Summary
Существует требование сделать Доклинические испытания для класса Роман «сирота» препаратов, называемых фармакологических сопровождающих, воспроизводимость, быстро и эффективно. Мы разработали на основе культуры пробирного высоко стандартизированных, простой и универсальный мобильный экран для право пациентов, а также сопровождающий Роман фармакологических препаратов.
Abstract
Использование персонализированной медицины для лечения редких моногенных заболеваний как лизосомальных хранения расстройства (ЗПУ) оспаривается сложных клинических судебного конструкции, высокой стоимости и незначительного числа пациентов. В большинстве СУРЛ вовлечены сотни мутантных аллелей. Заболеваний, обычно подразделяются на 2-3 клинических типов зависимости от тяжести. Кроме того молекулярная характеристика генотипа может помочь предсказать клинических исходов и информировать пациентов. Поэтому мы разработали assay простой клетки культуры, основанные на HEK293H клетки, участием чрезмерно выражая мутации, выявленных в Фабри и Pompe болезни. Аналогичный анализ недавно была введена как Доклинические испытания для выявления поддаются мутации для фармакологической Chaperone терапии (РСТ) в болезнь Фабри. Эта рукопись описывает assay культуры измененные клетки, которая позволяет быстрое фенотипические оценки аллельных вариантов в Фабри и Pompe болезни определить право пациентов на РСТ и может помочь в разработке новых pharmacochaperones.
Introduction
Есть более чем десятка лизосомальных хранения расстройств (ЗПУ), связанных с гликозидазы дисфункции в результате первичного генных мутаций. Соответственно, Фабри (Маккусика #301500) и болезней Pompe (Маккусика #232300), более чем 500 и 200 Миссенс-мутации зарегистрировано1,2,3 , что соответствует около 60% всего мутации графа. По-прежнему определяются многочисленные новые варианты гена, многие из которых имеют неизвестное значение. Обширные биохимические исследования показали, что определенные генотипы не приводят к полной потере функции гена GLA (Маккусика * 300644) в болезнь Фабри, но вызывают соответствующие фермента не в состоянии достичь термодинамически благоприятствования складной состояния4 . Это приводит к ER удержания и преждевременной ухудшение иначе функционального энзима. Аналогичные выводы были сделаны в других ЗПУ, включая Pompe болезни5. Кроме того молекулярная характеристика фермента вариантов может способствовать клинической интерпретации мутаций в момент диагностики6, предполагая, что ЛСД прогрессии является индивидуальный процесс, основанный на характер, мутации. Таким образом обычные классификации в различных клинических типов обычно 2-3 должны быть пересмотрены с целью упорядочения клинических консультирования и лечения.
Фермент заместительной терапии (ERT) доступен для обоих заболеваний. ERT, однако, имеет ограниченную эффективность в пораженные ткани/органы как мозг и скелетных мышц. Кроме того ERT можно выявить иммуногенность ответ, которая ставит под угрозу его терапевтический эффект. Фармакологических сопровождающим (шт) являются альтернативой привлекательным лечения для пациентов с так называемой гибкой мутации. ПК в качестве молекулярных леску для сворачивания белка правильной и стабилизации, который в свою очередь предотвращает сохранение эндоплазменный ретикулум (ER) и ER-связанные деградации фермента. Кроме того компьютеры могут быть введены перорально и потенциально могут пересекать гематоэнцефалический барьер. Таким образом РСТ может быть более жизнеспособным вариантом для лечения больных с определенным генотипов. Для обширный обзор на ПК приложения в ЗПУ обратитесь к отличным обзором Паренти7.
Обнаружение сотен болезнетворных мутантные аллели проблемы наркотиков Доклинические испытания и требует простой, быстрый и высоко стандартизованной оценки поддаются пациентов для персонализированной медицины подход. Чтобы оценить пагубное влияние мутаций гена ЛСД и тестирования кандидата мутации предсказать поддаются пациентов для РСТ, был высоко стандартизированных гиперэкспрессия системы в HEK293H клетках, которая позволяет для измерения активности фермента быстрый и надежный разработано. Аналогичные системы гиперэкспрессия ранее были описаны Фабри и Pompe болезни с помощью COS-78,9,10,11, НеЬа клетки12или HEK29313 ,14,,1516 клеток для гликозидазы гена.
Очень подобный метод запатентован даже как «Метод для прогнозирования реакции на фармакологические Chaperone лечение заболеваний»17 , указывающее значение ячейки культуры системы, способной интегрироваться в клиническую практику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка мутант pcDNA3.1/GLA и pcDNA3.1/ГАА конструкций
Примечание: Клонирования стратегии гла и ГАА кодирования последовательностей (cds) были сообщалось ранее15,18.
- Сайт направленного мутагенеза, используя сайт Направленный мутагенез
- Используйте ссылку последовательностей NM_000169.2 и NM_000152.4 как шаблоны для мутагенеза GLA и ГАА генов, соответственно. Есть набор соль бесплатно грунтовки высокой чистоты (25-37-РВК) синтезируется коммерческого поставщика услуг, с смысл и antisense грунты, перевозящих один из соответствующих последовательности изменения центральной их длины индивидуально ввести мутации. Используйте средство дизайн бесплатно грунтовка для поддержки грунтовка дизайн19.
- Для реакционной смеси используйте стандартные условия для решения реакции и условия PCR, предоставляемых производителем.
- Mix 5 мкл 10 x буфер реакции, 10 нг двунитевая шаблон плазмидной ДНК (pcDNA3.1/GLA или pcDNA3.1/ГАА), 125 нг каждого праймера, 1 мкл предоставленный dNTP смеси, 3 мкл Реагента ДМСО в соответствующий объем деонизированной воды (объем окончательной реакции : 50 МКЛ). Наконец добавьте 2.5 U ДНК-полимеразы и смешивать, закупорить вверх и вниз. Как отрицательный контроль увлечь образец без грунт.
- Старт PCR, используя следующую программу: шаг 1: 95 ° C в течение 1 мин, шаг 2: 95 ° C 50 s, шаг 3: 60 ° C 50 s, шаг 4: 68 ° C 8 мин, повторите шаг 2-4 18 раз и шаг 5: 68 ° C в течение 10 мин.
- После ПЦР, 1 мкл Dpnя энзима ограничения (10 U/мкл) и далее инкубировать реакции флакон при 37 ° C в течение 1 ч.
- Преобразование и скрининга для желаемого клон
- Трансформировать Алиготе ultracompetent клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Использование SOC среднего (Триптон 2% (w/v), дрожжевой экстракт 0,5% (w/v), NaCl 10 мм, KCl 2,5 мм, стерилизуют при температуре 121 ° C и затем добавить стерильной фильтрации растворов MgCl2 и глюкозы до окончательного концентрации 10 и 20 мм, соответственно) вместо производителя Средний. После процедуры плита 250 мкл мутагенеза образца на LB пластины содержащий ампициллина 100 мкг/мл и инкубировать при 37 ° C для 18 h.
- Заверить, что количество трансформантов > 10 и реакция урожайности по крайней мере в три раза больше колоний как без грунтовка управления реакции, например, с помощью световой пластины для облегчения подсчета колонии. Затем выбрать 3 колоний и подготовить 3 мл ночи культур в среде LB отвара.
- На следующий день, осуществлять подготовку плазмида с набором стандартных и анализировать всю последовательность, используя T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA тег GG-3ʹ) и праймеры BGHr (5ʹ-тег AAG ГЦА CAG ВРЧ общ 3ʹ) через стандартный Сэнгер последовательности.
- Используйте подходящие молекулярной биологии инструмент для анализа последовательности. При обнаружении требуемой мутации и no далее последовательности аномалий по сравнению с NM_000169.2 (α-галактозидазы A) или NM_000152.4 (кислота альфа-глюкозидазы) рассматривается, выберите клон для очищения плазмиды трансфекции класса.
- Определите чистоту ДНК путем измерения поглощения в спектрофотометре.
Примечание: Разрешать только те препараты, которые дают чистоты плазмида с коэффициентом поглощения 260/280 > 1.8 для ячейки культура экспериментов.
2. Культивирование клеток HEK293H
- Сохраняйте HEK293H клетки в высокой глюкозы (4,5 г/Л) Dulbecco´s модифицированных Eagle среднего (DMEM) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина. Держите клетки в water-jacket инкубатора при 37 ° C под атмосферу 5% CO2 .
- Культивируйте клетки плотностью 80-90%.
- Аспирационная среднего и мыть после того, как с помощью фосфат буфер солевой раствор (PBS) без Ca2 + и Mg2 +.
- Проход, добавив 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO2.
- Разделение клетки 1:15 в свежих средних и семян новых T75 колбу для поддержания постоянного культуры. Не использовать ячейки с более чем 25 проходы.
3. pcDNA3.1/GLA и pcDNA3.1/ГАА плазмида Transfection и лечения HEK293H
- за 24 часа до трансфекции, мыть HEK293H клетки в колбе культуры клеток T75 раз с PBS с Ca2 +, мг2 +. Урожай клетки с 0,05% трипсина-ЭДТА, как указано выше и семян 1,5 x 105 клетки в полости плиты 24 хорошо культуры с использованием 500 мкл DMEM среднего дополнена 10% FBS без антибиотиков.
- Осуществлять протокол transfection согласно инструкции производителя. Как правило используйте смесь из 1 мкг ДНК плазмиды и 2,5 мкл Реагента трансфекции в 100 мкл DMEM сыворотки бесплатно. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре и добавить в ячейки в drop-wise манере впоследствии.
- Удалите носитель, содержащий трансфекции реагент после периода 4 ч при 37 °C/5% CO2 и 500 мкл свежие DMEM с 10% FBS / 1% пенициллина/стрептомицина.
Примечание: Во время этого шага, 1-Deoxygalactonojirimycin гидрохлорид (DGJ) или 1-Deoxynojirimycin гидрохлорид (DNJ) могут быть добавлены к питательной среды где предназначены (использовать водный раствор 10 мм для получения конечной концентрации 20 мкм DGJ и DNJ ). Свежие DGJ или DNJ был добавлен 42 h после трансфекции плазмиды.
4. ячейка урожай и α-галактозидазы A или кислоты альфа-глюкозидазы измерения активности
- Ячейка урожай
- В день сбора урожая удалить ячейки из инкубатора и аспирационная среды. Тщательно вымойте клетки 2 раза с PBS с Ca2 + и Mg2 +.
Примечание: Этот шаг очень важен, потому что DGJ и DNJ являются сильными ингибиторами α-галактозидазы и α-глюкозидазы, соответственно, и любые остатки нарушится тест. - 200 мкл деионизованной воды непосредственно на верхней части клетки. Промойте клетки от плиты и передавать их на 1,5 мл реакции.
- В день сбора урожая удалить ячейки из инкубатора и аспирационная среды. Тщательно вымойте клетки 2 раза с PBS с Ca2 + и Mg2 +.
- Гомогенизация, замораживания и оттаивания
- Поместите образцы в соответствующей пены стойку и вихревые для 5 s, чтобы сделать более эффективным lysis. Поместите образцы, чередуя в жидком азоте для 10 s и в ванну воды комнатной температуры до оттаивания был полный (5 мин).
- Повторите эту процедуру 5 раз и затем спина образцы для 5 мин на 10000 x g.
- Подготовьте свежие трубки для каждого образца, содержащий 40 мкл дейонизированной H2O и 10 мкл пример. Mix решение vortexing кратко и передачи 10 мкл в полость 96 хорошо плиты (каждый образец в трех экземплярах). Разбавить бычьим сывороточным альбумином (БСА) раствор 2 мг/мл в дейонизированной H2O следующим образом для получения калибровочной кривой: 50 мкл H2мкл BSA O/50; 60 мкл H2O/40 мкл BSA; 70 мкл H2O/30 мкл BSA; 80 мкл H2O/20 мкл BSA; Мкл 90 H2O/10 мкл BSA; 100 мкл H2O.
- Начала реакции, добавив 200 мкл Реагента BCA (Реагент A и B реагент смешивается в соотношении 50: 1) и инкубировать в течение 1 ч в темноте при 37 ° C под легким агитации на орбитальный шейкер (300 об/мин). Измерение оптической плотности на 560 Нм в тарелку читателя.
Примечание: Образцы обычно содержат от 1 до 1,5 мкг белка на мкл.
- Разбавьте подсчитанная сумма каждого образца и пипетки в свежие 1,5 мл реакции трубы для получения 0,05 (для α-галактозидазы A) или (для кислоты альфа-глюкозидазы) 0,5 мкг белка/мкл решения. Вихревой образцы для 5 s снова и пипетки 10 мкл этой разрежения в 96 хорошо пластины (каждый образец в двух экземплярах).
- Начало реакции, добавив 20 мкл раствора соответствующих субстрата:
Для α-галактозидазы A: 2 мм 4-Methylumbelliferyl-α-D-галактопиранозид (4-му gal) в 0,06 М фосфатного буфера цитрата, рН 4.7.
Для кислоты альфа-глюкозидазы: 2 мм 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-му glu) в ацетат натрия 0,025 M, рН 4,0. - Инкубируйте ферментативных реакций на 1 ч в темноте при 37 ° C под легким агитации на орбитальный шейкер (300 об/мин). Прекратить реакцию путем добавления 200 мкл 1,0 м, рН 10.5 скорректированные глицин NaOH буфера.
- Стандартной кривой 4-methylumbelliferone (4-му) от 0,01 мг/мл бульона приготовляют следующим образом:
100 мкл H2O / нет 4-му; 80 мкл H2O / 20 мкл 4-му; 60 мкл H2O / 40 мкл 4-му; 40 мкл H2O / 60 мкл 4-му; 20 мкл H2O / 80 мкл 4-му; H2O / 100 µL 4-му, накапайте 10 мкл каждого разведения в 96 хорошо пластины (в дубликатов) и добавить 200 мкл буфера 1,0 М глицин NaOH в каждой скважине для того чтобы отрегулировать громкость и рН. - Мера активности ферментов в флуоресценции читателя с соответствующим фильтром установить и анализировать данные с помощью соответствующего программного обеспечения для устройства чтения флуоресценции.
Примечание: Оба 4-кружка субстратов сводится к 4-му во время воздействия α-галактозидазы A или кислоты альфа-глюкозидазы. Выпущенное 4-му является флюрохром, которая может быть измерена на 360 и 465 Нм как волны возбуждения и выбросов, соответственно, с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедура мутагенеза
Чтобы оценить эффективность GLA генов мутагенезом, мутации были классифицированы в одну из следующих категорий. Этот подход к генерации мутации показал, что около 66,5% мутаций GLA были получены в первой попытке. Еще 25% могут быть получены после слегка модифицированный второй ПЦР.
Категория 1: Мутагенезом PCR было эффективным с первой попытки.
Категория 2: Первый мутагенезом PCR не удалось (не колоний на плите, не вставленного мутации); повторение, используя же грунт набор путем повышения температуры отжига до 68 ° C было эффективным.
Категория 3: Больше усилий пришлось провести приносить желаемых клон (например, обычно один или несколько новых наборов праймеров были разработаны).
Α-галактозидазы A и измерения активности фермента кислоты альфа-глюкозидазы
Активность фермента различных ферментов, мутант был записан после предыдущих инкубации временно transfected клеток в наличие или отсутствие ПК. Таблица 1 ссылается на результаты для α-галактозидазы 3 A и 3 кислоты альфа-глюкозидазы мутации. Данные отображаются как абсолютные значения (1) для оборота субстрата (нмоль 4-му * мг белка-1* h-1) и (2) относительные значения нормированы фермента дикого типа. Оба выражения являются полезными, поскольку оборот всего субстрата иллюстрирует эффективность реакции и чувствительность системы, в то время как нормализованные значения могут дать важные подсказки для вероятность злокачественного мутации с одной стороны и эффективность лечения PC с другой стороны. Для экспериментального этапа был создан рабочий поток изображен на рисунке 1 , который планируется 60 h инкубационный период с соединения (по техническим причинам, например быстрый рост HEK293H клеток условиях введен). Даже несмотря на то, что она заявила что 10 мкм приблизительная максимальная достижимых плазменную концентрацию для DGJ14, 20 мкм использует текущий протокол как разумные концентрации для целей отбора для быстродействия, поддержанное многочисленные ранее работает4,-20,-21,-22,-23. Кроме того был постулируется, что выше уровня в плазме может быть достигнуто24.
Рисунок 1 : Рабочий поток в пробирке измерения активности фермента. (A) Хронология эксперимент показывает усилия культуры клеток 90 h с относительно мало hands-on-время, необходимое в назначенное время точках. (B) представитель плазмида векторов pcDNA3.1 содержащий дикого типа дисков GLA и ГАА показываются. GLA и ГАА дикого типа плазмид и плазмиды, включая соответствующие вставленной мутации интерес были использованы для временно transfect клетки HEK293H покрытием в 24 хорошо формате. После периода разрешить клетки синтезировать продукции соответствующих генов и позволить для обработки фермента, лизосомальных транспорта и PC действий клетки были лизированы и измеряется в reader пластины флуоресценции и проанализированы с использованием соответствующего программного обеспечения. C: морфология и роста статуса клеток HEK293H клеток показываются эксперимента на протяжении времени. Масштаб баров = 100 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| в vitro активность фермента | |||||
| GLA | родной | DGJ 20 МКМ | |||
| Мутация (AA) | нмоль 4-кружка Гал/мг/ч (среднее) | % Среднее (болезни, N) | нмоль 4-кружка Гал/мг/ч (среднее) | % Среднее (болезни, N) | значение |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52,0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8.8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44,2 (±3.6, 5) | **** |
| ГАА | родной | DNJ 20 МКМ | |||
| Мутация (AA) | нмоль 4-кружка glu/мг/ч (среднее) | % Среднее (болезни, N) | нмоль 4-кружка glu/мг/ч (среднее) | % Среднее (болезни, N) | значение |
| p.Y455F | 41,1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246,6 | 31,4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65,7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166,5 | 16.7 (±1, 5, 5) | ** |
| p.L552P | 0.0 | 0.0 (±. 2, 5) | 104.3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Таблица 1: активность фермента α-галактозидазы A и кислоты альфа-глюкозидазы. В таблице представлены представителем результаты для α-галактозидазы 3 A и 3 кислоты альфа-глюкозидазы мутантов с и без ПК DGJ или DNJ. Для эндогенной ферментативной активности клеток HEK293H была исправлена абсолютный фермента данных о деятельности. Чтобы оценить эндогенной ферментативной активности, клетки были transfected с pcDNA3.1 пустой вектор. Значения были 97,5 нмоль 4-му * мг белка-1* h-1 для α-галактозидазы A и 41,6 нмоль 4-му * мг белка-1* h-1 для кислоты альфа-глюкозидазы, соответственно; активность фермента значения были нормализованы дикого типа фермента от соответствующих экспериментов, которые объясняет отклонения относительных значений между различными мутантов.После 5 независимых клетки культуры экспериментов (N = 5), каждый в технических дубликаты, стандартное отклонение не было разрешено быть > 15% от среднего значения. Соотношения T-тесты были использованы для расчета разницы между необработанных и обработанных PC фермента.
* p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,005, *** p < 0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанные здесь, обеспечивает надежные результаты оценки ущерба фермента в наследственных лизосомных заболеваний обмена веществ. Эта рукопись является поправка к протоколу публикации ранее15. Наиболее важных изменений включают жесткости (то есть, в процессе подготовки мутант векторная конструкция), стандартизация протокол культуры клетки (то есть, HEK293H клетки обслуживания и transfection условия) и высокая количество экспериментальных повторений (по крайней мере 5), которые весьма способствовали воспроизводимость результатов. В целом оба целевых генов были легко доступны для мутагенеза и разносторонность мутации могут быть собраны в параллельном режиме. Относительно высокий сигнал/шум была достигнута, учитывая, что эндогенной ферментативной активности внутри клетки HEK293H был незначительным 1/50 (α-галактозидазы A) и 1/20 (кислоты альфа-глюкозидазы) гена чрезмерно выраженная дикого типа. Таким образом существует отличное разрешение между дикого типа и мутантов фермента. Следует отметить, что различное количество общего белка был применен для assay активность обоих ферментов (0,5 и 5 мкг, соответственно), потому что кислота альфа-глюкозидазы активность была на порядок ниже, чем у α-галактозидазы A.
Как указывалось выше, пробирного параметры часто являются спорным, поскольку многие лаборатории разработали свои собственные анализы расследовать лизосомальных основу. Системы могут отличаться в тип клеток, дизайн вектор плазмиды, условия культивирования и периода воздействия наркотиков, только, чтобы назвать несколько из многочисленных параметров. Недавно опубликованные мета анализ для болезнь Фабри продемонстрировал, что записи активности фермента (с и без ПК) transfected клеток моделей (например, HEK293, COS-7) во многом в соответствии с результаты, полученные из клеток пациента производные ( преимущественно лимфоцитов или фибробластов) в отношении вопроса, ли мутация реагировать PC24. Предыдущие доклады непосредственно сравнивать клетки пациента производные и трансфекции модели продемонстрировали, гиперэкспрессия системы отражают ситуацию в клетках больного без ущерба для заключения13,14. Можно таким образом сделать вывод, что, независимо от конкретного протокола, результаты, полученные разными авторами, не было изменено путем различных клеточных систем, несмотря на то, что ответчик определения могут быть разные. Определение текущего для ответивших мутации является повышение активности относительной фермента 20% и 5% абсолютной фермента активность увеличение по сравнению с дикого типа фермента после инкубации с 20 мкм DGJ для 60 h. Всеобъемлющей базы данных, FabryCEP, позволяет сравнения результатов различных экспериментальных подходов для сотен α-галактозидазы мутантов25.
Достаточны ли эти критерии для прогнозирования клинические преимущества DGJ и DNJ остается неясной, так как уровень активности, необходимые для предотвращения симптомом заболевания является спорным. Бывший исследование показало, что 10-15% остаточной активности может быть достаточно для нормальной работы26системы. Однако в недавно опубликованном докладе от фазы 2 Клинические исследования для DGJ, увеличение на 1% деятельности было сочтено потенциально выгодных для пациента, когда базовой деятельности было менее 1% нормальной27. Последние клинические результаты показывают, что пациенты, предсказал реагировать ПК ответчика определением каналов ≥20% относительное увеличение и ≥3% абсолютное увеличение дикого типа α-галактозидазы активность в клетках HEK293H после инкубации с 10 мкм DGJ на самом деле происходит клинические преимущества с болезнью стабилизации или даже улучшения параметров почечной и сердечной28. В то время как DGJ был уже одобрен FDA и Европейской комиссией как монотерапия болезнь Фабри, курс ПК, таких как DNJ и производные N-бутил-DNJ Pompe заболевания, как представляется, быть разными. Monotherapeutical подход с DNJ было прекращено во время фазы II клинических испытаний из-за тяжелых побочных реакций в некоторых пациентов29. Однако лечение ПК в сочетании с утвержденными ERT показали значительно улучшить результаты в отношении болезни субстрата (гликоген) сокращения по сравнению с ERT монотерапия30.
Мы предлагаем, что представленный подход может быть распространено на другие ЗПУ и другие компьютеры, такие как Гоше, Краббе, Тея-Сакса/Sandhoff и GM1 gangliosidosis, но это не может работать в конкретных случаях, где, например, соотношение сигнал/шум системы недостаточно. Следует позаботиться о том, чтобы выбрать подходящую ячейку метод срыв подготовить lysate клетки для определения активности фермента, потому что добавление моющих средств в литического буфера может быть показателем мембраны прыгните ферментов, таких как глюкоцереброзидазы в Болезнь Гоше в то время как аналогичные количество моющего средства может повредить другие ферменты. Для α-галактозидазы A следует избегать метод срыв на основе sonication клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать Мэнди Loebert и Тина Чайка за отличную техническую поддержку. Мы благодарим Luo Флора (Гарвардской медицинской школы, Бостон, MA, США) для языка редактирования помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
