier er sammenlignbare i ulike aldre og i den voksne17. Derfor, gitt at hvit substans verdier ikke endrer som funksjon av alder, hvit substans fungerer som en gyldig kontroll for densitometric analyse.
Den største fordelen med denne metoden er at det er en enkel og pålitelig histochemical flekk som distribusjon kan brukes som andre histochemical markører, for å skille områder av hjernen. Men bruk av denne histochemical metoden kan ikke være passende å studere bestemt celle populasjoner (de mangler sink), eller i svært små dyr som synaptic sink nivåer er utgangspunktet lav ved fødselen som vist i utvikle mus somatosensory og katten hjernebarken5 ,20. En annen fordel med denne protokollen er at den kan brukes sammen med nevroanatomi tracer injeksjon eksperimenter. I vår lab injisere vi vanligvis en toveis neuronal tracer i den primære hjernebarken av juvenile oppspore å studere utviklingsmessige endringer i mønsteret tilkobling blant flere områder i i hjernebarken. Derfor trenger dyr ikke utelukkende brukes for sink histochemistry hvis dyrene kan utnyttes for en annen eksperimentelle studier. Hovedfordelen med metoden beskrevet er at det kan tilpasses for bruk i andre arter og i andre områder av hjernen. Selv om vi har vist denne metoden bruker oppspore hjernevev, kan det være små forskjeller i noen av trinnene når studere hjernevevet fra gnagere, kattene eller aper. Andre har brukt denne sink histochemical metoden for å illustrere forskjeller i flekker mønster i voksen monkey hjernebarken8, utvikle og voksen katt hjernebarken5utvikle rotte somatosensory cortex9 , 20, voksne mus somatosensory cortex6,21og voksen Parma wallaby hjernebarken7.
Her beskriver vi de grunnleggende trinnene av den protokoll og understrekingstegn viktige parametere som må kontrolleres for å konsekvent oppnår høy kvalitet sink flekker. Vil du kanskje vurdere endringer i synaptic sink nivåer i andre sensoriske eller motor halvdelene eller subkortikal strukturer i andre modellen dyr. Kvantitativ informasjon som densitometric ennalysis gir i denne metoden kan være fordelaktig for følgende kortikale utvikling over tid og muligens avslørende ulike utviklingsmessige profiler av synaptic sink nivåer blant annet hjernen regioner (som vi har tidligere vist17). En viktig faktor er utviklingsmessige spørsmålet og en tilsvarende alder av dyr å studere. Synaptiske sink histochemistry avslører klart identifiserbare visuelle kortikale områder i oppspore og kan fungere som en guide i videre studier av kortikale organisasjon og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Center for forskning ressurser (2G12RR03060-26A1); National Institute on minoritet helse og helse forskjeller (8G12MD007603-27) fra National Institutes of Health; Profesjonelle ansatte Kongressen-City University of New York (PSC-CUNY); og fakultet forskning Grant (FRG II) American University of Sharjah. Vi takker Vidyasagar Sriramoju for å introdusere oss til disse metodene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
