Summary
Мы описываем гистохимические процедуру, которая раскрывает характерные ламинарное и площадных цинка, окрашивания моделей в различных мозга. Цинк окрашивание шаблон может использоваться в сочетании с другими анатомические маркерами надежно различать слои и регионах в развивающихся, так и взрослого мозга.
Abstract
Характеристика мозга анатомической и функциональной организации и развития требует точной идентификации различных нейронных цепей и регионов в незрелых и взрослого мозга. Здесь мы описываем цинка гистохимические пятная процедуру, которая показывает различия в окрашивания моделей среди различных слоев и мозга. Другие использовали эту процедуру не только выявить распределения цинка содержащих нейронов и цепей в головном мозге, но и успешно очертить границы ареала и ламинарные в развивающихся, так и взрослого мозга в нескольких видов. Здесь мы показываем это пятная процедуру с изображениями из развивающихся и взрослого хорька мозги. Мы раскрыть шаблон окрашивание цинка, который служит в качестве анатомического маркера областей и слои и надежно может использоваться для различения визуальные корковых областях в развивающихся, так и взрослых зрительной коры. Основная цель настоящего Протокола заключается в представлении гистохимический метод, который позволяет точное выявление слоев и регионов в развивающихся, так и взрослого мозга, где другие методы не позволяют сделать это. Во-вторых в сочетании с анализом денситометрических изображений, этот метод позволяет оценить распределение синаптических цинка выявить потенциальные изменения на протяжении развития. Этот протокол описывает подробно реагентов, инструменты и шаги, необходимые для последовательно пятно замороженный мозг секций. Хотя этот Протокол описан с помощью хорька мозговой ткани, она может быть легко адаптирована для использования в грызунов, кошки или обезьян также, как и в других регионах мозга.
Introduction
Гистологические пятна традиционно использовались для оказания помощи в идентификации корковых областях в различных видов путем выявления различий в архитектурные особенности. Комбинированное использование гистохимические методы, такие как Ниссль вещество, реактивность цитохрома-оксидазы (CO) или миелина может оказаться плодотворным, как они показывают аналогичные площадной границ в взрослого мозга. Однако эти гистохимические пятна не всегда должным образом выявить четких границ между корковых областях и слоев в незрелых мозга.
В центральной нервной системе цинк имеет несколько важных функций, которые включают стабилизации структуры ДНК, действуя как кофактор фермента, участвуя в многочисленных нормативных функций и действуя в качестве нейромодулятора через свое присутствие в синаптических пузырьков 1. синаптических цинка является уникальной, поскольку она могут быть визуализированы с помощью гистологических методов, в то время как белок прыгните цинка не может быть визуализирован2. Эта возможность была использована раскрыть структуре синаптических цинка в различных регионах корковых и синаптической цинка гистохимии использовалась в ряде исследований. Подмножество глутаматергические нейронов коры головного мозга содержат цинка в пресинаптическом везикулы в пределах их аксона терминалы3,4. Гистохимических исследований показали гетерогенных распределение синаптических цинка в коре5,6,7. Там, как представляется, различные площадной и ламинарные распределения методами реагирования цинка в различных регионах кортикального слоя (например, визуальный против соматосенсорной коры), или слоев (например, уровни цинка в supragranular и infragranular слои первичной зрительной коры значительно выше, чем в thalamocortical входного слоя IV с относительно низкой синаптических цинка уровнями)5,8,9. Гетерогенность в синаптических цинка окрашивание, наблюдается в коре особенно выгодно, как она содействует идентификации площадной и слоистые.
Здесь мы представляем подробное описание синаптических цинка гистохимические процедуры, которая представляет собой модифицированную версию Danscher в 1982 году метод10. Этот метод использует селенит вводили внутрибрюшинно (IP) в животных как комплексон. Селенит едет в мозг реагировать с бассейнами свободной цинка, найденных в везикулы подмножество глутаматергические синапсов в головном мозге. Эта реакция дает осадок, который может впоследствии дополняться Серебряный развития2,10,11.
Эта процедура показывает ламинарное и площадных модели синаптической цинка окрашивания; денситометрических анализ может использоваться для оценки этих моделей как качественно, так и количественно в мозге взрослого и незрелых для изучения воздействия других мероприятий, таких как сенсорные, экологические, фармакологическим или генетических манипуляций. Кроме того один может потребоваться оценить потенциал развития изменения в распределении синаптических цинка в других корковых и подкорковых структур в других системах модель. Количественная информация, предоставляющий денситометрических анализ в этот метод может быть выгодным для развития мозга со временем. Этот протокол обеспечивает компаньон для других иммуно - и гистохимических маркеры раскрыть ламинарное и площадных границ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
следующий протокол следует животных ухода руководящими принципами, установленными на институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) в колледже Нью-Йорка, которые соответствуют все соответствующие государственные и федеральные руководящие принципы. Анестезия для хорьков и должен быть изменен согласно изученных видов.
Рисунок 1: схема, указанием основных шагов, участвующих в 3 этапах этого протокола и время, необходимое для выполнения каждого шага. Периоды, требующие секций полностью высохнуть показаны в кругах зеленый текст, в то время как все другие шаги, в кругах белый текст. Зеленый ромбовидной текстовое поле — момента принятия решения, в то время как красный прямоугольник является важным шагом и должны быть выполнены с особой тщательностью. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
1. подготовительные шаги (слайд Subbing и приготовления раствора)
- мыть где слайды с моющим средством в горячей воде и промыть несколько раз в теплой воде, затем с дистиллированной водой промыть, чтобы тщательно удалите грязь или мусор. Разрешить слайды высохнуть при комнатной температуре или в духовке при 37 ° с.
- После того, как слайды полностью сухой, слой тонкий равномерный слой яичного белка на каждом слайде, используя пальцами или кистью. Дайте высохнуть в духовке при 60 ° C для 20-30 мин. Для получения оптимальных результатов и избежать соскальзывания разделы, добавить второй слой яичный белок и еще раз высушите в духовке при температуре 60 ° C.
- Приготовляют раствор 1% желатина, растворяя 1 грамм желатина в 100 мл горячей воды (60 ° C) и дайте ему остыть до комнатной температуры.
- Подготовить 200 мл раствора разработчик, как описано ниже, для использования в разделе 4.
- Подготовить раствор гуммиарабика, медленно добавляя 40 g с шагом 120 мл горячей воды (это более легко растворяется таким образом). Продолжать перемешать раствор с бокалом помешивая стержня. После того, как решение полностью не растворится, удалить от жары и дайте ему остыть в течение нескольких минут, затем процеживают через 6-8 слоев ткани марли в воронку.
- Подготовка цитрат буфер путем добавления 5.04 г лимонной кислоты плюс 4,7 г натрия цитрата в 20 мл dH 2 O и растворения смеси. Убедитесь, что рН этого решения 4.0 в 25 ° C. Регулировка рН в случае необходимости путем добавления раствора гидроксида натрия или соляной кислоты.
- Готовят гидрохинона раствор отопления 30 мл dH 2 O и растворения 1.7 g гидрохинона.
Примечание: Топление вверх гидрохинона раствор необходимо позволить ей легко растворяются в воде, как гидрохинона не легко растворимые в воде при комнатной температуре. Будьте осторожны, чтобы держать температуру воды ниже 60 ° C, иначе может быть окисляется гидрохинон. Если решение желтеет, отменить и подготовить еще один свежий раствор. - Подготовка серебро лактат раствора путем растворения 0,22 g в 30 мл dH 2 O.
- Смесь решения (1.4.1 - 1.4.4) в том порядке, в котором они описаны, когда будете готовы выполнить реакций (то есть, после разрезания, сушки и фиксации) ( Рисунок 2). В конце добавьте Серебряный лактат раствора. Убедитесь, что этот шаг завершен быстро и разработчик решения помещается в темноте, пока не пришло время реагировать в разделах как серебро лактат светочувствительной.
Рисунок 2: схема, иллюстрирующая последовательность шагов, участвующих в перемешивание реагентов в фазе гистохимии цинка протокола. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
2. животных лечения и обезболивания
- до седативным животного, приготовляют раствор 1% Натрия селенит (Na 2 SeO 3), растворяя 10 мг натрия селенит в 1 мл dH 2 O.
- Анестезировать животное с внутримышечной инъекции кетамин (25 мг/кг) и ксилазина (2 мг/кг).
Примечание: Убедитесь, что надлежащий уровень анестезии достигается с помощью педали рефлекторной реакции. - Придать цинка хелатором раствор натрия селенит (15 мг/кг) внутрибрюшинно (IP).
Примечание: Токсичность селенит натрия в разном возрасте или других видов могут варьироваться. - Позволяют 60-90 мин для селенит натрия для поездки в мозг. В этот период важно обеспечить животное правильно седативные и перестает отвечать на запросы, так что проверить глубины анестезии каждые 5 минут
- Период селенит, в то время как наркоз животным, убедитесь, что глаза закрыты для предотвращения сухости, или администрировать глазная мазь, чтобы держать их влажными.
3. Подготовка тканей и окрашивания
- усыпить животных управляющими передозировка Пентобарбитал натрия (100 мг/кг, i.p).
- Выполнять transcardial перфузии с нормальной солевой раствор 1 мин и параформальдегида 4% за 20 мин. Наконец, администрировать раствор с 4% параформальдегида и 10% сахарозы (всего фиксации период 1 h).
- Удалить голову, с помощью пары больших ножницы.
- Сделать срединной линии разреза с помощью скальпеля от носа к шее подвергать черепа.
- Тщательно удалить мозга и отдельных полушарий с лезвием.
- Блок в задней части мозга и postfix в параформальдегида 4% в 0,1 М фосфатного буфера (PB) на несколько часов.
- Место блоков в 30% раствор сахарозы в 0,1 М PB и позволяют мозгу раковина.
Примечание: Замена 4% раствор сахарозы параформальдегида и 30% раствором 30% сахарозы в 0,1 М PB потопить мозга ограничивает мозга ' s подверженности параформальдегида как это может повлиять на качество окрашивания ткани. - Когда-то мозг раковины, стрижки полу тангенциальная 40 мкм толщиной через зрительной коры или региона интерес на замораживание, раздвижные микротома или криостата. Это может быть достигнуто путем размещения блока с медиальной поверхности вниз и осторожно спрямления с на стеклянное скольжение.
- Собирать секции с кистью и хранить в снасти коробки, содержащие фосфат амортизированное saline (PBS).
- Отдельные разделы на отдельные номерные серии. Сразу же установить один или два ряда участков мозга на яичный subbed слайды (раздел 1), позволяют для высыхания на ночь при комнатной температуре и обработки секций методами для синаптических цинк.
Примечание: Другие серии могут быть обработаны для других маркеров для сравнения, например миелина 12 или цитохрома-оксидазы, используя измененный Протокол 13: проинкубируйте 2-8 ч при температуре 40 ° C с 3% сахарозы, 0,015% цитохром С, 0,015% каталазы и 0,02% Диаминобензидин в 0,1 М PB. Ниссль вещество может также использоваться как гистологические маркера для отличительные визуальный корковых областях. Эти гистологические пятна не требуют, что мозг разделы монтируются на яичный subbed слайды, поэтому традиционные желатин покрытием слайды могут использоваться вместо.
4. Синаптических цинка гистохимии
- исправить разделы слайд монтируется в абсолютном спирте 15 мин и дайте высохнуть полностью при комнатной температуре в течение 1 ч. < lя > кратко погружать разделы для 10 s в раствор 1% желатина (раздел 1) и позволяют для высыхания на ночь при комнатной температуре.
- Смешать решения как описано в шаге 1.8, как только разделы готовы быть отреагировали.
- Реагируют разделы путем организации бок о бок в стеклянной или пластиковый лоток слайды и лить развивающихся раствор на слайды. Убедитесь, что слайды полностью погружен в раствор и перевести лотка на темное пространство или покрытия с свет жесткой коробке.
Примечание: Пластиковый лоток, который составляет приблизительно 12 дюймов может использоваться длиной 8 дюймов широкий, который подходит именно 18 слайдов. Суммарный объем 200 мл разработчик решения достаточно, чтобы полностью погрузите слайды, поэтому убедитесь, что правильный том используется для указанного числа слайдов для быть отреагировали и соответственно корректировать рецепт. Рекомендуется использовать пластика или стекла лоток в отличие от использования металлический лоток, как есть некоторые степень реактивности между Серебряный лактата в решении разработчик и железа или другие металлы встречаются в металлических лотков.
- Реагируют разделы путем организации бок о бок в стеклянной или пластиковый лоток слайды и лить развивающихся раствор на слайды. Убедитесь, что слайды полностью погружен в раствор и перевести лотка на темное пространство или покрытия с свет жесткой коробке.
- Следить за развитием реакции путем визуального осмотра в разделах каждые 30 мин. Разделы, как правило, требуют 120-180 мин для полного развития.
- Если разделы становятся overstained (см. рис. 3а), дифференцировать в 2% Фермер ' s решение (9 частей тиосульфата натрия 2% в dH 2 O и 1 часть 2% калия Гексацианоферрат dH 2 O) для 1-2 мин
Примечание: Пример раздела, который плохо окрашенных показано на рисунке 3b. - После достижения желаемой интенсивности, прекратить реакции путем удаления слайд монтируется разделы из лотка и размещения слайдов на коммуникационном слайд.
- Установите решетку слайд в большой стакан, окрашивание блюдо и мыть слайды в теплой (40-50 ° C) воды за 10 мин удалить слой желатина и внешних месторождения серебра.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не агитировать слайд стойку для предотвращения соскальзывания секции. Желаемой интенсивности секции достигается, когда достаточно ламинарные вариация проявляется и разделы являются достаточно темно, но не сожалеете (см. рис. 4a). - Позволяют слайды сохнуть при комнатной температуре, и затем обезвоживает в 100% EtOH (5 мин), ясно в ксилоле (5 мин) и крышка выскальзования с монтажа средних. Кроме того, место слайды в восходящей серии алкоголя, а затем обезвоживает, очистить и coverslip.
- Использование секций от животных без предыдущего лечения селенит в качестве отрицательного контроля. Серебряный усиления этих разделов должна принести без пятнать.
Примечание: Для оптимальных результатов позволяют разделы для высыхания на ночь. Позволяя разделы для высыхания на ночь дает лучше окрашивания тканей.
Рисунок 3: синаптических цинка, пятнать в мозге несовершеннолетних хорька. Микрофотографиями полу тангенциальная цинка окрашенных секций, которые) overstained и b) understained в мозге несовершеннолетних хорька. Границы ареала трудно различить, как ламинарная вариации хватает. Белое вещество также сильно запятнана. СМЗ Suprasylvian коры, WM белый вопрос, передний, D спинной. Шкалы бар = 500 мкм (a-b). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. отличительные площадной границ и захвата изображений
- использования архитектурные особенности различных мозга регионов для идентификации площадной и ламинарные.
Примечание: например, в развивающихся retrosplenial крыса коры 14, авторы выявили переходных модульность, характеризуется тяжелого окрашивания для цинка, который отсутствует у взрослых, но могут быть использованы для описания корковых Организация во время разработки в этот вид. В другом исследовании 15 авторы выявили специфичности в синаптических цинка распределение различных ядер в миндалина обезьяны макаки, способствующих идентификации этих подразделений. Визуальные корковых областях в развивающихся, так и взрослого хорька мозга были ранее описанных 16 , 17 , 18, архитектурное подразделение коры головного мозга в Серая белка были описаны 19. Кроме того цинка гистохимии ранее использовался для различения областей в взрослых обезьян зрительной коры 8, развивающихся и взрослого кота зрительной коры 5, разработка крыса соматосенсорной коры 9 , 20 и взрослые мыши соматосенсорной коры 6 , 21. Если возможно, Сравните окрашивание шаблон в миелина, витражи, цитохром оксидазы (CO) окрашенных и синаптической цинка, окрашенных мозга секций, чтобы подтвердить границы ареала в взрослых. В полу тангенциальная разделах хорька зрительной коры, витражи для синаптических цинка есть известные различия среди визуальных корковых областей, которые облегчают площадной идентификации. Например районах 17 и 18 взрослого хорька показывают, что окрашивание синаптических цинка является высоким в слои-III и VI слой V. пятна менее интенсивно, в то время как слой IV почти не хватает цинка. Бросается в глаза отсутствие цинка, пятнать в слое IV или районах 17 и 18 контрастирует с темно окрашенных группы нашел в слое IV в CO окрашенных секций. Однако, слой IV района 17 в CO окрашенных разделы поддерживает резкое границы с слоями III и V, но слоя IV в районе 18 характеризуется тонким снижением интенсивности окрашивания и его верхняя граница нашли в слое III менее различимыми. - Изучить разделы, с помощью микроскопии brightfield с целью малой мощности (2 X или 4 X увеличение) и сфотографировать области интереса.
- Усилить контраст и яркость микрофотографиями, используя программное обеспечение для обработки изображений. Изображения получены для измерения оптической плотности не должно быть изменено в коей.
Рисунок 4: отличает синаптических цинка, пятнать в мозге взрослого хорька различные визуальные корковых областях. Микрофотографиями прилегающих полу тангенциальная секций витражи для () синаптических цинка или (b) цитохрома оксидазы (CO) у взрослых. Стрелки Марк площадной границ. СМЗ Suprasylvian коры, передний, D спинной. Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
6. денситометрия (необязательно)
Примечание: Densitometric анализ может использоваться для оценки распределения синаптических цинка в мозге путем измерения оптической плотности представитель цинка, окрашенных в регионах интересующие разделы. Этот метод также полезен для отслеживания потенциальных изменений в уровнях синаптических цинка на протяжении развития.
- Использование выбранных цинка окрашенных секций, случайным образом выбирать корковые колонки (столбчатых микрофотографиями) соответствующей ширины (450 мкм широкий столбец может использоваться) из приобретенных микрофотографиями региона интерес. Корковых столбец является регионом, охватывающих все корковых слоев от поверхности сетчаточных белого вещества.
- Выбрать соответствующее количество образцов столбцов из нескольких различных мозга секций в каждом регионе интереса.
- Передачи изображения образца представитель столбцов в обработки изображений программное обеспечение.
- Использовать инструмент Прямоугольное выделение охватывает весь столбец корковых. Для создания образа контраст вспять похож на негативе столбце
- использовать средство инвертировать.
Примечание: Инверсии контраст изображения выполняется для получения высокой оптической плотности для уровней высокой синаптических цинка и низкой оптической плотности значения для уровней низкого синаптических цинка. Это более интуитивным способом оказать участок профиль графов, похожие на те, показано на рисунке 5. - Производят оптической плотности профилей из этих изображений, используя средство профиль участка для создания двумерных графа пиксель света вдоль линии.
- Использовать параметры печати для преобразования диаграммы профиля в вертикальный профиль и нажмите на участке профиль раз больше.
Примечание: Ось x представляет расстояние вдоль линии и y представляет интенсивности пикселей. Таким образом, каждый участок профиля значение отражает значение среднего серого на каждой глубине по ширине столбца. - Открыт участок профиля значения в виде текстовых файлов в таблицы, нормализации и печать как графики, (см. Рисунок 5).
Примечание: Рекомендуется использовать относительную плотность синаптических цинка для сравнения количественных измерений, как результаты могут быть confounded вариации интенсивности общего окрашивание вследствие различных время реакции, stainability ткани, а также другие переменные. - Вычислить плотность относительной цинка выполняя первый вагон среднего значения профиля сюжет для сглаживания данных.
Примечание: Это достигается путем усреднения, например, каждые последующие 20 или 30 пикселей (1 пиксель = 2,5 мкм) в глубину и затем нормализации для максимальной интенсивности для каждого образца. Таким образом каждый средний участок профиля значение отражает значение среднего серого на этой глубине (серого диапазон значений от 0 до 255). Различные нормализации метод может использоваться значениями первого приобретения белого вещества (WM) оптической плотности образца регионов, которые включают основные белого вещества в областях, представляющих интерес. В идеале выберите несколько областей, которые легко окрашены как можно получить среднее значение WM. Средняя оптической плотности значений затем делятся на средние значения WM для получения значения WM нормированный. - Определение значения оптической плотности в определенных слоях областей, представляющих интерес для количественных сопоставлениях.
Примечание: К примеру, значение средней минимальной оптической плотности в слое IV визуального корковых областях хорька определяются охватывающих регионе наименее окрашенные пикселей ±5. - Расчет средней оптической плотности значения в supragranular и infragranular слои визуального корковых областях хорька, охватывающих регионе темные витражи на ±5 пикселей, чтобы определить среднее значение максимальной.
- Обеспечить которые оптической плотности значения получаются из в рамках конкретных слоев.
Примечание: Важно, чтобы проверить пределы этих слоев в Перевернутый контраст изображения путем сравнения их с оригинальной микрофотографиями, а также смежные секции CO. Это гарантирует, что один не вторгаться на прилегающих слоях.
Рисунок 5: ламинарный распределение синаптических цинка в различных visual корковых районы в взрослого хорька. Представитель микрофотографиями колонн через все слои коры с соответствующее нормализованное оптической плотности профилей в взрослых. Плотность низкая синаптических цинка в слое IV взрослых районах 17 и 18 обозначается корыта в участок профиля. В каждом профиле сюжет заполненные овалы в корыте слоя IV указывают значения, используемые для определения значения интенсивности средний минимальный пиксел. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В блок-схема на рисунке 1представлены основные шаги, участвующих в настоящем Протоколе пятно мозга разделы для синаптических цинка. Протокол можно разделить на три этапа: 1) перфузии и коллекции тканей, подготовка 2) тканей и окрашивание и гистохимии 3) цинка. Вкратце на первом этапе протокола, животное находится под наркозом и вводили IP с соответствующей дозой селенит натрия. После достаточного периода времени (в идеале 60-90 мин) животное впоследствии умерщвлены, увлажненную с 0,9% раствор NaCl следуют решения параформальдегида 4%. Обезглавленное головы и мозга быстро удаляется от черепа. Мозг затем разрешается тонуть в параформальдегида 4% плюс 30% раствора сахарозы как криопротектора. На втором этапе протокола Замороженные разделы нарезать фосфат амортизированное saline (PBS) на раздвижные микротом на 40 мкм и разделены на номерные серии. Важно смонтировать разделы на яичный subbed слайды сразу после разрезания, оставляя разделы для высыхания на ночь для достижения оптимальных результатов. Желатин subbed слайды не рекомендуются как калия Сульфат хрома, обычно используется в subbing раствора cross-reacts с серебряной молочной кислоты, что может привести к неоптимальной пятнать. Разделы затем инкубируют 15 мин в абсолютном спирте и слева, чтобы полностью высохнуть при комнатной температуре. Этот шаг является следуют краткие погружения навесные секции в 1% раствор желатина, подготовленных заранее и возможность высохнуть на ночь для достижения оптимальных результатов. На последнем этапе протокола (цинка гистохимии) разработчик решения подготовлен согласно шаги, описанные в разделе методы, и слайды, помещаются в пластиковые или стеклянные лоток, погруженной в решении. Разработка пятно обычно занимает где-то между 2-3 ч, но близко визуальный осмотр необходимо избегать overstaining разделы. Когда достигнута соответствующие интенсивность слайды должны удалены, размещены на коммуникационном слайд и промыть в теплой воде на 5-10 мин для удаления внешних месторождения серебра. Разделы можно затем сушат при комнатной температуре, очищается и coverslipped. Схематическое изображение конкретные шаги, необходимые для завершения этапа гистохимии цинка протокола показан на рисунке 2.
Этот протокол использует синаптического цинка гистохимии раскрыть площадной и ламинарные вариации в окрашивание уровнях среди визуальных корковых областей в мозге хорька. Этот протокол может быть адаптирована для использования в других видов, а также других регионах мозга. Например исследователи, изучая другие сенсорные коре, такие как соматосенсорные, слуховой или лобной коры хорька или любой другой модели системы значительно выиграют от использования этой гистохимические пятно. Основным преимуществом этого метода является, что она обеспечивает четкие переходы между зонами для облегчения площадной идентификации в взрослых, а также надежно дифференцировать корковых областях в молодых животных, таких как грызуны, хорьки, кошки и обезьян.
На рисунке 3a показан пример цинка, overstained окрашенных раздел, который мы случайно разработан для слишком долго и, таким образом в процессе. Overstained ткань характеризуется очень темно-коричневого цвета, отсутствие ламинарные вариации и сильно окрашенных белым веществом. Однако цинка окрашенных мозга разделы иногда быть understained, как показано на рисунке 3b. Understained разделы иногда может произойти, если животное не сохранилось достаточное количество времени (по крайней мере 60 мин.), которое запрещает все вводят селенит путешествие в мозг. Understaining ткани также может возникнуть, если селенит не осуществляется должным образом и поэтому не путешествовал в мозг.
Гетерогенные распределение синаптических цинка, пятнать в нескольких визуальных корковых областях взрослого хорька показано в репрезентативной секции полу касательной в рисунке 4a. Стрелки указывают границы ареала. В районах 17 и 18, интенсивность окрашивания синаптических цинка обычно высока в слои I, II, III и V и низко в слой IV (thalamorecipient слоя) и умеренной в слой VI. Наличие четко определенных перехода между районами 17 и 18 проявляется в рисунке 4a. Слегка увеличивает уровень IV окрашивание интенсивности в области 18 и слой V уменьшается и переменной интенсивности. Рисунок 4b , прилегающих раздел витражи для цитохрома-оксидазы (CO), который иллюстрирует аналогичных местах ареала границ для тех, кого мы наблюдали с цинка пятно. Регионах зон 17 и 18, как правило, имеют высокий уровень цинка, как представляется, имеют низкий уровень CO пятнать.
Распределение синаптических цинка в районах 19 и 21 качественно подобных в том, что обе области у менее слоистые вариаций, чем в районах 17 и 18. Уровень IV районы 19 и 21 явно отличается от слоя IV в районах 17 и 18 в том, что это умеренно витражи. Supragranular и infragranular слои области 19 являются аналогичными интенсивности, но слой V пятна немного темнее. Район 21 имеет сопоставимые синаптических цинка распределение, в районе 19. Однако слой VI области 21 характеризуется большей синаптических цинка уровней, чем слой IV района 19. Слои VI и IV Suprasylvian (ССМ) представляется умеренно витражи и сопоставимых интенсивности, в то время как слой V характеризуется более высоким уровням синаптических цинка и supragranular слои, отмечены шаблон колебания уровней синаптических цинка.
Количественная оценка распределения синаптических цинка в различных мозга, с различными процедурами, или в разных возрастов, может быть достигнуто, если того пожелают. Например один может потребоваться оценить изменения в распределении синаптических цинка в взрослых или на протяжении развития в первичных визуальных, слухового и соматосенсорные коре в любой модели системы. С помощью денситометрических анализа, мы ранее показали, что распределение синаптических цинка в нескольких областях, визуальные (17, 18, 19, 21 и Suprasylvian) развивающегося мозга хорька, значительно сократится с пяти до шести недель в возрасте17. Здесь мы описывают шаги, необходимые для оценки различий в распределении синаптических цинка в представительных проб, взятых из взрослого хорька для иллюстрации процесса. Эти шаги можно отслеживать изменения в распределении синаптических цинка в несовершеннолетних хорька зрительной коры, а также в любых других видов или мозга регионах. Рисунок 5 показывает представитель столбчатых микрофотографиями от взрослого мозга разделы обрабатываются для гистохимии цинка вместе с их профилями участок взаимодополняющих нормализованных оптической плотности. Нормализованное участков оптической плотности значений были созданы с учетом изменений согласно корковых глубины. Следовательно каждый участок профиля значение отражает значение среднего серого на подряд корковых глубинах. Например районы, 17 и 18 характеризуются заметным снижением цинка, пятнать в слой IV (представлен корыто), что видно из их участок профилей. Означает, что значения минимальной оптической плотности в районах 17 и 18 обозначаются заполнены в черный овалов. Низкая цинка, окрашивание наблюдаемых в слое IV районах 17 и 18 контрастов с только тонкие купанием в цинка уровнях в областях, 19, 21 и ССМ. Коллективно, районы 19, 21 и ССМ качественно отличается от 17 и 18, в том, что уровни цинка на протяжении всех слоев более однородной, чем в районах 17 и 18. Кроме того supragranular слоя и слоя V районах 17 и 18 обычно пятна более интенсивно, чем слой VI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящее исследование использует гистохимический метод, основанный на модифицированную версию Danscher (1982) метод10, whereby синаптических цинка локализации могут быть обнаружены и визуализирована в головном мозге. Этот метод по сути работает путем инъекций животное с цинка селенит хелатором натрия (Na2SeO3) (15 мг/кг). После инъекции селенит путешествия в мозг и связывает свободный цинка, которая локализуется в пресинаптическом везикулы цинка, содержащих нейронов. Ионы цинка связан молекул в синаптических пузырьков осадок, а впоследствии могут быть визуализированы путем физического развития2,11. Оригинальные Тимм сульфида серебра пятнать метод был предназначен для обнаружения и визуализации количество тяжелых металлов, таких как Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni и Zn в биологической ткани22. Комплексон используется для данного метода является сульфида натрия. Таким образом основная проблема с использованием метода сульфидных Тимм является отсутствие конкретности, как любой металл, который может быть преобразован в металлических сульфидных действительно может быть серебро, усиливается физического развития. Однако модифицированную версию метода Danscher, который используется в текущем исследовании специфичен для цинка и без других тяжелых металлов. Существует несколько различий между Danscher в 1982 и метод настоящее, мы описали в этом исследовании. Danscher метод использует свежие нефиксированных мозговой ткани, в то время как мы используем замороженные ткани. Danscher также использует глютаральдегид для перфузии, в то время как мы используем параформальдегида, как это более совместима с иммуногистохимических и другие гистологические маркеры, которые мы регулярно пятно для в нашей лаборатории. Danscher также использует poststaining процедур, таких как толуидиновый синий (1%), который мы не выполняют в нашем методе.
Одним из ограничений настоящей методики является непредсказуемость, связанный с натрия селенит терпимости, животных. Мы находим, что после управляющей селенит натрия, иногда животные не живут дольше, чем 30 минут. Эта ситуация создает проблему, поскольку это не было достаточно времени для селенит путешествовать в мозг, и последующего развития участков мозга обычно приводит к пятнать неравномерным ткани. Еще одним потенциальным ограничением связана с надлежащего отправления внутрибрюшинной инъекции селенит натрия. Один должен тянуть на кожу над нижней брюшной полости и вставьте стороне скос иглы вверх под углом 15-20 градусов, проникая только брюшной стенки. Иглы должен быть вытащил обратно, слегка для обеспечения органов брюшной полости не были проникли и материал не был придыханием. Иглу следует утилизировать и заменить в этом случае.
Чтобы обеспечить высокое качество окрашивания результаты и воспроизводимости результатов, мы рекомендуем следующие меры предосторожности. Надлежащего отправления селенит натрия в выживаемости животных и максимальное время животного (60-90 мин является оптимальным) до euthanizing, имеют решающее значение для обеспечения достаточного времени для селенит путешествовать в мозг. Мы обнаружили, что более короткие периоды выживания (30 минут или меньше) обычно приводят к пятнать неравномерным ткани. Аналогичным образом монтаж секции на яичный subbed слайды, сразу же после разрезания блок является важным шагом. Оставляя свежесрезанных Замороженные разделы в PBS для нескольких дней настоятельно рекомендуется против как ионы цинка будут выщелачиваться в раствор. В ходе подготовки разработчик решения важно обеспечить что буфера цитрата правильный рН (4.0) как эта реакция является весьма чувствительны к малым изменениям рН. Аналогичным образом когда Отопление гидрохинона раствор является необходимым для поддержания температуры ниже 60 ° C, как далее отопления будет окислять решение и подавляют пятно. Аналогичным образом кратко погружаемой слайд установлен разделы в желатин имеет решающее значение, как он предотвращает неспецифической осаждения серебра на поверхности раздела. Однако, секции не следует оставлять в раствор желатина более 10 s как это заставит их высыхать вверх по ведению к пятнать неравномерным ткани. Периодические визуальный осмотр участков в разработчик решения рекомендуется после ухода из секций для слишком долго может привести к overstaining. Это пятно настолько довольно температуры чувствительных, разделы, как правило, более быстро развиваться, когда температура теплой и более медленно, когда температура охладителя. И наконец одно может понадобиться осторожно встряхните слайды в стойке слайд во время промывки шага в теплой воде, чтобы облегчить удаление желатина и остаточного месторождения серебра из слайдов. Однако чрезмерное и небрежно агитации секций в то время как слайды с теплой водой для ополаскивания может вызвать разделы для скольжения покинуть слайды и следует избегать. Важно также обеспечить надлежащий контроль используется для денситометрических измерений сделать количественные сравнения. Потенциально можно было бы использовать слегка окрашенных или -окрашивание региона как внутреннего контроля. В нашем материале мы используем белого вещества как элемент управления нормализовать значения оптической плотности в различных визуальных корковых областях на протяжении развития. Мы находим, что белого вещества сравнимость между разных возрастов и взрослых17. Таким образом учитывая, что белого вещества значения не изменяются в зависимости от возраста, белое вещество служит допустимый элемент управления для денситометрических анализа.
Основным преимуществом этого метода является, что это простой и надежный гистохимические пятно, распределение которых может использоваться как другие гистохимические маркеры, чтобы отличить мозга. Однако использование этого гистохимический метод не может быть подходящим для изучения определенных клеточных популяций (тех, кто не хватает цинка), или в очень молодых животных как синаптических цинка уровни являются изначально низкими при рождении, как показано в разработке соматосенсорные мыши и Кот зрительной коры5 ,20. Еще одно преимущество этого протокола является, что она может использоваться в сочетании с нейроанатомический трассирующими инъекции экспериментов. В нашей лаборатории мы обычно inject трассирующими двунаправленный нейронов в первичной зрительной коры несовершеннолетних хорьков для изучения развития изменения в схеме подключения среди нескольких областей в зрительной коре. Таким образом животные нужно не должны использоваться исключительно для цинка гистохимии если животных может быть использована для различных экспериментальных исследований. Основным преимуществом метода описаны является, что она может быть адаптирована для использования в других видов и в других регионах мозга. Хотя мы продемонстрировали этот метод с помощью хорька мозговой ткани, могут существовать незначительные различия в некоторых из шагов при изучении ткани мозга от грызунов, кошки или обезьян. Другие успешно использовали этот цинка гистохимический метод для иллюстрации различий в пятнать шаблон в взрослых обезьян зрительной коры8, развивающихся и взрослого кота зрительной коры5, развивающихся крысы соматосенсорной коры9 , 20, взрослые мыши соматосенсорной коры6,21и взрослых Парма кенгуру зрительной коры7.
Здесь мы приводим основные этапы протокола и подчеркнуть важные параметры, которые должны контролироваться добиться постоянно высокого качества цинка пятнать. Один может потребоваться оценить изменения в уровнях синаптических цинка в другие сенсорные и моторные коре или подкорковых структур в других животных, модель. Количественная информация что денситометрическиханализ обеспечивает в этом метод может быть выгодным для следующих корковых развития во времени и возможно выявление развития разнопрофильных уровней синаптических цинка среди различных мозга (как мы показали ранее17). Важным соображением является вопрос развития и соответствующего возраста животных для изучения. Синаптических цинка гистохимии показывает четко определенных визуальных корковых областях в хорьки и могут служить полезным руководством в дальнейших исследованиях корковых Организации и функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана субсидии от национального центра для исследования ресурсов (2G12RR03060-26A1); Национальный институт здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения (8G12MD007603-27) от национальных институтов здоровья; Профессиональный персонал конгресс Сити университета Нью-Йорка (PSC-CUNY); и факультет исследований Грант (ФРГ II) американский университет в Шардже. Мы благодарим Видьясагар Sriramoju за представление нам этих методов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
