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Neuroscience

Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto

Published: October 29, 2017 doi: 10.3791/56547
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, Chemistry and Environmental Sciences, American University of Sharjah, 2Department of Biology, The City College of New York

Summary

Describimos un procedimiento histoquímico que revela características zinc laminar y areal manchas patrones en regiones diferentes del cerebro. El patrón de coloración de zinc puede utilizarse en conjunto con otros marcadores anatómicos distinguir confiablemente las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos.

Abstract

Caracterización de la organización anatómica y funcional del cerebro y desarrollo requiere la identificación precisa de circuitos neuronales distintos y regiones en el cerebro inmaduro y adulto. Aquí describimos un procedimiento de tinción histoquímica de cinc que revela las diferencias en los patrones de tinción entre los diferentes estratos y regiones del cerebro. Otros han utilizado este procedimiento no sólo para revelar la distribución de las neuronas que contienen cinc y circuitos en el cerebro, sino también para delinear correctamente límites areal y laminares en el cerebro en desarrollo y adultos en varias especies. Aquí ilustramos esto procedimiento con imágenes del desarrollo de la coloración y los cerebros de adultos ferret. Revelan un patrón de coloración de zinc que sirve como un marcador anatómico de las zonas y capas y puede usarse confiablemente para distinguir áreas visuales corticales en la corteza visual en desarrollo y adultos. El objetivo principal de este protocolo es presentar un método histoquímico que permite la identificación exacta de las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos donde otros métodos no lo hacen. En segundo lugar, en combinación con el análisis densitométrico de la imagen, este método permite evaluar la distribución de zinc sináptica para revelar posibles cambios a lo largo de desarrollo. Este protocolo describe en detalle los reactivos, herramientas y pasos necesarios para teñir sucesivamente secciones del cerebro congelado. Aunque este protocolo es descrito usando tejido de cerebro de ferret, fácilmente puede ser adaptado para su uso en roedores, gatos o monos, así como en otras regiones del cerebro.

Introduction

Manchas histológicas se han utilizado tradicionalmente para ayudar en la identificación de áreas corticales en varias especies por revelar las diferencias en características arquitectónicas. El uso combinado de técnicas histoquímicas como gránulos de Nissl, citocromo oxidasa (CO) reactividad o mielina puede resultar fructífero como revelan límites áreas similares en el cerebro adulto. Sin embargo, estas manchas histoquímicas no revelan siempre adecuadamente límites claros entre áreas corticales y las capas del cerebro inmaduro.

En el sistema nervioso central, zinc tiene varias funciones esenciales que incluyen estabilización de la estructura del ADN, actuando como un cofactor enzimático, participa en numerosas funciones reguladoras y actúan como un neuromodulador a través de su presencia en vesículas sinápticas 1. zinc sináptica es única ya que puede visualizarse mediante métodos histológicos, mientras que el cinc protein-bound se puede visualizar2. Esta característica ha sido aprovechada para revelar el patrón de cinc sináptica en diferentes regiones corticales, e histoquímica de zinc sináptica se ha utilizado en varios estudios. Un subconjunto de neuronas glutamatérgica en la corteza cerebral contiene zinc en las vesículas presinápticas en su axon terminales3,4. Estudios histoquímicos han revelado una distribución heterogénea de zinc sináptica en la corteza cerebral5,6,7. Parece haber una distribución areal y laminar diferentes de zinc histochemically reactiva en diferentes regiones corticales (p. ej., visual y Corteza somatosensorial), o en capas (por ejemplo, los niveles de zinc en el supragranular y infragranular capas de la corteza visual primaria son substancialmente más altas que en la capa de entrada talamocorticales IV con niveles relativamente bajos de zinc sináptica)5,8,9. La heterogeneidad en zinc sináptica la coloración observada en la corteza es especialmente ventajosa como facilita la identificación areal y laminar.

Aquí presentamos una descripción detallada de un procedimiento histoquímico de zinc sináptica, que es una versión modificada del Danscher 1982 método10. Este método utiliza selenio inyectado por vía intraperitoneal (IP) en los animales como un agente quelante. La selenita viaja al cerebro a reaccionar con piscinas de zinc libre encuentran en las vesículas de un subconjunto de las sinapsis glutamatérgica en el cerebro. Esta reacción produce un precipitado que se puede ampliar posteriormente el desarrollo plata2,10,11.

Este procedimiento revela patrones laminares y areal de tinción sináptica zinc. Análisis densitométricos pueden utilizarse para evaluar estos patrones cualitativa y cuantitativamente en el cerebro adulto y no maduro para estudiar efectos de otras intervenciones, como manipulaciones sensoriales, ambientales, farmacológicas o genéticas. Además, uno también puede desear evaluar potenciales cambios de desarrollo en la distribución de zinc sináptica en otras estructuras corticales o subcorticales en otros sistemas del modelo. La información cuantitativa que proporciona análisis densitométrico en este método puede ser ventajosa para el siguiente desarrollo del cerebro en el tiempo. Este protocolo proporciona un compañero y otras inmuno - marcadores histoquímicos para revelar los límites laminares y areal.

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Protocol

el siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales establecidas por el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Nueva York, que se ajustan a todos los estado adecuado y las pautas federales. Anestesia es apropiada para hurones y debe modificarse según la especie estudiada.

Figure 1
figura 1: esquematización de los pasos más importantes en las 3 fases de este protocolo de diagrama de flujo y el tiempo requerido para completar cada paso. Períodos que requieren secciones se seque por completo se muestran en los círculos de texto verde, mientras que todos los otros pasos son en círculos de texto blanco. El cuadro de texto en forma de diamante verde es un punto de decisión, mientras que el rectángulo rojo es un paso crítico y debe realizarse con mucho cuidado. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. pasos preparatorios (Deslice sustituía y solución hacer)

  1. Lave unsubbed diapositivas con un detergente en agua caliente y enjuague varias veces en agua tibia con un enjuague con agua destilada para eliminar completamente la suciedad o los residuos. Deje que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente o en estufa a 37 ° C.
  2. Una vez que las diapositivas estén completamente secas, capa una capa uniforme de huevo en cada diapositiva usando los dedos o un pincel. Deje que se seque en el horno a 60 ° C durante 20-30 min. Para obtener resultados óptimos y evitar deslizamiento de secciones, añadir una segunda capa de clara de huevo y deje que se seque una vez más en el horno a 60 ° C.
  3. Preparar una solución de gelatina 1% disolviendo 1 gramo de gelatina en 100 mL de agua caliente (60 ° C) y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
  4. Preparar 200 mL de solución de revelado, como se describe a continuación para el uso en la sección 4.
    1. Solución de goma arábiga preparar añadiendo lentamente 40 g en incrementos de 120 mL de agua caliente (que se disuelve más fácilmente de esta manera). Seguir a agitar la solución con un vaso, varilla de agitación. Una vez que la solución se ha disuelto completamente, retire del fuego y deje que se enfríe durante unos minutos, luego filtrar a través de 6-8 capas de tela de gasa en un embudo de.
    2. Preparar citrato buffer agregando 5,04 g ácido cítrico más 4,7 g citrato de sodio en 20 mL dH 2 O y disolución de la mezcla. Asegurar que el pH de esta solución es 4.0 a 25 ° C. ajustar el pH si es necesario mediante la adición de hidróxido de sodio o ácido clorhídrico a la solución.
    3. Preparar la solución de hidroquinona 30 mL dH 2 O de la calefacción y disolver 1,7 g de hidroquinona.
      Nota: Calentar la solución de hidroquinona es esencial para permitir que se disuelva fácilmente en agua como la hidroquinona no es fácilmente soluble en agua a temperatura ambiente. Tenga cuidado de mantener la temperatura del agua inferior a 60 ° C, de lo contrario la hidroquinona puede ser oxidada. Si la solución se vuelve amarilla, descartar y preparar otra solución fresco.
    4. Preparar plata lactato solución disolviendo 0,22 g en 30 mL de dH 2 O.
    5. Mezclar las soluciones (1.4.1 - 1.4.4) en el orden en el que se describen cuando esté listo para llevar a cabo las reacciones (es decir, después de corte, secado y fijación) ( figura 2). Añadir la solución de lactato de plata en el final. Asegúrese de que este paso se completa rápido y la solución de revelado se coloca en la oscuridad hasta que es hora de reaccionar las secciones como lactato de plata es fotosensible.

Figure 2
figura 2: esquema que ilustra la secuencia de pasos necesarios para mezclar los reactivos en la fase de histoquímica de zinc del protocolo. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. anestesia y tratamiento del animal

  1. antes de SEDAR al animal, preparar una solución de 1% sodio selenito (Na 2 SeO 3) disolviendo 10 mg de selenito de sodio en 1 mL dH 2 O.
  2. Anestesiar al animal con una inyección intramuscular de ketamina (25 mg/kg) y xilacina (2 mg/kg).
    Nota: Asegúrese de que un nivel adecuado de anestesia se logra mediante el uso de la respuesta refleja pedal.
  3. Inyectar zinc solución de selenito de sodio quelante (15 mg/kg) por vía intraperitoneal (IP).
    Nota: Puede variar la toxicidad del selenito de sodio en diferentes edades o en otras especies.
  4. Permiten 60 a 90 min de la selenita de sodio viajar al cerebro. Durante este periodo, es imperativo asegurarse de que el animal está adecuadamente sedado y no responde, así que Compruebe la profundidad de la anestesia cada 5 minutos
  5. Durante el período de selenio, mientras que el animal está anestesiado, asegúrese de que los ojos se cierran para evitar la sequedad, o administrar pomada oftálmica para mantenerlos húmedos.

3. Preparación de tejido y tinción

  1. eutanasia a los animales mediante la administración de una sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p).
  2. Realizar transcardial perfusión con solución salina normal durante 1 minuto y con paraformaldehído al 4% durante 20 minutos por último, administrar una solución de sacarosa al 4% paraformaldehido y 10% (un período de fijación total de 1 h).
  3. Quitar la cabeza con un par de tijeras grandes.
  4. Hacer una incisión de línea media con bisturí de la nariz en el cuello para exponer el cráneo.
  5. Cuidadosamente quitar el cerebro y los hemisferios se separan con una hoja de.
  6. Bloquear la parte posterior del cerebro y postfix en paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato de 0,1 M (PB) durante varias horas.
  7. Colocar los bloques en una solución de sacarosa de 30% en PB 0.1m y permitir que el cerebro a.
    Nota: Sustituir la solución de sacarosa 4% paraformaldehido y 30% con solución de sacarosa al 30% en PB 0.1m para hundir el cerebro limita el cerebro ' s exposición a paraformaldehido como esto puede afectar calidad de tinción del tejido.
  8. Una vez que el cerebro se hunde, corte semi-tangencial secciones de espesor de 40 μm a través de la corteza visual o región de interés en un micrótomo de congelación, resbalando o criostato. Esto puede lograrse colocando el bloque con el medial superficie abajo y suavemente aplana con un portaobjetos de cristal.
  9. Recoger las secciones con un pincel y un almacén en una caja que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  10. Separar las secciones en serie numerada separada. Inmediatamente montar una o dos series de secciones del cerebro en portaobjetos subbed huevo (sección 1), permita que seque durante la noche a temperatura ambiente y procesar secciones histochemically para zinc sináptica.
    Nota: Otras series pueden procesarse para otros marcadores para la comparación, como mielina 12 o citocromo oxidasa utilizando el protocolo modificado 13: incubar durante 2-8 h a 40 ° C con 3% de sacarosa, 0.015% citocromo C, catalasa de 0.015% y 0.02% diaminobenzidina en 0,1 M de PB. Sustancia de Nissl puede usarse también como un marcador histológico para distinguir áreas corticales visuales. Estas otras manchas histológicas no requieren que secciones del cerebro están montadas en portaobjetos subbed de clara de huevo, así que las diapositivas de la tradicional gelatina recubierto pueden utilizarse en su lugar.

4. Histoquímica de Zinc sináptica

  1. fijar secciones diapositiva montada en alcohol absoluto durante 15 minutos y déjelo para secar completamente a temperatura ambiente durante 1 h.
    2. < lYo > sumerja brevemente las secciones de 10 s en una solución de gelatina 1% (sección 1) y deje que se seque durante la noche a temperatura ambiente.
    Nota: Para obtener resultados óptimos permiten secciones secas durante la noche. Permitiendo que las secciones que seque durante la noche produce tinción de tejido mejor.
  2. Mezclar las soluciones como se describe en paso 1.8 en cuanto secciones están listas para reaccionar.
    1. Reaccionar las secciones por organizar las diapositivas al lado en un vaso o bandeja de plástico y verter la solución en desarrollo sobre las diapositivas. Verificar que diapositivas estén completamente sumergidas en la solución y transfiera la bandeja en un espacio oscuro o cubren con una caja de luz-apretado.
      Nota: Una bandeja de plástico que es de aproximadamente 12 pulgadas de largo por 8 pulgadas de ancho se puede utilizar, que adapta exactamente 18 diapositivas. Un volumen total de solución de revelado de 200 mL es suficiente para sumergir completamente el portaobjetos, así garantizar que el volumen correcto es el número de diapositivas a reaccionar y ajustar en consecuencia la receta. Uso de una bandeja de plástico o vidrio en lugar de utilizar una bandeja de metal es recomendable algún grado de reactividad entre el lactato de plata en la solución de revelado y la plancha cruzada u otros metales encontrados en las bandejas del metal.
  3. Controlar el desarrollo de la reacción mediante la inspección visual de las secciones cada 30 minutos. Las secciones generalmente requieren 120-180 min de desarrollo completo.
  4. Si las secciones se convierten en overstained (ver figura 3a), distinguir en el 2% agricultor ' solución de s (9 piezas 2% tiosulfato de sodio en dH 2 O y 1 parte 2% Ferricianuro de potasio en dH 2 O) durante 1-2 minutos
    Nota: Sección de la muestra que se tiñe mal se muestra en la figura 3b.
  5. Una vez lograda la intensidad deseada, terminar la reacción quitando la diapositiva montar las secciones de la bandeja y colocar las diapositivas en una parrilla.
  6. Coloque la parrilla en un vaso grande plato de tinción y lavar los portaobjetos en caliente (40-50 ° C) chorro de agua durante 10 minutos quitar la capa de gelatina y el depósito externo de la plata.
    Nota: Tenga cuidado de no agitar la parrilla para evitar que las secciones resbale. La intensidad deseada de la sección se logra cuando la suficiente variación laminar es evidente y las secciones son bastante oscuro pero no overreacted (ver figura 4a).
  7. Deje que los portaobjetos secar a temperatura ambiente y luego deshidratar en un 100% EtOH (5 min), claro en el xileno (5 min) y cubreobjetos con un medio de montaje. Como alternativa, coloque los portaobjetos en una serie ascendente de alcohol y deshidratar, claro y cubreobjetos de.
  8. Secciones de uso de los animales sin tratamiento previo con selenita para servir como un control negativo. Amplificación de la plata de estas secciones no debe producir ninguna coloración.

Figure 3
figura 3: zinc sináptica manchas en el cerebro del hurón juveniles. Microfotografías de las secciones manchadas de zinc semi tangenciales a) overstained y b) understained en el cerebro del hurón juvenil. Areal límites son difíciles de discernir como carece de variación laminar. Materia blanca es también pesadamente manchada. Ssy Suprasylvian corteza, blanco WM importa, un anterior, D dorsal. Barra de escala = 500 μm (a-b). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. distinguir límites Areal y adquisición de imágenes

  1. uso arquitectónicos características de regiones diferentes del cerebro para identificación areal y laminar.
    Nota: por ejemplo, en el desarrollo rata retrosplenial corteza 14, los autores revelaron una modularidad transitoria caracterizada por la coloración fuerte de zinc, que no está presente en el adulto, pero podría utilizarse para describir cortical Organización durante el desarrollo de esta especie. En otro estudio 15, los autores revelaron la especificidad en la distribución de zinc sináptica de diferentes núcleos en la amígdala de monos macacos, que facilitan la identificación de estas divisiones. Áreas visuales corticales en el cerebro en desarrollo y adulto de hurón han sido previamente descritos 16 , 17 , 18, subdivisión arquitectónica del neocórtex en la ardilla gris fueron descritos 19. Por otra parte, histoquímica de zinc fue utilizada previamente para distinguir entre áreas en el adulto mono corteza visual 8 y desarrollo adulto gato corteza visual 5, desarrollando la corteza somatosensorial de la rata 9 , 20 y ratón adulto Corteza somatosensorial 6 , 21. Si está disponible, comparar el patrón de coloración en la mielina, teñido, citocromo oxidasa (CO) teñido y sináptica zinc manchado secciones del cerebro, para confirmar los límites areal en el adulto. En secciones semi-tangenciales de ferret corteza visual tinción sináptica zinc, hay importantes diferencias entre áreas corticales visuales que facilitan la identificación areal. Por ejemplo, las áreas 17 y 18 de la ferret adultos revelan que tinción sináptica zinc es alta en las capas III y V. capa VI se tiñe menos intensamente, mientras que la capa IV casi carece de zinc. La visible falta de coloración en la capa IV o contrastes de zonas 17 y 18 con la banda oscuro manchada de zinc encontrado en la capa que IV en CO secciones manchadas. Sin embargo, la capa IV de la zona 17 en CO secciones manchada mantiene un borde afilado con capas III y V, pero capa IV en la zona 18 se caracteriza por una sutil disminución de la intensidad de la tinción y su límite superior se encuentra en la capa III es menos distinguible.
  2. Examinar las secciones mediante microscopía brightfield con un objetivo de baja potencia (2 X ó 4 aumentos) y áreas de interés.
  3. Mejora de contraste y brillo de microfotografías usando software de procesamiento de imagen. Imágenes obtenidas por mediciones de densidad óptica no deben ser alteradas en cualquier forma.

Figure 4
figura 4: zinc sináptica manchas en el cerebro del hurón adulto distingue áreas corticales visuales diferentes. Microfotografías de las secciones adyacentes y tangenciales mancharon para (un) sináptica cinc o (b) citocromo oxidasa (CO en el adulto). Las flechas marcan límites areal. Ssy Suprasylvian corteza, un anterior, D dorsal. Barra de escala = 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. densitometría (opcional)

Nota: Densitometric análisis pueden utilizarse para evaluar la distribución de zinc sináptica en el cerebro mediante la medición de la densidad óptica de zinc representante manchada las secciones en las regiones de interés. Este método también es útil para el seguimiento de posibles cambios en los niveles de zinc sináptica a lo largo del desarrollo.

  1. Uso seleccionado zinc-las secciones manchadas, elegir al azar columnas corticales (columnares microfotografías) de la anchura adecuada (puede utilizarse una columna ancho 450 μm) microfotografías adquiridos de la región de interés. Una columna cortical es una región que abarca todas las capas corticales de la superficie pial de la materia blanca.
  2. Elegir un número apropiado de columnas muestra varias secciones de la cerebral diferente en cada región de interés.
  3. Transferencia de imágenes de muestra de las columnas representativas en una software de procesamiento de imagen.
  4. Utilizar la herramienta de selección rectangular para abarcar toda la columna cortical.
  5. Utilizar la herramienta invertir para crear una imagen invertida similar a un negativo fotográfico de la columna de.
    Nota: Inversión de contraste de las imágenes se realiza para obtener alta densidad óptica valores para los niveles de cinc sináptica alta y baja densidad óptica para bajos sináptica niveles de cinc. Esta es una manera más intuitiva para hacer trama perfil gráficos similares a los vistos en la figura 5.
  6. Producir perfiles de densidad óptica de estas imágenes mediante la herramienta de Perfil de terreno para generar un gráfico bidimensional de las intensidades de los píxeles a lo largo de una línea.
  7. Opciones de parcela de uso para convertir el gráfico de Perfil de trama en un perfil vertical y haga clic en diagrama de perfil una vez más.
    Nota: La distancia de eje x representa a lo largo de la línea y el eje y representa la intensidad del pixel. Por lo tanto, cada valor de Perfil de trama refleja el valor promedio de escala de grises en cada profundidad a lo ancho de la columna de.
  8. Valores de Perfil de trama abierta como archivos de texto en la hoja de cálculo, normalizar y trazar como gráficos (ver figura 5).
    Nota: Es recomendable usar la densidad relativa de zinc sináptica para comparación de mediciones cuantitativas que resultados pueden confundirse por la variación en la intensidad de la tinción total como resultado de diferentes tiempos de reacción, stainability del tejido, así como otros variables.
  9. Calcular la densidad relativa de zinc realizando primero un promedio de vagón de carga de los valores de Perfil de terreno para suavizar los datos.
    Nota: Esto se logra con un promedio de, por ejemplo, cada píxeles de 20 o 30 sucesivas (1 pixel = 2.5 μm) en profundidad y luego normalizar a intensidad máxima para cada muestra. Por lo tanto, cada valor de Perfil de parcela promedio refleja el valor de escala de grises promedio a esa profundidad (escala de grises valores van de 0 a 255). Puede utilizarse un método de normalización diferentes por primera adquisición valores de densidad óptica (WM) de la materia blanca de regiones muestra que la materia blanca subyacente en las áreas de interés. Lo ideal sería elegir varias regiones que se tiñen tan suavemente como sea posible para obtener una media valor WM. Valores de densidad óptica media son entonces divididos por valores para obtener valores normalizado WM WM.
  10. Determine significa valores de densidad óptica en capas específicas de las regiones de interés para comparaciones cuantitativas.
    Nota: por ejemplo, el valor de densidad óptica mínima media en la capa IV de áreas corticales visuales del hurón se determinan por la cobertura de la región menos manchada por píxeles de ±5.
  11. Densidad óptica media de calcular los valores en las capas supragranular y infragranular de áreas corticales visuales del hurón por que abarca la región más oscura manchada ±5 píxeles para determinar el valor máximo medio.
  12. Asegúrese de que los valores de densidad óptica obtenidos de capas particulares.
    Nota: Es imprescindible para verificar los límites de estas capas en las imágenes de contraste invertido mediante la comparación de las microfotografías originales así como la sección adyacente de la CO. Esto garantiza que uno no se entrometen en las capas adyacentes.

Figure 5
figura 5: distribución Laminar de zinc sináptica en diferentes visual cortical áreas en el hurón adulto. Microfotografías representativas de las columnas a través de todas las capas corticales con perfiles correspondientes de densidad óptica normalizada en un adulto. Densidad bajo zinc sinápticos en la capa IV de adultos áreas 17 y 18 se indica por el canal en la trama de perfil. En el perfil de cada parcela, óvalos rellenos en la depresión de la capa IV indican los valores utilizados para determinar el valor de la intensidad de píxeles mínimo promedio. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Los pasos principales implicados en este protocolo de tinción de secciones del cerebro para zinc sináptica se presentan en un diagrama de flujo en la figura 1. El protocolo puede dividirse en tres fases: 1) perfusión y colección de tejido, preparación de tejido 2) coloración e histoquímica 3) Zinc. Brevemente, durante la primera fase del Protocolo, el animal está anestesiado e inyectado IP con la dosis apropiada de selenito de sodio. Después de un período de tiempo suficiente (ideal 60-90 min), el animal es posteriormente sacrificado, perfundidos con solución de NaCl al 0.9% siguió por una solución de paraformaldehído al 4%. La cabeza es decapitada y el cerebro se elimina rápidamente de la calavera. El cerebro entonces puede hundirse en un paraformaldehído al 4% y el 30% solución de sacarosa como crioprotector. En la segunda fase del Protocolo, las secciones congeladas son cortadas en un micrótomo de deslizamiento en 40 μm en tampón fosfato salino (PBS) y separadas en serie numerada. Es importante instalar secciones en portaobjetos subbed huevo inmediatamente después de la sección, dejando las secciones secas durante la noche para obtener resultados óptimos. Gelatina subtitulada diapositivas no se recomiendan como el sulfato de potasio de cromo normalmente se usa en la solución de subtitulación cross-reacts con el lactato de plata, llevando así a la coloración subóptima. Las secciones entonces se incuban durante 15 min en alcohol absoluto y se dejó secar completamente a temperatura ambiente. Este paso es seguido por una breve inmersión de las secciones montadas en la solución de gelatina 1% preparada antes de tiempo y deja secar durante la noche para obtener resultados óptimos. En la última fase del Protocolo (histoquímica de zinc), la solución de revelado está preparada según los pasos descritos en la sección de métodos, y diapositivas se colocan en una bandeja de plástico o de vidrio sumergida en la solución. El desarrollo de la mancha por lo general demora entre 2-3 h, pero la inspección visual minuciosa es necesaria para evitar overstaining las secciones. Cuando se alcanza la intensidad adecuada, diapositivas deben eliminados, colocados en una parrilla y enjuagar en agua tibia durante 5-10 min eliminar el depósito exterior de plata. Las secciones se pueden luego secadas a temperatura ambiente, despejado y coverslipped. Un esquema de los pasos específicos necesarios para completar la fase de histoquímica de zinc del Protocolo se muestra en la figura 2.

Este protocolo utiliza histoquímica de zinc sináptica para revelar la variación areal y laminar en los niveles de coloración entre áreas corticales visuales en el cerebro del hurón. Este protocolo puede ser adaptado para su uso en otras especies, así como en otras regiones del cerebro. Por ejemplo, los investigadores estudian otras cortezas sensoriales tales como la corteza somatosensorial, auditiva o frontal del hurón o cualquier otro sistema de modelo beneficiaría grandemente mediante esta tinción histoquímica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona transiciones claras entre áreas para facilitar la identificación areal en adultos así como confiablemente diferenciar áreas corticales en pequeños animales como roedores, hurones, gatos y monos.

Figura 3a muestra un ejemplo de un cinc sección manchada que inadvertidamente desarrollados para demasiado largo y así fue overstained en el proceso. Tejido overstained se caracteriza por un color marrón muy oscuro, falta de variación laminar y pesadamente manchadas de materia blanca. Sin embargo, secciones del cerebro teñidos de zinc a veces pueden ser understained como se muestra en la figura 3b. Secciones understained a veces pueden ocurrir si el animal no sobrevivió para una cantidad suficiente de tiempo (por lo menos 60 min), que impide que todo el selenio inyectado viaja al cerebro. Understaining del tejido también puede ocurrir si la selenita no se administró adecuadamente y por lo tanto no viajar al cerebro.

En una sección semi-tangencial representante en la figura 4ase muestra la distribución heterogénea de zinc sináptica tinción en múltiples áreas corticales visuales en un hurón adulto. Las flechas señalan límites areal. En las zonas 17 y 18, la intensidad de la tinción de zinc sináptica es generalmente alta en las capas I, II, III y V y bajo en la capa IV (capa thalamorecipient) y moderada en la capa VI. La presencia de una transición claramente identificable entre las zonas 17 y 18 es evidente en la figura 4a. Capa IV intensidad tinción en zona 18 aumenta ligeramente y capa V disminuye y es de intensidad variable. Figura 4b es una sección adyacente manchada para la citocromo oxidasa (CO) que ilustra los lugares similares de areal límites que observamos con la mancha de zinc. Regiones de las zonas 17 y 18 que tienen altos niveles de zinc generalmente parecen tener niveles bajos de CO la coloración.

La distribución de zinc sináptica en zonas 19 y 21 es cualitativamente similar en que ambas áreas tienen menos laminar variación que en las áreas 17 y 18. Capa IV zonas 19 y 21 es claramente diferente de la capa IV en las áreas 17 y 18 que moderadamente manchas. Las capas supragranular y infragranular del área 19 son de similar intensidad y capa V manchas ligeramente más oscura. Zona 21 tiene una distribución de zinc sináptica comparable al en zona 19. Sin embargo, capa VI de la zona 21 se caracteriza por mayores niveles de zinc sináptica que capa IV del área 19. Capas de VI y IV de Suprasylvian (Ssy) parecen ser moderadamente teñido y son de intensidad comparable, mientras que la capa V se caracteriza por mayores niveles de zinc sináptica y las capas supragranular están marcadas por un patrón fluctuante de los niveles de cinc sináptica.

Evaluación cuantitativa de la distribución de zinc sináptica en regiones diferentes del cerebro, con diferentes tratamientos, o en diferentes edades, se puede lograr, si así lo desean. Por ejemplo, uno puede evaluar cambios en la distribución de zinc sináptica en los adultos o a través del desarrollo en primaria visual, auditivo y cortezas somatosensoriales en cualquier modelo de sistema. Usando análisis densitométricos, previamente demostramos que la distribución de zinc sináptica en múltiples áreas visuales (17, 18, 19, 21 y Suprasylvian) del cerebro en desarrollo de ferret, disminuyendo significativamente de cinco a seis semanas de edad17. Aquí describimos los pasos necesarios para evaluar las diferencias en la distribución de zinc sináptica en muestras representativas de un hurón adulto para ilustrar el proceso. Estos pasos pueden ser seguidos para seguimiento de los cambios en la distribución de zinc sináptica en corteza visual ferret juvenil así como en otras regiones las especies o el cerebro. La figura 5 muestra representativas columnares Microfotografías de secciones del cerebro adulto de histoquímica de zinc junto con sus perfiles de terreno complementarios densidad óptica normalizada. Se obtuvieron parcelas normalizados de los valores de densidad óptica para reflejar los cambios según profundidad cortical. Por lo tanto, cada valor de Perfil de trama refleja el valor promedio de escala de grises a profundidades corticales consecutivos. Por ejemplo, las áreas 17 y 18 se caracterizan por una notable disminución de zinc coloración en la capa IV (representado por el canal), que es evidente en sus perfiles de terreno. Significa llenar en óvalos negros indican valores de densidad óptica mínima en las áreas 17 y 18. El zinc baja coloración observada en la capa IV de contrastes de las zonas 17 y 18 con el único un sutil baño de zinc los niveles en las zonas 19, 21 y Ssy. Colectivamente, las zonas 19, 21 y Ssy son cualitativamente diferentes a las áreas 17 y 18 niveles de zinc en todas las capas es más homogéneo que en las zonas 17 y 18. Por otra parte, la capa V de las zonas 17 y 18 y capas supragranular típicamente tiñen más intensamente que la capa VI.

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Discussion

El presente estudio emplea una técnica histoquímica basada en una versión modificada de la Danscher (1982) método10, por el que localización sináptica cinc puede ser detectado y visualizado en el cerebro. Esencialmente, este método funciona mediante la inyección el animal con el selenito de sodio quelante cinc (Na2SeO3) (15 mg/kg). Después de la inyección, la selenita viaja al cerebro y se une al zinc libre que se localiza en las vesículas presinápticas de zinc que contienen las neuronas. Los iones de zinc Unidos a moléculas dentro de vesículas sinápticas precipitado y posteriormente se pueden visualizar a través del desarrollo físico2,11. Plata del sulfuro de la original Timm tinción fue pensada para detectar y visualizar una serie de metales pesados tales como Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni y Zn en tejido biológico22. El agente quelante que se utiliza para este método es sulfuro del sodio. Por lo tanto, un problema importante con el uso de método de sulfuro de Timm es la falta de especificidad como cualquier metal que puede ser transformado en un sulfuro de metal podría ser amplificada por el desarrollo físico de la plata. Sin embargo, la versión modificada del método Danscher que se utiliza en el presente estudio es específica para zinc y sin metales pesados. Hay varias diferencias entre el método de Danscher 1982 y el presente método que se describe en este estudio. Método de Danscher utiliza tejido cerebral interpretaciones frescas mientras utilizamos tejido congelado. Danscher también utiliza glutaraldehído para la perfusión, mientras que utilizamos el paraformaldehido es más compatible con inmunohistoquímica y otros marcadores histológicos que nos mancha rutinariamente para en nuestro laboratorio. Danscher también utiliza procedimientos poststaining como azul de toluidina (1%), que no realizamos en nuestro método.

Una limitación de la técnica actual es la imprevisibilidad asociada con la tolerancia de selenito de sodio por los animales. Nos encontramos con que después de administrar el selenito de sodio, a veces los animales no sobreviven más de 30 minutos. Esta situación plantea un problema que no permite suficiente tiempo para que la selenita viajar al cerebro, y posterior desarrollo de secciones del cerebro típicamente lleva a tinción de tejido desigual. Otra limitación potencial está relacionado con la adecuada administración de la inyección intraperitoneal de selenito de sodio. Uno debe tirar de la piel por encima de la cavidad abdominal inferior y coloque el lado de bisel de la aguja hacia arriba en un ángulo de 15-20 grados, penetrando sólo la pared abdominal. La aguja debe ser retirada un poco para asegurar que no se han penetrado en los órganos abdominales y material no ha sido aspirado. La aguja debe ser eliminada y sustituida si esto ocurre.

Para garantizar la reproducibilidad y resultados de tinción de alta calidad, recomendamos las siguientes medidas de precaución. Correcta administración del selenito de sodio en el tiempo del animal y maximizar la supervivencia del animal (60 a 90 min es óptimo) antes euthanizing, son fundamentales para garantizar el tiempo suficiente se da de la selenita a viajar al cerebro. Hemos encontrado que períodos de supervivencia más cortos (30 minutos o menos) suelen llevar a tinción de tejido desigual. Además, secciones de montaje en portaobjetos subbed huevo inmediatamente después de que el bloque de seccionamiento es un paso crítico. Dejando recién cortadas las secciones congeladas en PBS durante varios días es recomendable contra como los iones de zinc se lixivian en solución. Durante la preparación de la solución de revelado, es importante garantizar que el buffer de citrato es el pH correcto (4.0) como esta reacción es muy sensible a pequeños cambios en el pH. Además, al calentar la solución de hidroquinona es imprescindible para mantener la temperatura por debajo de 60 ° C, como calefacción adicional se oxida la solución e inhiben la mancha. Del mismo modo, sumergir brevemente las secciones de diapositivas montadas en gelatina es fundamental ya que evita que no específica la deposición de plata sobre la superficie de la sección. Sin embargo, las secciones no se deben dejar en la solución de gelatina más de 10 s como esto hará que se arrugan para arriba conduce a tinción de tejido desigual. Inspeccion periodica y visual de las secciones en la solución de revelado se recomienda desde que dejó las secciones por demasiado tiempo pueden conducir a overstaining. Esta mancha es bastante termosensible, por lo que las secciones tienden a desarrollar más rápidamente cuando la temperatura ambiente es cálida y más lentamente cuando la temperatura es más fresca. Por último, uno puede querer agitar suavemente el portaobjetos en la parrilla durante el paso de enjuague con agua tibia para facilitar la extracción de la gelatina y el depósito residual de plata de las diapositivas. Sin embargo, agitación excesiva y descuidada de secciones y enjuague los portaobjetos con agua caliente puede causar secciones se deslice fuera de las diapositivas y deben evitarse. También es importante garantizar que un control adecuado se utiliza para la medición densitométrica para hacer comparaciones cuantitativas. Uno podría potencialmente utilizar una región ligeramente manchada o no manchen como control interno. En nuestro material, utilizamos la materia blanca como un control para normalizar los valores de densidad óptica en diferentes áreas corticales visuales en todo el desarrollo. Encontramos que los valores de la materia blanca son comparables a través de diferentes edades y en el adulto17. Por lo tanto, dado que la materia blanca valores no cambian en función de la edad, la materia blanca sirve como un control válido para el análisis densitométrico.

La principal ventaja de este método es que es una tinción histoquímica simple y confiable cuya distribución puede ser usado, como otros marcadores histoquímicos, distinguir las regiones del cerebro. Sin embargo, el uso de este método histoquímico puede no ser adecuado para el estudio de ciertas poblaciones celulares (aquellos que carecen de zinc), o en animales muy jóvenes como synaptic de cinc son inicialmente bajos al nacer, como se muestra en el desarrollo de ratón somatosensorial y la corteza visual del gato5 niveles ,20. Otra ventaja de este protocolo es que puede ser utilizado en conjunto con experimentos de inyección de trazador neuroanatomical. En nuestro laboratorio, normalmente se inyecta un trazador neuronal bidireccional en la corteza visual primaria de hurones menores para el estudio de desarrollo cambios en el patrón de conectividad entre múltiples áreas de la corteza visual. Por lo tanto, animales necesitan no sólo usarse para histoquímica de zinc si los animales podrían ser aprovechados para un estudio experimental. La ventaja principal del método descrito es que puede ser adaptado para su uso en otras especies y en otras regiones del cerebro. Aunque hemos demostrado este método del tejido de cerebro de hurón, puede haber diferencias sutiles en algunos de los pasos al estudiar el tejido de cerebro de roedores, gatos o monos. Otros han utilizado con éxito este método histoquímico de cinc para ilustrar las diferencias en la coloración patrón en adulto mono corteza visual8, el desarrollo y el adulto gato corteza visual5, desarrollo de la corteza somatosensorial de rata9 , 20, ratón adulto Corteza somatosensorial6,21y adultos Parma wallaby corteza visual7.

Aquí describimos los pasos básicos del protocolo y subrayado los parámetros importantes que deben ser controlados para lograr sistemáticamente tinción de zinc de alta calidad. Uno puede evaluar los cambios en los niveles de cinc sinápticas en otras cortezas sensoriales o motores o estructuras subcorticales en los otros animales modelo. La información cuantitativa que densitométrica unnálisis proporciona en este método puede ser ventajoso para los siguientes desarrollo cortical en el tiempo y posiblemente revelando diferentes perfiles de desarrollo de los niveles de zinc sináptica entre regiones diferentes del cerebro (como anteriormente hemos demostrado17). Una consideración importante es la cuestión del desarrollo y la edad correspondiente de los animales para el estudio. Histoquímica de zinc sináptica revela áreas corticales visuales claramente identificables en hurones y puede servir como una guía útil en estudios de organización cortical y la función.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (2G12RR03060-26A1); El Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud (8G12MD007603-27) de los institutos nacionales de salud; Profesional personal Universidad de Congreso-ciudad de Nueva York (PSC-CUNY); y Facultad investigación Grant (RFA II) de la Universidad Americana de Sharjah. Agradecemos a Vidyasagar Sriramoju para introducirnos a estos métodos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Euthasol (Euthanasia solution) Henry Schein 710101
Sodium selenite Sigma-Aldrich 214485
Ketamine (Ketaved) Henry Schein 48858 100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased) Henry Schein 33198 100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Dilute to 4%
Gum arabic Sigma-Aldrich G9752-500G
Citric acid Sigma-Aldrich C1909
Sodium citrate Sigma-Aldrich W302600
Hydroquinone Sigma-Aldrich H9003
Silver lactate Sigma-Aldrich 85210
Fish gelatine Sigma-Aldrich G7765
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506 (Type III, from equine heart)
Catalse Sigma-Aldrich C10
Sucrose Domino
Xylene Fisher Scientific X5P-1GAL
Permount Fisher Scientific SP15-500
100% Ethanol Fisher Scientific A406-20 Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips Brain Research Laboratories #3660-1
Frosted unsubbed slides Brain Research Laboratories #3875-FR
Microtome American Optical Company 860
Microscope Olympus BX-60
Adope Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA To assemble images
ImageJ Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ For densometric measurements
Plastic tray Any standard plastic tray may be used to immerse slides in developer solution
Hot plate Any standard hotplate may be used

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References

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Estriar de Neurobiología número 128 neuroanatomía corteza cerebral corteza marcador anatómico método de coloración variación laminar
Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto
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Khalil, R., Levitt, J. B. Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain. J. Vis. Exp. (128), e56547, doi:10.3791/56547 (2017).

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