Summary
Biz desenleri farklı beyin bölgelerindeki boyama karakteristik Laminer ve alansal çinko ortaya çıkarır bir histochemical açıklayınız. Çinko boyama desen birlikte diğer anatomik işaretleri ile güvenilir bir şekilde katmanları ve gelişmekte olan ve yetişkin beyin bölgeleri ayırmak için kullanılan.
Abstract
Anatomik ve fonksiyonel beyin organizasyon ve geliştirme karakterizasyonu farklı sinir devreleri ve olgunlaşmamış ve yetişkin beyin bölgelerinde doğru tanımlaması gerekir. Burada biz boyama desenleri farklı katmanları ve beyin bölgeleri arasında farklılıklar gösteren bir çinko histochemical boyama açıklayınız. Diğerleri bu yordam sadece çinko içeren nöronlar ve beyin devrelerinde ortaya çıkarmak için aynı zamanda başarılı bir şekilde gelişmekte olan ve yetişkin beyninin çeşitli türlerin alansal ve laminer sınırları betimlemek için kullanılan. Burada biz bu yordamı gelişmekte olan görüntüleri ile boyama göstermek ve yetişkin yaban gelinciği beyin. Biz alanları ve Katmanlar anatomik bir işareti olarak hizmet veren bir çinko boyama desen açığa vurmak ve güvenilir bir şekilde gelişmekte olan ve yetişkin görsel korteksin görsel kortikal alanlarda ayırt etmek için kullanılabilir. Ana amacı, bu protokol katmanları ve nerede bunu yapmak için diğer yöntemleri başarısız gelişmekte olan ve yetişkin beyin bölgelerinde doğru tanımlaması sağlar histochemical bir yöntem sunmaktır. İkincil olarak, densitometric görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem bir geliştirme boyunca olası değişiklikler ortaya çıkarmak için sinaptik çinko dağılımını değerlendirmek izin verir. Bu iletişim kuralı reaktifler, araçları ve gittikçe donmuş beyin bölümleri leke için gereken adımları ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Her ne kadar bu iletişim kuralı gelincik beyin dokusu kullanılarak açıklanmıştır, kolayca kemirgenler, kedi ya da maymunlar de diğer beyin bölgeleri olduğu gibi kullanmak için adapte edilebilir.
Introduction
Histolojik lekeleri architectonic şekil farklılıkları ortaya tarafından çeşitli türler kortikal alanlarda tanımlaması yardım geleneksel olarak kullanılmıştır. Onlar yetişkin beyninin benzer alan sınırları ortaya gibi gibi histochemical teknikleri kombine kullanımı Nisl madde, sitokrom oksidaz (CO) reaktivite veya miyelin verimli kanıtlayabilirim. Ancak, bu histochemical lekeler her zaman yeterince kortikal alanlarda ve immatür beyinde katmanlar arasında net sınırlar ortaya çıkarmak değil.
Merkezi sinir sistemi çinko DNA yapısı, çok sayıda düzenleyici fonksiyonları katılan ve varlığını sinaptik veziküller ile Nöromodülatör olarak davranan bir enzim kofaktör olarak hareket sabitleme dahil çeşitli kritik işlevlere sahiptir. 1. sinaptik çinko gibi protein bağlı çinko görüntülenmeyecektir2olamaz, ancak bu histolojik yöntemlerle görüntülenmeyecektir benzersizdir. Bu özellik sinaptik çinko desen farklı kortikal bölgelerde ortaya çıkarmak için istismar ve sinaptik çinko histochemistry çalışmalar bir dizi olarak kullanılmıştır. Bir alt glutamatergic nöronların serebral korteks içinde onların akson terminalleri3,4presynaptic veziküller içinde çinko içerir. Histochemical çalışmalar sinaptik çinko serebral korteks5,6,7heterojen bir dağıtım indirdik. Farklı bir alan ve laminer dağıtım farklı kortikal bölgelerde (örneğin, karşı somatosensor korteks görsel) veya katmanları histochemically reaktif çinko gibi görünüyor (örneğin, supragranular çinko düzeyleri ve Primer görsel korteks katmanların infragranular önemli ölçüde thalamocortical giriş katmanında IV nispeten düşük sinaptik çinko düzeyleri daha yüksek)5,8,9. Alansal ve laminer kimlik kolaylaştırır gibi korteks gözlenen sinaptik çinko boyama içinde heterojenite özellikle avantajlıdır.
Burada ayrıntılı bir açıklama Danscher'ın 1982 yöntemi10değiştirilmiş bir sürümü bir sinaptik çinko histochemical yordam mevcut. Bu yöntem intraperitoneally enjekte selenit (IP) hayvana şelat bir ajan olarak kullanır. Selenit glutamatergic sinapslar kümesini veziküller içinde beyinde bulunan ücretsiz çinko havuzlu tepki beyin gitmektedir. Bu reaksiyon daha sonra gümüş geliştirme2,10,11tarafından geliştirilmiş bir çökelti verir.
Bu yordamı sinaptik çinko boyama Laminer ve alansal desenler ortaya koymaktadır; densitometric analiz bu desenler duyusal, çevre, farmakolojik veya genetik manipülasyon gibi diğer müdahaleler etkilerini incelemek için yetişkin ve olgunlaşmamış beyinde hem nitelik hem de nicelik değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bir de diğer modeli sistemlerinde olası gelişimsel değişiklikleri diğer kortikal veya subcortical yapılarda sinaptik çinko dağılımında değerlendirmek isteyebilirsiniz. Bu yöntemde densitometric çözümlemesi sağlayan nicel bilgi zaman içinde aşağıdaki beyin gelişimi için yararlı olabilir. Bu iletişim kuralı Laminer ve alansal sınırlarını ortaya çıkarmak için bir arkadaşı diğer immün ve histochemical işaretleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki iletişim kuralı tüm uygun devlet ve federal yönergelere uygun kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), City College of New York, tarafından kurulan hayvan bakımı kuralları izler. Anestezi yaban gelinciği için uygundur ve okudu türler göre değiştirilmemelidir.
Resim 1: Bu Protokolü 3 aşamada önemli adımları özetleyen akış çizelgesi ve her adımı tamamlamak için gereken süre. Tüm diğer adımları beyaz metin çevrelerde ise tamamen kurumasını bölümleri gerektiren dönemler yeşil metin çevrelerde gösterilir. Kırmızı dikdörtgen kritik bir adımdır ve ekstra bakım ile gerçekleştirilmesi gereken bir karar noktası, yeşil elmas şeklindeki metin kutusudur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
1. hazırlık adımları (slayt hastanesinden geçici görevle geldiğinizi ve çözüm yapma)
- sıcak suda unsubbed slaytlar arasında olan bir deterjan ile yıkayın ve iyice birisi kir ya da enkaz kaldırmak için distile su durulama ile takip sıcak suda durulayın birkaç kez. Slaytlar, oda sıcaklığında veya 37 fırında kuru izin ° C. Slaytlar tamamen kuru bir kez
- Katman Sarısız ince bir hatta kat parmak ya da bir fırça kullanarak her bir slayt üzerinde. 20-30 dk 60 ° C fırında kuru olanak sağlar. En iyi sonuçlar için ve bölümleri kapalı kaymasını önlemek için yumurta akı ikinci bir kat eklemek ve bir kez daha 60 fırında kuru izin ° C.
- % 1 jelatin çözüm 1 gram jelatin sıcak su (60 ° C) 100 ml çözülerek hazırlamak ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin.
- 200 mL geliştirici çözüm bölüm 4 kullanmak için aşağıda açıklandığı şekilde hazırlayın.
- 40 g artışlarla için 120 mL sıcak su (daha kolay bu şekilde çözülür) yavaş yavaş ekleyerek hazırla sakız Arapça çözüm. Çubuk karıştırarak bir cam ile çözüm karıştırmaya devam edin. Bir kez belgili tanımlık eriyik tamamen çözülmüş, ateşten alın ve birkaç dakika için serin, daha sonra gazlı bez bir huni içinde 6-8 katmanı üzerinden filtre izin. 20 mL dH 2 içinde O 5,04 g sitrik asit artı 4.7 g sodyum sitrat ekleyip karışımı eriterek
- hazırla sitrat arabellek. Bu çözüm pH 4.0 25 olması ° C. ayarlama pH çözüm sodyum hidroksit veya hidroklorik asit ekleyerek gerekirse.
- Hazırlamak Hidrokinon çözüm 30 mL dH 2 O Isıtma ve Hidrokinon 1,7 g eriterek.
Not: Hidrokinon çözüm kadar Isıtma Hidrokinon kolayca oda sıcaklığında suda eriyen değil gibi kolayca suda erimesi izin vermek için önemlidir. 60 ° C'den suyun sıcaklığı tutmak dikkatli olun, aksi takdirde Hidrokinon okside. Çözüm sarı dönüşürse, atmak ve başka bir taze çözüm hazırlayın. - Prepare gümüş laktat 0,22 g dH 2 O. 30 mL içinde eriterek tarafından çözüm
- Mix Çözümleri (1.4.1 - 1.4.4) sırayla hangi onlar hazır olduğunda reaksiyonlar (kesit, kurutma ve sabitleme sonra Yani,) gerçekleştirmek açıklanmıştır ( Şekil 2). Gümüş laktat çözüm sonunda ekleyin. Bu adım hızlı bir şekilde tamamlanır ve gümüş laktat ışığa duyarlı olduğu gibi bölümleri tepki zamanı gelenekadar geliştirici çözüm karanlıkta yerleştirilir emin olun.
Şekil 2: katılan adımlar dizisini gösteren şematik protokol çinko histochemistry aşamasında reaktifleri karıştırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
2. hayvan tedavi ve anestezi
- hayvan, sedatif önce 10 mg sodyum selenit 1 mL dH 2 O. eriterek tarafından bir % 1 sodyum selenit (Na 2 SeO 3) çözüm hazırlamak
- Anestezi ketamin (25 mg/kg) ve xylazine (2 mg/kg) bir kas içi enjeksiyon hayvanla.
Not: anestezi uygun bir düzeyde pedal refleks yanıt kullanılarak elde edilir olun. - Enjekte çinko şelatör sodyum selenit çözüm (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
Not: Sodyum selenit farklı yaş veya diğer türler toksisite değişebilir. - 60-90 dk sodyum selenit beyne seyahat için izin. Bu dönemde, bu hayvan düzgün yatıştırıcı ve tepkisiz olduğundan emin olun, bu nedenle her 5 dk. anestezi derinliği kontrol için zorunludur
- Hayvan anestezi iken, göz kuruluğu önlemek veya onları nemli tutmak için oftalmik merhem yönetmek için kapalı selenit döneminde emin olmak.
3. Doku hazırlık ve Staining
- aşırı dozda sodyum Fentobarbital (100 mg/kg, IP) yönetmek olarak hayvan ötenazi.
- Gerçekleştirme transcardial perfüzyon normal tuzlu eriyik için 1 dk ile %4 paraformaldehyde 20 dakika süreyle ile son olarak, bir çözüm %4 paraformaldehyde ve % 10 sukroz (Toplam fiksasyon dönemi 1 h) ile yönetmek.
- Bir çift büyük makası kullanarak kafayı.
- Kafatası ortaya çıkarmak için neşterden burun boyun kullanarak bir ensizyon olun.
- Dikkatle beyin kaldırmak ve bir bıçakla hemisferlerin ayrı.
- Beynin arka tarafında engellemek ve birkaç saat için postfix içinde %4 paraformaldehyde 0.1 M fosfat tampon (PB).
- Bloklar 0.1 M PB % 30 Sükroz çözeltilerine içine yerleştirin ve batmaya beyin sağlar.
Not: beyin batmaya 0.1 M PB çözümde % 30 Sükroz ile %4 paraformaldehyde ve % 30 Sükroz çözüm yerine beyin sınırlar ' s maruz paraformaldehyde bu kalite boyama doku etkileyebilir. - Bir kez beyin lavabolar, yarma yarı teğet 40 µm kalınlığında görsel korteksin veya bölge dondurucu, sürgülü microtome veya cryostat ilgi ile. Bu yüzey aşağı ve yavaşça bir cam slayt ile düzleştirme medial ile blok yerleştirerek gerçekleştirilebilir.
- Toplamak bölümleri bir boya fırçası ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içeren bir mücadele kutusu deposunda.
- Ayrı numaralı serisine bölümlere ayırın. Hemen bir mount veya beyin bölümleri Sarısız subbed slaytlarda (Bölüm 1), iki dizi oda sıcaklığında kuru gece kalmak için izin ve işlem bölümleri sinaptik çinko için histochemically.
Not: Karşılaştırma, miyelin 12 veya 13 tarihinde protokolü kullanarak sitokrom oksidaz gibi diğer işaretleri için diğer seri işleme: 2-8 h % 3 sukroz, %0,015 sitokrom C ile 40 ° C'de için kuluçkaya %0,015 katalaz ve 0.1 M PB %0.02 diaminobenzidine. Nisl madde için görsel kortikal alanlarda ayırt histolojik bir marker olarak da kullanılabilir. Bu diğer histolojik lekeler geleneksel jelatin kaplı slaytlar bunun yerine kullanılabilir böylece beyin bölümleri Sarısız subbed slaytlar üzerine monte edilir gerektirmez.
4. Sinaptik çinko Histochemistry
- mutlak alkol 15dk için slayt monte bölümlerde saptamak ve 1 h için oda sıcaklığında tamamen kuruması için izin < lBen > kısa bir süre için 10 bölümleri bırakın s % 1 jelatin çözümde (Bölüm 1) ve oda sıcaklığında kuru gecede izin.
- Çözümleri en kısa zamanda bölümleri tepki hazırız 1.8 adımda anlatıldığı gibi karıştırın.
- Slaytlar bir cam veya plastik tepsi içinde yan yana düzenleme ve gelişmekte olan çözüm slaytlar üzerine dökme tarafından bölümleri tepki. Slaytlar tamamen çözümde batık ve tepsiyi karanlık bir boşluğa aktarmak veya kapak ile ışık geçirmez bir kutu doğrulayın.
Not: yaklaşık 12 inç olan bir plastik tepsi yanında 8 inç genişliğinde uzun kullanılabilir, hangi tam olarak 18 slaytlar uyuyor. Toplam hacmi 200 mL geliştirici çözüm tamamen slaytları daldırın, bu yüzden doğru birim tepki ve buna göre tarifi ayarlamak için slayt sayısı için kullanılmasını sağlamak yeterli olur. Metal bir tepsi kullanarak karşı bir plastik ya da cam tepsi kullanmaktır tavsiye reaktivite geliştirici çözüm gümüş laktat ve demir arasında çapraz bir dereceye veya diğer bulunan metal tepsi metal gibi.
- Slaytlar bir cam veya plastik tepsi içinde yan yana düzenleme ve gelişmekte olan çözüm slaytlar üzerine dökme tarafından bölümleri tepki. Slaytlar tamamen çözümde batık ve tepsiyi karanlık bir boşluğa aktarmak veya kapak ile ışık geçirmez bir kutu doğrulayın.
- Bölümlerde her 30 dk görsel olarak inceleyerek reaksiyon gelişimi izlemek. Bölümleri genellikle 120-180 dk için geliştirme gerektirir..
- Bölümleri (bkz. şekil 3a) overstained olmak Eğer ayırt % 2 çiftçi ' s çözüm (9 parça dH 2 O ve 1 yarı %2 %2 sodyum thiosulfate potasyum Ferricyanide dH 2 O) 1-2 dakika süreyle
Not: şekil 3b ' kötü lekeli örneği bölümüne gösterilir. - İstenen yoğunluk elde sonra slayt kaldırarak reaksiyon sona erdirmek monte bölüm--dan belgili tanımlık tepsi ve slaytları bir slayt raf yerleştirme.
- Çanak boyama büyük bir cam slayt raf yerleştirin ve akan suyun jelatin ceket ve dış gümüş mevduat kaldırmak 10 min için slaytlar sıcak (40-50 ° C) yıkayın.
Not: bölümler kapalı kaymasını önlemek için slayt raf kışkırtmak değil dikkatli olun. Bölüm istenen yoğunluğu zaman yeterli Laminer varyasyon belirgindir ve bölümler yeterince karanlık ama değil aşırı tepki (bakınız şekil 4a) elde edilir. - Oda sıcaklığında kuru ve % 100 kurutmak slayt izin alkol (5 dk), Ksilen (5 dk) ve kapak kayma ile montaj orta içinde açık. Alternatif olarak, slaytları alkol artan bir dizi içinde yer, o zaman kurutmak, açık ve coverslip.
- Hayvanlar bir negatif kontrol hizmet etmek için önceki selenit tedavi olmadan kullanımı bölümleri. Bu bölümler gümüş amplifikasyon verim yok boyama.
Not: en iyi sonuçlar için bölümler kuru gecede için olanak sağlar. Kuru gecede bölümlerine izin verir daha iyi doku boyama.
şekil 3: Boyama Çocuk gelincik beyinde sinaptik çinko. Photomicrographs bölümlerin bir) overstained ve b) Juvenil gelincik beyinde understained yarı teğet çinko lekeli. Alansal sınırları Laminer varyasyon eksik olarak ayırt etmek zordur. Beyaz madde de ağır lekeli. ßy Suprasylvian korteks, WM beyaz önemli, ön, D dorsal. Ölçek çubuğu 500 µm (a-b) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
5. alansal sınırları ayırt etme ve resim alma
- Kullanım architectonic şekil-in farklı beyin bölgelerini alansal ve laminer tanımlama için.
Not: Örneğin, gelişmekte olan sıçan retrosplenial korteks 14 ' te, yazarlar tarafından ağır yetişkin içinde var olmayan ama kortikal açıklamak için yararlanılabilir çinko için boyama ile karakterize bir geçici modülerlik ortaya Bu tür geliştirme sırasında organizasyon. Başka bir çalışma 15, yazarlar özgüllüğü Bu bölünmeler tanımlaması kolaylaştırmak makak maymunu amigdala buldum farklı çekirdekleri sinaptik çinko dağılımında ortaya koydu. Gelişmekte olan ve yetişkin yaban gelinciği beyin görsel kortikal alanlarda yukarıda açıklanan 16 , 17 , 18, architectonic alt yeni korteksimiz içinde olmuştur gri sincap 19 açıklanan vardı. Ayrıca, çinko histochemistry daha önce sıçan somatosensor korteks geliştirmek yetişkin maymun görsel korteksin 8, geliştirilmesi ve yetişkin kedi görsel korteksin 5, alanlarında ayırt etmekte kullanılan 9 , 20 ve yetişkin fare somatosensor korteks 6 , 21. Varsa, lekeli, sitokrom oksidaz (CO) lekeli ve sinaptik çinko yetişkin alansal sınırları onaylamak için beyin bölümleri, lekeli miyelin boyama desende karşılaştırın. Gelincik görsel korteksin sinaptik çinko lekeli yarı teğet bölümlerde, alansal kimlik kolaylaştırmak görsel kortikal alanlarda arasında önemli farklar vardır. Örneğin, alanları 17 ve 18 yetişkin yaban gelinciği, sinaptik çinko boyama katmanları ı-III yüksek ve katman IV neredeyse çinko yoksun iken V. katman VI daha az yoğun, lekeleri ortaya koyuyor. Çinko katman IV veya koyu lekeli Grup alanları 17 ve 18 kontrastlı boyama göze çarpan eksikliği katmanda CO IV bölümleri lekeli buldum. Ancak, bölümleri lekeli katman IV. bölge 17 co tutar ile katmanları III ve V, keskin bir sınır ama katmanı alanı 18 IV yoğunluğu boyama içinde ince bir düşüş karakterizedir ve III daha az ayırt katmanda ile üst sınırı bulundu. - Aydınlık alan mikroskobu ile düşük güç amacı istimal kısımlar inceler (2 X veya 4 X büyütme) ve fotoğraf ilgi alanları.
- Geliştirin kontrast ve parlaklık özelliği görüntü işleme yazılımı kullanarak photomicrographs. Görüntüleri elde için optik yoğunluk ölçümleri herhangi bir şekilde değiştirilmesi değil.
şekil 4: boyama yetişkin yaban gelinciği beyinde sinaptik çinko ayıran farklı görsel kortikal alanlarda. (Bir) sinaptik çinko veya (b) sitokrom oksidaz (CO), yetişkin için bitişik yarı teğet bölümleri photomicrographs lekeli. Oklar alansal sınırları işaretleyin. ßy Suprasylvian korteks, ön, D dorsal. Ölçek çubuğu 500 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
6. Dansitometresi (isteğe bağlı)
Not: Densitometric analiz temsilcisi çinko lekeli bölgeler bölümlerde ilgi optik yoğunluk ölçerek beyinde sinaptik çinko dağılımı değerlendirmek için kullanılan. Bu yöntem aynı zamanda sinaptik çinko düzeyleri geliştirme boyunca potansiyel değişiklikleri izlemek için yararlıdır.
- Kullanarak seçili bölümleri, çinko-lekeli rastgele bölgesi faiz Edinsel photomicrographs (450 µm geniş sütun kullanılabilir) uygun genişlikte kortikal sütunlar (tek sıra halinde photomicrographs) seçin. Tüm kortikal katmanlara pial yüzeyinden beyaz madde kapsayan bir bölge kortikal bir sütundur.
- İlgi her bölgedeki birkaç farklı beyin bölümlerden uygun bir örnek sütun sayısını seçin.
- Örnek fotoğraflar temsilcisi sütunların bir görüntü işleme yazılımı transfer.
- Kortikal sütunun tamamını kapsayacak şekilde dikdörtgen seçim aracını kullanın.
- Tersine kontrast görüntü fotoğraf negatif sütun benzer oluşturmak için ters çevir'i aracını kullanın.
Not: Görüntülerin kontrast inversiyon yüksek optik yoğunluk değerleri yüksek sinaptik çinko düzeyleri için ve düşük optik yoğunluk değerleri düşük sinaptik çinko düzeyleri için verim için gerçekleştirilir. Bu şekil 5 ' te görülen benzer arsa profil grafikleri işlemek için daha kolay bir yoldur. - Optik yoğunluk profilleri bu görüntülerden piksel yoğunluklarını bir çizgi boyunca iki boyutlu bir grafik oluşturmak için arsa profili aracını kullanarak üretmek. Bir kez daha
- arsa üzerinde tıklatın ve çizim profil grafik dikey profile dönüştürmek çizim seçeneklerini kullanın profil.
Not: X ekseni temsil uzaklığını satır ve y ekseni boyunca piksel yoğunluğu gösterir. Bu nedenle, her arsa profil değeri sütun genişliği boyunca ortalama gri ölçek değeri her derinlikte yansıtır. - Açık arsa profil değerleri elektronik tablodaki metin dosyaları olarak, normalleştirme ve arsa grafikler (bkz. şekil 5).
Not: Sonuçları varyasyon tarafından farklı tepki süreleri, stainability, hem de diğer doku sonucunda genel boyama yoğunluğu içinde şaşırmış gibi sinaptik çinko göreli yoğunluğunu kantitatif ölçüm karşılaştırma için kullanılması önerilir değişkenleri. - Hesaplamak göreli çinko yoğunluğu verileri düzeltmek için arsa profil değerleri yük vagonu ortalamasını gerçekleştirerek.
Not: Bu, örneğin, birbirini izleyen her 20 ya da 30 piksel sayı ortalaması alınarak gerçekleştirilir (1 piksel = 2.5 µm) derinlik ve her örnek için maksimum yoğunluk için normalize. Bu nedenle, her ortalama arsa profil değeri o derinlikte (gri tonlama değerler aralık 0 ile 255) ortalama gri ölçek değeri yansıtır. Farklı normalleştirme yöntemi ilk edinilmesi beyaz madde (WM) optik yoğunluk değerlerini ilgi alanları temel beyaz madde içeren örnek bölgelerden tarafından kullanılabilir. İdeal olarak, bir ortalaması WM değeri elde etmek için mümkün olduğu kadar hafifçe lekeli birden fazla bölge seçin. Ortalama optik yoğunluk değerleri normalleştirilmiş WM değerler elde etmek için ortalama WM değerlerle sonra ayrılır. - Karar vermek demek optik yoğunluk değerlerini bölgeler ilgi belirli katmanlar halinde nicel karşılaştırmalar için.
Not: Örneğin, katman IV gelincik görsel kortikal alanlarında ortalama en az optik yoğunluk değeri belirlenir ±5 piksel az lekeli bölgeyi kapsayan tarafından. - Hesapla ortalama optik yoğunluk demek en büyük değeri belirlemek için ±5 piksel tarafından en koyu lekeli bölgeyi kapsayan tarafından gelincik görsel kortikal alanlarda supragranular ve infragranular katmanlarda değerler. Optik yoğunluk değerleri anlamına
- emin olun elde edilir üzerinden belirli katmanlar içinde.
Not: Bu katmanlar ters kontrast görüntüler sınırlarını bitişik CO bölüm yanı sıra özgün photomicrographs karşılaştırarak doğrulamak için zorunludur. Bu bir bitişik katmanlarda rahatsız değil garanti.
şekil 5: sinaptik çinko farklı görsel kortikal Laminar dağıtım Yetişkin yaban gelinciği alanlarda. Normalleştirilmiş optik yoğunluk profillerin bir yetişkin ile tüm kortikal katmanı üzerinden sütunların temsilcisi photomicrographs. Yetişkin alanları 17 ve 18 IV tabakası dansitesi düşük sinaptik çinko profil arsa yalak simgesiyle gösterilir. Her arsa profilinde yalak katman IV dolu oval ortalama en az piksel yoğunluk değeri belirlemek için kullanılan değerleri gösterir. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sinaptik çinko için beyin bölümleri leke için bu iletişim kurallarını katılan büyük adımlar akış çizelgesi şekil 1' deki sunulur. Protokol üç döneme ayrılabilir: 1) perfüzyon ve doku koleksiyonu, 2) doku hazırlık ve boyama ve 3) çinko histochemistry. Kısaca, Protokolü'nün ilk aşamasında, hayvan anestezi ve IP sodyum selenit uygun dozu ile enjekte edilir. Bir yeterli süre sonra (ideal olarak 60-90 dk), hayvan daha sonra % 0,9 NaCl çözüm %4 paraformaldehyde çözüm tarafından takip ile periosteum ötenazi. Kafasını kesti ve beyin kafatasından hızlı bir şekilde kaldırılır. Beyin sonra %4 paraformaldehyde artı % 30 Sükroz çözüm olarak cryoprotectant lavabo izin verilmez. Protokolü'nün ikinci aşamasında, donmuş bölümleri 40 µm, sürgülü microtome fosfat tamponlu tuz (PBS) kesti ve numaralı serisine ayrılmış. Hemen sonra kesit, beyaz yumurta subbed slaytlarda bölümleri bağlamaya önemlidir, en iyi sonuçlar için Kuru gecede bölümleri bırakarak. Jelatin subbed slaytlar krom potasyum sülfat genellikle subbing çözümde kullanılan gümüş laktat ile böylece suboptimal boyama için önde gelen cross-reacts olarak tavsiye edilmez. Bölümleri sonra mutlak alkol ve oda sıcaklığında tamamen kurumaya sol 15 dakika inkübe. Bu adımı önceden hazırlanan % 1 jelatin solüsyona takılı bölümlerin kısa bir batma arkasından ve gecede en iyi sonuçlar için Kuru izin. Protokolü (çinko histochemistry) son aşamasında, geliştirici çözüm yöntemleri bölümünde özetlenen adımları göre hazırlanır ve slaytlar çözümde batık bir plastik ya da cam tepsiye yerleştirilir. Leke gelişimi genellikle herhangi bir yerde 2-3 saat arasında sürer, ancak yakın görsel muayene bölümleri overstaining önlemek gereklidir. Ne zaman uygun yoğunluk elde slaytlar olmalı kaldırıldı, slayt rafına yerleştirilen ve dış gümüş mevduat kaldırmak 5-10 dakika ılık suyla durulanır. Bölümleri sonra oda sıcaklığında, temizlenmiş ve coverslipped kurutulmuş. Protokol çinko histochemistry aşamasını tamamlamak için gereken özel adımlar şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.
Bu protokol sinaptik çinko histochemistry boyama düzeyleri arasında gelincik beyin görsel kortikal alanlarda alansal ve laminer varyasyon ortaya çıkarmak için kullanır. Bu iletişim kuralı diğer türler de diğer beyin bölgeleri olduğu gibi kullanmak için adapte edilebilir. Örneğin, diğer duyusal cortices gelincik veya herhangi bir diğer modeli sistemi somatosensor, işitsel veya frontal korteks gibi eğitim araştırmacılar büyük ölçüde bu histochemical leke kullanımından yararlanırlar. Bu teknik en büyük avantajı, erişkinlerde alansal kimlik kolaylaştırmak gibi güvenilir bir şekilde kemirgenler, yaban gelinciği, kediler ve maymunlar gibi genç hayvanlarda kortikal alanlarda ayırt etmek için alanları arasında açık geçişler sağlamasıdır.
Şekil 3a sürecinde bir çinko yanlışlıkla için çok uzun ve böylece geliştirdiğimiz lekeli bölüm overstained görülmektedir. Overstained doku çok koyu kahverengi renk tarafından Laminer varyasyon eksikliği ile karakterizedir ve ağır lekeli beyaz madde. Ancak, çinko-lekeli beyin bölümleri bazen şekil 3b' gösterildiği gibi understained. Understained bölümleri bazen hayvan beyne seyahat enjekte selenit engellemektedir zaman (en az 60 dk.), yeterli miktarda için hayatta değildi ortaya çıkar. Selenit düzgün yönetilen değil ve bu nedenle beyin için seyahat değil dokusunun understaining da ortaya çıkabilir.
Sinaptik çinko yetişkin bir gelincik birden fazla görsel kortikal bölgelerde boyama türdeş olmayan dağılımı şekil 4atemsilcisi yarı teğet bölümünde gösterilir. Okları alansal sınırları üzerine gelin. Alanlarda 17 ve 18, sinaptik çinko boyama yoğunluğunu genellikle yüksek olduğunu ı, II, III ve V, Katmanlar ve katman IV (thalamorecipient katman) düşük ve orta katman VI. 17 ve 18 alanları arasında açıkça tanımlanabilir bir geçiş varlığı şekil 4abelirgindir. Katman IV boyama yoğunluğu alanda 18 biraz artar ve katman V ve değişken yoğunluğu azalır. Şekil 4b sitokrom oksidaz (CO) benzer bu biz ile çinko leke gözlenen alansal sınırları yerlerini gösteren için lekeli bitişik bir bölümdür. Alanları 17 ve 18 genellikle çinko düzeyi yüksek olan bölgelerinde boyama CO seviyesinin düşük görünüyor.
Sinaptik çinko alanlarda 19. ve 21 dağıtım niteliksel benzer her iki alanda daha az Laminer varyasyon alanlarda 17 ve 18 var olmasıdır. Katman IV alanlarının 19. ve 21 açıkça farklı alanlarda 17 ve 18 IV katmanından orta lekeli değildir. Alan 19 supragranular ve infragranular katmanları, benzer yoğunluğunu olmakla birlikte, katman V biraz daha koyu lekeleri. Alan 21 karşılaştırılabilir sinaptik çinko dağıtmak üzere bu alanda 19 sahiptir. Ancak, alan 21 VI tabakası alan 19 IV tabakası daha büyük sinaptik çinko düzeyleri ile karakterizedir. Katmanlar VI ve Suprasylvian IV (ßy) orta lekeli görünmesine ve karşılaştırılabilir yoğunluğunu katman V büyük sinaptik çinko düzeyleri ile karakterizedir ve supragranular Katmanlar sinaptik çinko düzeyleri dalgalanan bir desen tarafından işaretlenir.
Yani isterseniz sinaptik çinko farklı beyin bölgelerindeki, farklı tedaviler ile veya farklı yaş itibariyle dağılımı kantitatif değerlendirmesi yapılabilir. Örneğin, bir sinaptik çinko yetişkin veya birincil görsel, işitsel, geliştirme boyunca dağılımında değişiklikler ve herhangi bir modeli sistem somatosensor cortices değerlendirmek isteyebilirsiniz. Densitometric analizi ile biz daha önce sinaptik çinko dağıtım birden çok görsel alanda göstermiştir (17, 18, 19, 21 ve Suprasylvian) gelişmekte olan yaban gelinciği beynin 5 ila altı hafta-in yaş17önemli ölçüde düşüş. Burada temsilcisi örneklerinde işlemi göstermek için bir yetişkin yaban gelinciği geçen sinaptik çinko dağılımı farklılıkları değerlendirmek için gereken adımları açıklar. Aşağıdaki adımları Juvenil gelincik görsel kortekste de olduğu gibi herhangi bir diğer türler veya beyin bölgeleri sinaptik çinko dağıtım değişiklikleri izlemek için takip edilebilir. Şekil 5 temsilcisi sütunlu photomicrographs yetişkin beyin bölümlerden çinko histochemistry ile birlikte kendi tamamlayıcı normalleştirilmiş optik yoğunluk arsa profilleri için işlenen gösterir. Optik yoğunluk değerleri normalleştirilmiş araziler kortikal derinlik göre yapılan değişiklikleri yansıtacak şekilde oluşturuldu. Bu nedenle, her arsa profil değeri üst üste kortikal derinliklerde ortalama gri ölçek değeri yansıtır. Örneğin, alanları 17 ve 18 çinko hangi onların arsa profillerden belirgindir (yalak tarafından temsil edilen) katman IV'te boyama belirgin bir düşüş ile karakterizedir. Demek en az optik yoğunluk değerlerini alanlarda 17 ve 18 tarafından siyah oval doldurulan gösterilir. Gözlenen boyama düşük çinko alanları 17 ve 18 kontrastlı tek IV tabakası içinde çinko ince bir dalış alanları 19, 21 ve ßy düzeyleri. Toplu olarak, alanları 19, 21 ve ßy alanları 17 ve 18 farklı çinko düzeyleri tüm katmanlar boyunca olmasıdır daha daha homojen alanda 17 ve 18. Ayrıca, supragranular katmanları ve katman alanları 17 ve 18 V genellikle katman VI daha yoğun bir şekilde leke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmada sayede sinaptik çinko yerelleştirme tespit olabilir ve beyinde görüntülendi Danscher (1982) yöntemi10, değiştirilmiş bir sürümü dayalı bir histochemical tekniği istihdam. Bu yöntem aslında hayvan (15 mg/kg) çinko şelatör sodyum selenit (Na2SeO3) ile enjekte edilerek çalışır. Enjeksiyon, selenit beyne yayılıyor ve çinko içeren nöronlar presynaptic veziküller için yerelleştirilmiş ücretsiz çinko bağlar. Çinko iyonları sinaptik veziküller Çökelti içindeki moleküller ilişkili ve daha sonra fiziksel gelişim2,11arası görüntülenmeyecektir. Özgün Timm'ın sülfür gümüş boyama yöntemi algılamak ve Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni ve Zn gibi ağır metaller biyolojik doku22bir dizi görselleştirmek için düşünülmüştü. Sodyum sülfat, bu yöntem için kullanılan şelat aracısıdır. Bu nedenle, Timm'ın sülfat yöntemi kullanarak büyük bir sorun için metal bir sülfür dönüştürülebilir herhangi bir metal gerçekten fiziksel gelişim tarafından güçlendirilmiş gümüş olması gerektiği özgüllük eksikliği var. Ancak, mevcut çalışmada kullanılan Danscher yöntemi değiştirilmiş versiyonu çinko ve diğer ağır metaller için özeldir. Danscher'ın 1982 yöntemi ve biz bu çalışmada tarif mevcut yöntemi arasında çeşitli farklar vardır. Biz donmuş doku kullanırken taze sabitlenmemiş beyin dokusu Danscher'ın yöntemini kullanır. Bu daha fazla immunohistokimyasal ve biz rutin için laboratuarımıza içinde leke diğer histolojik işaretleri ile uyumlu olduğu gibi biz paraformaldehyde kullanırken Danscher oxazolidin perfüzyon için de kullanır. Danscher aynı zamanda hangi biz bizim yönteminde gerçekleştirmeyin toluidin blue (%1), gibi poststaining yordamları kullanır.
Bir mevcut tekniği ile sodyum selenit toleransını hayvanlar tarafından ilişkili öngörülemezliğine kısıtlamasıdır. Sodyum selenit yönetme sonra bazen hayvanlar 30 dakika daha uzun hayatta olmayan olduğunu bulmak. Bu durum selenit beyne seyahat için yeterli zaman izin vermez ve beyin bölümleri sonraki gelişimi genellikle düzensiz doku boyama için yol açar gibi bir sorun teşkil etmektedir. Başka bir potansiyel sınırlama sodyum selenit mayi enjeksiyon doğru yönetimle ilgili. Bir alt karın boşluğu yukarıda ciltte çekin ve iğne eğim yan 15-20 derece, sadece karın duvarı delici bir açıyla yerleştirin. İğne geri biraz karın organları değil nüfuz ve malzeme değil Aspire sağlamak için çekilmiş olmalıdır. İğne, imha ve bu durum ortaya çıkarsa yerine.
Yüksek kalitede boyama sonuçları ve tekrarlanabilirlik emin olmak için aşağıdaki ihtiyati tedbirler öneririz. Sodyum selenit hayvan hayvan ve maximizing sağkalım süresi içine doğru yönetim (60-90 dk optimum) ötenazi önce yeterli zaman selenit beyne seyahat için verilir emin olmak önemlidir. O daha kısa hayatta kalma süreleri bulduk (30 dakika veya daha az) genellikle düzensiz doku boyama için yol. Aynı şekilde, montaj bölümleri blok kesit önemli bir adım sonra hemen Sarısız subbed slaytlar üzerine. Çinko iyonları çözümde leach gibi taze donmuş PBS bölümlerde bir gün sayısı için kesmek bırakarak karşı önerilir. Geliştirici çözüm hazırlanması sırasında bu tepki küçük değişiklikler olarak pH oldukça duyarlı olduğu gibi sitrat arabellek doğru pH (4.0) olduğundan emin olmak için önemlidir. Aynı şekilde, Hidrokinon çözüm Isıtma sıcaklığı 60 ° C'den korumak için zorunlu olduğunda, daha fazla ısınma olarak çözüm okside ve leke inhibe. Benzer şekilde, kısaca jelatin slayt monte edilmiş bölümlerde batış bölümü yüzeyi gümüş birikimi non-spesifik engeller gibi önemlidir. Ancak, Bölüm 10'dan daha uzun jelatin çözümde bırakılmamalıdır s Bu onlara eşit olmayan doku boyama için önde gelen buruşmak neden olur. Geliştirici çözüm iken bölümlerde periyodik görsel denetim ayrıldığından beri bölümleri için çok uzun süre overstaining için yol açabilir tavsiye edilir. Bu leke oldukça duyarlı, sıcaklık bölümleri daha hızlı bir şekilde ortam sıcaklığı sıcak ne zaman ve daha yavaş sıcaklık serin ne zaman geliştirmek eğilimindedir böyledir. Son olarak, bir-ebilmek istemek-slayt rafa kaldırma jelatin ve slaytlardan kalan gümüş mevduat kolaylaştırmak için sıcak suda durulama adım sırasında hafifçe slaytları titremeye. Ancak, aşırı ve dikkatsiz ajitasyon slaytlar sıcak su ile durulama kayma bölümlerine neden olabilir iken bölümlerin slaytları kapalı ve kaçınılmalıdır. Uygun bir denetim için densitometric ölçümleri nicel karşılaştırma yapmak için kullanılır emin olmak için önemlidir. Bir potansiyel olarak hafifçe lekeli veya boyama bölge bir iç denetimi olarak kullanabilirsiniz. Bizim malzeme beyaz madde bir denetim olarak optik yoğunluk değerleri farklı görsel kortikal alanlarda geliştirme boyunca normalleştirmek için kullanıyoruz. Beyaz madde değerleri farklı yaş ve yetişkin17karşılaştırılabilir olduğunu öğrenin. Bu nedenle, verilen bu beyaz madde değerleri yaş bir fonksiyonu olarak değişmez, beyaz madde densitometric analiz için geçerli bir denetim olarak hizmet vermektedir.
Bu yöntemin ana avantajı, basit ve güvenilir histochemical leke dağılımı histochemical diğer işaretleri gibi beyin bölgeleri ayırmak için kullanılabilir olmasıdır. Ancak, histochemical bu yöntemin kullanılması belirli hücre popülasyonlarının (Bu çinko eksik) çalışmaya uygun olmayabilir veya çok genç hayvanlarda olarak sinaptik çinko düzeyleri fare somatosensor ve kedi görsel korteksin5 geliştirmede gösterildiği gibi doğumda başlangıçta düşüktür ,20. Bu iletişim kuralı bir diğer avantajı nöroanatomik izleyici enjeksiyon deneyler ile birlikte kullanılabilir olduğunu. Bizim laboratuarımızda, biz genellikle bir çift yönlü nöronal izleyici görsel kortekste birden çok alanı arasında bağlantı desende gelişimsel değişiklikleri incelemek için Juvenil yaban gelinciği Primer görsel korteks içine enjekte. Hayvanlar için farklı bir deneysel çalışma kullanılabilir mi Eğer bu nedenle, hayvanlar sadece çinko histochemistry için kullanılmaması. Açıklanan yöntemi en büyük avantajı kullanım diğer türler ve diğer beyin bölgeleri için adapte olması gibi. Gelincik beyin dokusu kullanarak bu yöntem göstermiştir rağmen kemirgenler, cats ya da maymunlar beyin dokusundan okurken bazı adımlar ince farklılıkları olabilir. Diğerleri başarıyla sıçan somatosensor korteks9 geliştirmek yetişkin maymun görsel korteksin8, geliştirilmesi ve yetişkin kedi görsel korteksin5, desende boyama farklılıklar göstermek için bu çinko histochemical yöntemi kullandık , 20, Yetişkin fare somatosensor korteks6,21ve yetişkin Parma kanguru görsel korteksin7.
Burada sürekli olarak yüksek kaliteli çinko boyama elde etmek için kontrol edilebilir Protokolü ve alt çizgi önemli parametre temel adımları özetlemektedir. Bir sinaptik çinko düzeylerinin diğer duyusal ya da motor cortices veya diğer modeli hayvanlarda subcortical yapıları değişiklikleri değerlendirmek isteyebilirsiniz. Niceliksel bilgileri bu densitometric biroldu sağlar bu yöntemi (biz daha önce17gösterdiği gibi) kortikal geliştirme zaman ve sinaptik çinko düzeylerinin farklı beyin bölgeleri arasında muhtemelen ifşa farklı gelişim profilleri üzerinden takip için avantajlı olabilir. Gelişimsel soru ve karşılık gelen yaş çalışma hayvanların bir önemli noktadır. Sinaptik çinko histochemistry yaban gelinciği açıkça tanımlanabilir görsel kortikal alanlarda ortaya çıkarır ve daha fazla çalışmalar kortikal organizasyon ve işlev yararlı bir rehber olarak hizmet verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser araştırma kaynakları (2G12RR03060-26A1); hibe Milli Merkezi tarafından desteklenmiştir Azınlık sağlık ve sağlık eşitsizliklerin (8G12MD007603-27) ulusal sağlık Enstitüleri üzerinden Ulusal Enstitüsü; Profesyonel personel Kongre-City University of New York (PSC-CUNY); ve öğretim araştırma hibe (FRG II) Amerikan Üniversitesi Şarja. Biz Vidyasagar Sriramoju bize bu yöntemlere tanıtmak için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
