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Medicine

In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56550

Summary

Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas "órfão" chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.

Abstract

O uso da medicina personalizada para tratar doenças monogénicas raras como doenças de depósito lisossômico (DDL) é desafiado por projetos complexos de julgamento clínicos, custos elevados e baixos números de paciente. Centenas de alelos mutantes estão implicadas na maior parte a DDL. As doenças geralmente são classificadas em 2 ou 3 diferentes tipos clínicos de acordo com a gravidade. Além disso, a caracterização molecular do genótipo pode ajudar a prever os resultados clínicos e informar o atendimento ao paciente. Portanto, nós desenvolvemos um ensaio de cultura de células simples baseado em células HEK293H heterologously over expressando as mutações identificadas na doença de Fabry e Pompe. Um ensaio semelhante foi recentemente introduzido como um teste pré-clínicos para identificar mutações favoráveis para a terapia farmacológica de acompanhante (PCT) na doença de Fabry. Este manuscrito descreve um ensaio de cultura de célula alterada que permite rápida avaliação fenotípica de variantes alélicas na doença de Fabry e Pompe para identificar pacientes elegíveis para PCT e pode ajudar no desenvolvimento do romance pharmacochaperones.

Introduction

Há dúzias de desordens de doenças de depósito lisossômico (DDL) relacionados a disfunção glicosidase como resultado de mutações do gene principal. Em Fabry (OMIM #301500) e a doença de Pompe (OMIM #232300), mais de 500 e 200 mutações missense1,2,3 têm sido relatadas, respectivamente, que corresponde a cerca de 60% da contagem total de mutação. Numerosas novas variantes do gene ainda estão sendo identificadas, muitos dos quais têm desconhecido significado. Extensos estudos bioquímicos revelaram que certos genótipos não conduziu a uma completa perda de função do gene ABL (OMIM * 300644) na doença de Fabry, mas causam a enzima correspondente a falha alcançar um estado de dobramento termodinamicamente favorecido4 . Isso resulta em retenção de ER e degradação prematura da enzima funcional caso contrário. Conclusões similares foram desenhadas em outros LSDs, incluindo a doença de Pompe5. Além disso, caracterização molecular das variantes da enzima pode facilitar a interpretação clínica das mutações no momento do diagnóstico6, sugerindo que a progressão de LSD é um processo individual, com base na natureza da mutação. Portanto, a classificação convencional em diferentes tipos clínicos normalmente de 2 a 3 deve ser reavaliada a fim de racionalizar o aconselhamento clínico e decisões terapêuticas.

Terapia de reposição enzimática (ERT) está disponível para ambas as doenças. ERT, no entanto, tem limitada eficácia em tecidos/órgãos afetados como o cérebro e o músculo esquelético. Além disso, a ERT pode eliciar uma resposta imunogênica que coloca em risco seus benefícios terapêuticos. Acompanhantes farmacológicas (PCs) são uma alternativa atraente de tratamento para pacientes com mutações responsivos so-called. PCes servem como um andaime molecular para proteínas correto e estabilização que por sua vez impede a retenção de retículo endoplasmático (ER) e ER-associado a degradação da enzima. Além disso, PCs podem ser administrados por via oral e são potencialmente capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica. Portanto, o PCT pode ser uma opção mais viável para o tratamento de pacientes com determinados genótipos. Para uma extensa revisão sobre aplicação de PC em DDL, consulte a excelente revisão por Parenti7.

A descoberta de centenas de doenças causando alelos mutantes desafia testar da droga do pre-clínica e exige uma avaliação simples, rápida e altamente padronizada de pacientes passíveis de uma abordagem de medicina personalizada. A fim de avaliar os efeitos nocivos de mutações do gene de LSD e testar mutações candidato para predizer pacientes passíveis de PCT, era um sistema de sobre-expressão altamente padronizados em células HEK293H que permite a medição de atividade enzimática rápida e confiável desenvolvido. Sistemas de sobre-expressão semelhantes têm sido descritos anteriormente para a doença de Fabry e Pompe com COS-78,9,10,11, de células HeLa12ou HEK29313 ,14,15,16 células para o gene glicosidase.

Um método muito semelhante mesmo foi patenteado como "Método para predizer a resposta ao tratamento farmacológico acompanhante de doenças"17 , indicando a relevância de uma célula de cultura sistema capaz de ser integrada na prática clínica.

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Protocol

1. preparação das construções de mutante pcDNA3.1/ABL e pcDNA3.1/GAA

Nota: As estratégias de clonagem para a ABL e GAA codificação de sequências (cds) têm sido relatados anteriores15,18.

  1. Mutagenesis local-dirigido usando o Mutagenesis local-dirigido
    1. Uso a referência sequências NM_000169.2 e NM_000152.4 como modelos para o mutagenesis de genes GLA e GA , respectivamente. Tenho um conjunto de alta pureza sal gratuito primers (25-37-mers) sintetizada por um provedor comercial, com sentido e antisentido primers carregando um das alterações respectivas sequência centrais ao seu comprimento apresentar individualmente a mutação. Use a ferramenta de projeto de epoxi para apoiar o projeto de cartilha19.
    2. Para a mistura de reação, use as condições padrão para a solução de reação e condições PCR fornecidas pelo fabricante.
      1. Mistura de 5 µ l de 10 x 10, amortecedor da reação ng modelo dupla-hélice do ADN do plasmídeo (pcDNA3.1/ABL ou pcDNA3.1/GAA), 125 ng de cada primer, 1 µ l da mistura fornecida dNTP, 3 µ l de reagente de DMSO em um volume adequado de água desionizada (volume final de reação : 50 Μ L). Finalmente, adicione 2,5 U de DNA polimerase e misturar pipetando para cima e para baixo. Como um controle negativo, transporte ao longo de uma amostra não-primer.
    3. Iniciar o PCR usando o programa a seguir: passo 1: 95 ° C por 1 min, passo 2: 95 ° C por 50 s, etapa 3: 60 ° C para 50 s, passo 4: 68 ° C por 8 min, repita a etapa 2-4 18 vezes e passo 5: 68 ° C por 10 min.
      1. PCR, a seguir adicione 1 µ l do Dpnenzima de restrição (10 U / µ l) e ainda mais, incubar o frasco de reação a 37 ° C por 1h.
  2. Transformação e triagem para o desejado Clone
    1. Transforme uma alíquota de células ultracompetent em conformidade com as recomendações do fabricante. Médio de utilização SOC (triptona 2% (p/v), levedura extrato 0,5% (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, esterilizar a 121 ° C e em seguida, adicionar soluções estéreis filtrada de MgCl2 e glicose até concentrações finais de 10 e 20 mM, respectivamente) em vez do fabricante médio. Após o procedimento, placa 250 µ l do mutagenesis de amostra em um LB contendo ampicilina de 100 µ g/mL a placa e incubar a 37 ° C por 18 h.
    2. Assegurar que o número de transformants é > 10 e a reação produz pelo menos três vezes mais colônias como a reação de controle não-primer, por exemplo, usando uma placa luminosa para facilitar a contagem de colônia. Em seguida, escolher 3 colônias e preparar 3 mL culturas durante a noite, no meio de caldo LB.
    3. No dia seguinte, realizar preparação de plasmídeo com um kit padrão e analisar toda a sequência usando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) e BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primers através de Sanger padrão sequenciamento.
    4. Use uma ferramenta adequada de biologia molecular para analisar a sequência. Quando a mutação desejada é detectada e não mais sequência anormalidade em relação ao NM_000169.2 (α-galactosidase A) ou NM_000152.4 (ácido α-glucosidase) é visto, selecione o clone para purificação de plasmídeo de transfeccao-grau.
    5. Determine a pureza do DNA por medir a absorvância em espectrofotómetro.
      Nota: Permitir que apenas os preparativos que rendem uma pureza de plasmídeo com um rácio de absorvância 260/280 de > 1.8 para celular cultura experiências.

2. cultivo de células HEK293H

  1. Manter as células HEK293H em glicose alta (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle suplementado (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina. Manter as células uma incubadora a 37 ° C, sob uma atmosfera de2 5% CO de water-jacket.
  2. Cultive as células para uma densidade de 80-90%.
  3. Aspire o meio e lavar uma vez usar o fosfato tampão salino (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +.
  4. Passagem pela adição de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO2.
  5. Dividi as células 01:15 em meio fresco e a semente para um novo balão T75 para manter a cultura permanente. Não utilize pilhas com mais de 25 passagens.

3. pcDNA3.1/ABL e pcDNA3.1/GAA transfeccao Plasmideo e tratamento de HEK293H

  1. 24 h antes o transfeccao, lavar as células HEK293H em um frasco de cultura celular T75 uma vez com PBS com Ca2 +, Mg2 +. As células com 0,05% Trypsin-EDTA como foi dito acima e semente de 1,5 x 105 células nas cavidades de uma placa de cultura bem 24 usando 500 µ l DMEM suplementado com 10% da colheita FBS sem antibióticos.
  2. Realize um protocolo de Transfeccao de acordo com o manual do fabricante. Normalmente, use uma mistura de 1 µ g de DNA de plasmídeo e 2,5 µ l de reagente de transfeccao em 100 µ l de soro livre DMEM. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente e adicionar às células de maneira algumas, depois disso.
  3. Remova a mídia que contém o reagente de transfeccao após um período de 4 h em 37 °C/5% CO2 e adicione 500 µ l de fresco DMEM com 10% FBS / 1% penicilina/estreptomicina.
    Nota: Durante esta etapa, cloridrato de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) ou cloridrato de 1-Deoxynojirimycin (DNJ) pode ser adicionado ao meio de cultura onde se destina (usar uma solução aquosa de estoque de 10 mM a fim de obter uma concentração final de 20 µM DGJ e DNJ ). Fresco DGJ ou DNJ foi adicionado h 42 depois de transfeccao Plasmideo.

4. celular colheita e α-galactosidase A ou medição de atividade de ácido α-glicosidase

  1. Colheita da pilha
    1. No dia da colheita, remover as células da incubadora e aspire o meio. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS com Ca2 + e Mg2 +.
      Nota: Esta etapa é essencial porque DGJ e DNJ são potentes inibidores da α-galactosidase e α-glucosidase, respectivamente, e qualquer sobra invalidaria o teste.
    2. Adicione 200 µ l de água desionizada diretamente sobre as células. Enxagúe as células da placa e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL.
  2. Homogeneização por congelamento e descongelamento
    1. Colocar as amostras em um rack de espuma apropriado e vórtice para 5 s para fazer a lise mais eficiente. Colocar as amostras alternando em nitrogênio líquido para 10 s e um banho de água de temperatura ambiente até o descongelamento foi completa (5 min).
    2. Repita este procedimento 5 vezes e em seguida girar as amostras durante 5 min à 10.000 x g.
Manter o sobrenadante e pipeta em um novo tubo de reação.
  • Determinação da concentração da proteína usando bicinchoninic ácido (BCA) ensaio
    1. Prepare um tubo fresco para cada amostra contendo 40 µ l de deionizada H2O e adicionar 10 µ l de amostra. Misturar a solução vortexing brevemente e transferir 10 µ l em uma cavidade de uma placa bem 96 (cada amostra em triplicata). Diluir uma solução de reserva de albumina de soro bovino (BSA) 2 mg/mL em desionizada H2O da seguinte maneira para obter uma curva padrão: 50 µ l H2O/50 µ l BSA; 60 µ l H2O/40 µ l BSA; 70 µ l H2O/30 µ l BSA; 80 µ l H2O/20 µ l BSA; 90 µ l H2O/10 µ l BSA; 100 µ l de H2O.
    2. Comece a reação adicionando-se 200 µ l de reagente BCA (Reagente A e Reagente B misturado na proporção de 50: 1) e incube por 1h no escuro a 37 ° C, sob agitação ligeira em um agitador orbital (300 rpm). Medir a absorvância a 560 nm em um leitor de placa.
      Nota: As amostras contêm tipicamente entre 1 e 1,5 µ g proteína por µ l.
  • Medição de atividade da enzima com substratos artificiais Methylumbelliferyl-4 (4-MUG)
    1. Dilua a quantidade calculada de cada amostra e pipeta nos tubos de reação fresca 1,5 mL para obter 0,05 (para A α-galactosidase) ou 0,5 (para ácido α-glucosidase) soluções de proteína / µ l µ g. Vórtice amostras para 5 s novamente e pipetar 10 µ l desta diluição em um 96 placa bem (cada amostra em duplicado).
    2. Inicie a reação pela adição de 20 µ l da solução de substrato respectivos:
      Para α-galactosidase r: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) em tampão de citrato de fosfato 0,06 M, pH 4,7.
      Para ácido α-glucosidase: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopiranósido (4-MU-glu) em acetato de sódio 0,025 M, pH 4.0.
    3. Incube as reacções enzimáticas por 1h no escuro a 37 ° C, sob agitação ligeira em um agitador orbital (300 rpm). Terminar a reação pela adição de 200 µ l de 1,0 M, tampão de pH 10,5 ajustado glicina-NaOH.
    4. Prepare uma curva padrão de 4-methylumbelliferone de um estoque de 0,01 mg/mL (4-MU), como segue:
      100 µ l de H2O / não 4-MU; 80 µ l H2O / 20 µ l 4-MU; 60 µ l H2O / 40 µ l 4-MU; 40 µ l H2O / 60 µ l 4-MU; 20 µ l H2O / 80 µ l 4-MU; Não H2O / 100 µ l 4-MU, pipetar 10 µ l de cada diluição em 96 poço da placa (em duplicatas) e adicione 200 µ l de buffer de glicina-NaOH 1.0 M a cada poço a fim de ajustar o volume e o pH.
    5. Medida da atividade enzimática em um leitor de fluorescência, equipado com o filtro apropriado definir e analisar os dados usando o software apropriado para o dispositivo do leitor de fluorescência.
      Nota: Ambos os substratos 4-caneca são reduzidos a 4-MU durante a exposição ao α-galactosidase A ou ácido α-glucosidase. 4-MU lançado é um fluorocromo, que pode ser medido em 360 e 465 nm como os excitação e emissão de comprimentos de onda, respectivamente, um leitor de fluorescência de microplaca.
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    Representative Results

    O procedimento de mutagênese
    Para avaliar a eficiência de mutagênese do gene ABL , as mutações foram classificadas em uma das seguintes categorias. Esta abordagem para gerar mutações revelou que cerca de 66,5% das mutações ABL foram obtidas na primeira tentativa. Mais 25% pode ser obtido após uma PCR segundo ligeiramente modificada.

    Categoria 1: O mutagenesis PCR foi eficaz na primeira tentativa.

    Categoria 2: Primeiro mutagenesis PCR falha (não há colônias na placa, nenhuma mutação inserida); conjunto de repetição usando a mesma cartilha, aumentando a temperatura do recozimento até 68 ° C foi eficaz.

    Categoria 3: Mais esforço teve que ser empreendidas para produzir o clone desejado (por exemplo, normalmente um ou mais novos conjuntos de primers foram desenhados).

    Α-galactosidase A e medição de atividade da enzima α-glicosidase ácida
    Atividade enzimática de diferentes enzimas mutantes foi gravada após incubação anterior das células transfectadas transitoriamente na presença ou ausência de um PC. Tabela 1 refere-se aos resultados para A de α-galactosidase 3 e 3 ácido α-glucosidase mutações. Os dados são exibidos como (1) valores absolutos para o volume de negócios de substrato (nmol 4-MU * mg proteína-1* h-1) e (2) relativos valores normalizados para a enzima do tipo selvagem. Ambas as expressões são úteis, desde que o volume de negócios total do substrato ilustra a eficiência da reação e a sensibilidade do sistema, enquanto os valores normalizados podem dar importantes dicas para a probabilidade da malignidade da mutação de um lado e o eficiência do tratamento aplicado por outro PC. Para a fase experimental, o fluxo de trabalho representado na Figura 1 foi criado, que programado um período de incubação de 60 h com o composto (devido a razões técnicas, por exemplo, HEK293H celular crescimento rápido nas condições introduzidas). Mesmo que tem sido afirmado que 10 µM foi a concentração de plasma atingível máxima aproximada para DGJ14, o atual protocolo usa 20 µM como uma concentração razoável com a finalidade de uma triagem para capacidade de resposta do PC como apoiada por numerosas no início funciona4,20,21,22,23. Além disso, foi postulado que níveis mais elevados do plasma podem ser alcançados24.

    Figure 1
    Figura 1 : Trabalho fluxo da em vitro medição de atividade de enzima. (A) a linha do tempo do experimento mostra um esforço de cultura de células de 90 h com relativamente pouco hands-on-tempo necessário nos pontos de tempo indicado. (B) pcDNA3.1 de vetores representativos do plasmídeo contendo os cds de tipo selvagem da ABL e GAA são mostrados. GLA e GAA plasmídeos de tipo selvagem e plasmídeos, incluindo a respectiva mutação inserida de interesse foram usados para transitoriamente transfect HEK293H células chapeadas em formato bem 24. Depois de um período para permitir que as células para sintetizar os produtos respectivos genes e permitir a transformação enzimática, transporte lisossomal e ação do PC, as células foram lysed e medido em um leitor de placa de fluorescência e analisaram utilizando o respectivo software. C: status de célula morfologia e crescimento das células HEK293H são mostrados ao longo do curso do tempo do experimento. Barras de escala = 100 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    atividade enzimática in vitro
    GLA nativo 20 ΜM DGJ
    mutação (AA) nmol 4-caneca-gal/mg/h (média) média % (±SD, N) nmol 4-caneca-gal/mg/h (média) média % (±SD, N) significado
    p.A143T 2384.7 29.2 (±2.6, 5) 4223.0 52,0 (±4.4, 5) ***
    p.A156V 379.2 4.3 (±. 8, 5) 1437.5 16.3 (±1.3, 5) ****
    p.R301Q 777.4 8.8 (±1.1, 5) 3002.6 44.2 (3,6, 5) ****
    GAA nativo DNJ 20 ΜM
    mutação (AA) nmol 4-caneca-glu/mg/h (média) média % (±SD, N) nmol 4-caneca-glu/mg/h (média) média % (±SD, N) significado
    p.Y455F 41.1 5.4 (±. 4, 5) 246.6 31,4 (±2.8, 5) ***
    p.P545L 65,7 6.6 (±. 4, 5) 166.5 16,7 (± 1,5, 5) **
    p.L552P 0.0 0,0 (±. 2, 5) 104.3 10.4 (±1.4, 5) ***

    Tabela 1: atividade enzimática das α-galactosidase A e o ácido α-glucosidase. A tabela mostra resultados representativos para A de α-galactosidase 3 e 3 ácido α-glucosidase mutantes com e sem o PCs DGJ ou DNJ. Dados de atividade de enzima absoluto foi corrigidos para a atividade de enzima endógena das células HEK293H. Para avaliar a atividade da enzima endógena, as células foram transfectadas com um vetor vazio pcDNA3.1. Os valores foram 97,5 nmol 4-MU * mg proteína-1* h-1 para α-galactosidase A e 41.6 nmol 4-MU * mg proteína-1* h-1 para α-glicosidase ácida, respectivamente; valores de atividade de enzima foram normalizados a enzima do tipo selvagem de experimentos correspondentes, o que explica os desvios dos valores relativos entre os mutantes diferentes.Depois de 5 experiências de cultura de células independentes (N = 5), cada um realizado em técnicas duplicatas, o desvio padrão não pôde ser > 15% da média. Relação T-testes foram utilizados para calcular a diferença entre a enzima não tratada e tratada com PC.
    * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.005, * * * p < 0.001

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    Discussion

    O protocolo descrito neste documento proporciona resultados robustos para avaliação dos danos da enzima em doenças lisossômicas hereditárias do metabolismo. Este manuscrito é que uma alteração do protocolo publicado anteriores15. As modificações mais cruciais envolvem rigor (ou seja, no processo de preparação de construção vector mutante), padronização do protocolo de cultura de célula (ou seja, as condições de manutenção e transfecção de células HEK293H) e a alta número de repetições experimentais (pelo menos 5), que muito contribuiu para a reprodutibilidade dos resultados. No total, ambos os genes alvo tem sido facilmente acessíveis para o mutagenesis e uma multiplicidade de mutações pode ser montada em paralelo. Uma relação sinal/ruído relativamente alto foi alcançada, Considerando que a atividade de enzima endógena dentro das células de HEK293H era um insignificante 1/50 (α-galactosidase A) e 1/20 (ácido α-glucosidase) do gene over expressa tipo selvagem. Assim, há uma excelente resolução entre tipo selvagem e enzima mutante. Note-se que uma quantidade diferente de proteína total foi aplicada para o ensaio da atividade de duas enzimas (0,5 e 5 µ g, respectivamente), porque a atividade da α-glicosidase ácida foi uma ordem de magnitude menor do que da α-galactosidase A.

    Como dito acima, parâmetros de ensaio são muitas vezes controversos, desde que muitos laboratórios desenvolveram seus próprios ensaios para investigar glicosidases lisossomal. Os sistemas podem diferir no tipo de célula, plasmídeo-vector design, condições de cultivo e período de exposição da droga só para citar alguns dos inúmeros parâmetros. Uma meta-análise publicada recentemente para a doença de Fabry demonstrou que gravações de atividade enzimática (com e sem PC) de modelos de células transfectadas (por exemplo, HEK293, COS-7) foi em grande parte, em conformidade com os resultados obtidos de células derivadas de paciente ( na sua maioria linfócitos ou fibroblastos) em relação à questão, se uma mutação é ágil para o PC24. Relatórios anteriores, comparando diretamente o paciente-derivado de células e modelos de transfeccao demonstraram que sistemas sobre-expressão refletem a situação no pacientes células sem comprometer a conclusão13,14. Pode portanto concluir-se que, independentemente do protocolo específico, os resultados obtidos por diferentes autores não foi alterada pelos diferentes sistemas celulares, mesmo que o respondente definições podem ser divergentes. A definição atual para uma mutação de resposta é o aumento de atividade de enzima relativa de 20% e aumento de atividade de enzima absoluta de 5% em comparação com a enzima de tipo selvagem após incubação com 20 µM DGJ para 60 h. Um banco de dados abrangente, FabryCEP, permite a comparação dos resultados obtidos por diferentes abordagens experimentais para centenas de α-galactosidase mutantes25.

    Se esses critérios são suficientes para prever os benefícios clínicos da DGJ e DNJ permanece obscuro, uma vez que o nível de atividade necessário para impedir doença sintomática é controverso. Um estudo anterior sugeriu que 10 a 15% de atividade residual pode ser suficiente para o sistema funcionar corretamente26. No entanto, em um relatório publicado recentemente de um estudo clínico de fase 2 para DGJ, um aumento de 1% de atividade foi considerado potencialmente benéfico para o paciente, quando a atividade de linha de base foi menos de 1% do normal27. Resultados clínicos recentes sugerem que pacientes previstos para responder para PCs pela definição de aumento relativo de ≥ 20% e ≥3% aumento absoluto de tipo selvagem α-galactosidase Respondente uma atividade nas células HEK293H após incubação com 10 µM DGJ derivada na verdade benefício clínico com a estabilização da doença ou mesmo melhoria por parâmetros renais e cardíacas28. Considerando que DGJ já foi aprovado pela FDA e a Comissão Europeia como monoterapia para a doença de Fabry, o curso de PCs como DNJ e o derivado N-butil-DNJ na doença de Pompe parece ser diferente. Uma abordagem monotherapeutical com DNJ foi encerrada durante um ensaio clínico de fase II, devido a eventos adversos graves em alguns pacientes29. No entanto, tratamento de PC em combinação com aprovado ERT mostrou resultados significativamente melhorados com relação à redução de substrato (glicogênio) doença em comparação com a monoterapia ERT30.

    Sugerimos que a abordagem apresentada pode ser estendida para outros LSDs e outros PCs como Krabbe Gaucher, Tay-Sachs/Sandhoff e Gangliosidose GM1, mas isso pode não funcionar em casos específicos, onde por exemplo a relação sinal/ruído do sistema é insuficiente. Tenha cuidado para selecionar um método de ruptura celular adequada para preparar um lisado celular para determinação da atividade da enzima, porque a adição de detergentes para a Lise pode ser indicativa de enzimas de membrana-limite como a glucocerebrosidase em Doença de Gaucher enquanto quantidades semelhantes de detergente podem prejudicar outras enzimas. Para A α-galactosidase, um método de perturbação à base sonication da célula deve ser evitado.

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    Disclosures

    Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

    Acknowledgments

    Os autores que gostaria de agradecer a Mandy Loebert e Tina Czajka por excelente suporte técnico. Agradecemos a Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, EUA) para o idioma de edição ajuda.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Medicina edição 130 doença de depósito lisossômico fenótipo glicosidase pequena molécula drogas testes pré-clínicos terapia personalizada
    <em>In Vitro</em> Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe
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    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

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