Summary
Der er et krav til præ-klinisk test for en ny klasse af "sjældne" lægemidler kaldet farmakologiske chaperoner reproducerbar, hurtig og effektiv. Vi udviklet en enkel, meget standardiserede og alsidig celle kultur-baseret analyse til skærmen for støtteberettigede patienter samt roman farmakologiske anstandsdame lægemidler.
Abstract
Brug af personlig medicin til at behandle sjældne monogene sygdomme som lysosomale opbevaring lidelser (LSDs) udfordres af komplekse kliniske forsøgsdesign, høje omkostninger og lave patient numre. Hundredvis af muterede alleler er involveret i de fleste af LSDs. Sygdommene er typisk inddeles i 2 til 3 forskellige kliniske typer efter sværhedsgraden. Derudover kan molekylær karakterisering af genotype hjælpe forudsige kliniske resultater og informere patientpleje. Derfor, har vi udviklet en simpel celle kultur analysen baseret på HEK293H celler heterologously over at udtrykke de mutationer, der er identificeret i Fabry og Pompe sygdom. En lignende analyse er for nylig blevet indført som en prækliniske test til at identificere medgørlige mutationer for farmakologiske anstandsdame terapi (PCT) i Fabry sygdom. Dette manuskript beskriver en ændrede celle kultur analyse, som muliggør hurtig fænotypiske vurdering af allel varianter i Fabry og Pompe sygdom at identificere støtteberettigede patienter for PCT og kan støtte i udviklingen af nye pharmacochaperones.
Introduction
Der er over et dusin lysosomale opbevaring lidelser (LSDs) vedrørte glycosidase dysfunktion som følge af primære genmutationer. I Fabry (OMIM #301500) og Pompe (OMIM #232300) sygdom, mere end 500 og 200 missense mutationer1,2,3 er blevet rapporteret, henholdsvis, der svarer til omkring 60% af den samlede mutation tælle. Adskillige nye gen-varianter er stadig at blive identificeret, hvoraf mange har ukendt betydning. Omfattende biokemiske undersøgelser afslørede, at visse genotyper ikke fører til en komplet tab af funktion af GLA genet (OMIM * 300644) i Fabry sygdom, men medføre tilsvarende enzymet ikke kan nå en termodynamisk begunstiget folde tilstand4 . Dette resulterer i ER opbevaring og for tidlig forringelse af den ellers funktionelle enzym. Lignende konklusioner er draget i andre LSDs herunder Pompe sygdom5. Derudover kan molekylær karakterisering af enzymet varianter lette kliniske fortolkning af mutationerne på tidspunktet for diagnosen6, tyder på, at LSD progression er en individuel proces baseret på arten af mutationen. Derfor, den traditionelle klassifikation i typisk 2-3 forskellige kliniske typer bør revurderes for at strømline kliniske rådgivning og terapeutiske beslutninger.
Enzym substitutionsterapi (ERT) er tilgængelig for begge sygdomme. ERT, men har begrænset effektivitet i berørte væv/organer som hjerne og skeletmuskulatur. Derudover kan ERT fremkalde en immunogen reaktion, som truer dens terapeutiske fordele. Farmakologiske chaperoner (PCs) er et attraktivt behandling alternativ til patienter med såkaldt lydhør mutationer. Pc'er tjene som en molekylær stillads til korrekte proteinfoldning og stabilisering, hvilket igen forhindrer endoplasmatiske reticulum (ER) tilbageholdelse og ER-associeret nedbrydning af enzymet. Derudover pc'er kan indgives oralt og kan potentielt krydse blod-hjerne barrieren. Derfor, PCT kan være en mere farbar vej til behandling af patienter med visse genotyper. For en omfattende revision på PC program i LSDs, henvise til den fremragende gennemgang af parti7.
Opdagelsen af hundredvis af sygdom, der forårsager mutante alleler udfordrer prækliniske dopingkontrol og nødvendiggør en enkel, hurtig og meget standardiseret vurdering af medgørlige patienter en personlig medicin tilgang. For at vurdere de skadelige virkninger af LSD genmutationer og teste kandidat mutationer for at forudsige medgørlige patienter for PCT var en meget standardiseret over ekspressionssystem i HEK293H celler, der giver mulighed for hurtig og pålidelig enzym aktivitet målingen udviklet. Lignende overdrevne udtryk systemer har været tidligere beskrevet for Fabry og Pompe sygdom ved hjælp af enten COS-78,9,10,11, HeLa celler12, eller HEK29313 ,14,15,16 celler for glycosidase genet.
En meget lignende metode har endda været patenteret som en "metode til at forudsige svar på farmakologiske anstandsdame behandling af sygdomme"17 viser relevansen af en celle kultur system i stand til at blive integreret i klinisk praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af Mutant pcDNA3.1/GLA og pcDNA3.1/GAA konstruktioner
Bemærk: Kloning strategierne for GLA og GAA kodning sekvenser (cd'er) er blevet rapporteret tidligere15,18.
- Site-directed mutagenese bruger Site-Directed mutagenese
- Brug henvisningen sekvenser NM_000169.2 og NM_000152.4 som skabeloner for mutagenese af GLA og GAA gener, henholdsvis. Har et sæt af høj renhed salt gratis primere (25-37-mers) syntetiseret af en kommerciel udbyder med fornuft og antisensstoffer primere med én af de respektive sekvens ændringer centrale til deres længde individuelt indføre mutationen. Brug gratis primer designværktøj til at støtte primer design19.
- Reaktionsblandingen, bruge standardbetingelser for reaktion løsning og PCR betingelser fastsat af fabrikanten.
- Mix 5 µL af 10 x reaktion buffer, 10 ng af dobbelt-strenget skabelon plasmid DNA (pcDNA3.1/GLA eller pcDNA3.1/GAA), 125 ng hver primer, 1 µL af den medfølgende dNTP blanding, 3 µL af DMSO reagens i et passende volumen af deioniseret vand (endelige reaktion volumen : 50 ΜL). Endelig, tilføje 2,5 U af DNA polymerase og mix af pipettering op og ned. Som en negativ kontrol, bære langs en no-primer prøve.
- Start PCR ved hjælp af følgende program: trin 1: 95 ° C i 1 min., trin 2: 95 ° C til 50 s, trin 3: 60 ° C til 50 s, trin 4: 68 ° C i 8 min, skal du gentage trin 2-4 18 gange og trin 5: 68 ° C i 10 min.
- Efter PCR, tilføje 1 µL af Dpnjeg begrænsning enzym (10 U/µL) og yderligere Inkuber prøveglas ved 37 ° C i 1 time.
- Transformation og Screening for den ønskede klon
- Omdanne en alikvot af ultracompetent celler i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Brug SOC medium (trypton 2% (w/v), gær ekstrakt 0,5% (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, sterilisere ved 121 ° C, og derefter tilføje steril-filtreret løsninger af MgCl2 og glucose op til endelige koncentrationer af 10-20 mM, henholdsvis) i stedet for producentens medium. Efter proceduren, plade 250 µL af prøven mutagenese på en LB plade med 100 µg/mL ampicillin og inkuberes ved 37 ° C i 18 h.
- Forsikre om, at antallet af transformants > 10 og reaktionen udbytter mindst tre gange så mange kolonier som no-primer kontrol reaktion, fxved hjælp af en selvlysende plade til at lette koloni optælling. Derefter vælge 3 kolonier og forberede 3 mL overnight kulturer i LB bouillon medium.
- Den næste dag, udføre plasmid forberedelse med en standard kit og analysere hele sekvensen ved hjælp af T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) og BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primere via standard Sanger sekvensering.
- Brug en passende Molekylærbiologi værktøj til at analysere sekvensen. Når den ønskede mutation er fundet og ingen yderligere sekvens abnormitet i forhold til NM_000169.2 (α-galactosidase A) eller NM_000152.4 (syre α-glucosidase) ses, skal du vælge klon for Transfektion-grade plasmid rensning.
- Bestemme renheden af DNA ved måling af absorbans i et spektrofotometer.
Bemærk: Tillad kun præparater, der giver et plasmid renhed med 260/280 absorbans forholdet > 1,8 for celle kultur eksperimenter.
2. dyrkning af HEK293H celler
- Opretholde HEK293H celler i høje glukose (4,5 g/L) Dulbecco´s ændret Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin. Holde cellerne en water-jacket varmeskab ved 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære.
- Dyrke celler til en tæthed på 80-90%.
- Opsug mediet og vaske når ved hjælp af phosphat bufferet saltvand (PBS) uden Ca2 + og Mg2 +.
- Passage ved at tilføje 0,05% Trypsin-EDTA og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C og 5% CO2.
- Opdele celler 1:15 i frisk medium og frø i en ny T75 kolben til at opretholde den permanente kultur. Brug ikke celler med mere end 25 passager.
3. pcDNA3.1/GLA og pcDNA3.1/GAA Plasmid Transfektion og behandling af HEK293H
- 24 timer før Transfektion, vaske HEK293H cellerne i en T75 celle kultur kolbe engang med PBS med Ca2 +, Mg2 +. Høste celler med 0,05% Trypsin-EDTA som anført ovenfor og frø 1,5 x 105 celler i hulrum i en 24 godt kultur plade bruge 500 µL DMEM medium suppleret med 10% FBS uden antibiotika.
- Udføre en Transfektion protokol ifølge producentens manual. Normalt brug en blanding af 1 µg plasmid DNA og 2,5 µL Transfektion reagens i 100 µL serum-gratis DMEM. Inkuber i 20 min. ved stuetemperatur og føje til celler på en drop-wise måde derefter.
- Fjern mediet indeholdende Transfektion reagens efter en periode af 4 h på 37 °C/5% CO2 og tilsæt 500 µL af frisk DMEM med 10% FBS / 1% penicillin/streptomycin.
Bemærk: Under dette trin 1-Deoxygalactonojirimycin hydrochlorid (DGJ) eller 1-Deoxynojirimycin hydrochlorid (DNJ) kan tilføjes til dyrkningsmediet tilbagekøbte (brug en vandig stamopløsning af 10 mM for at opnå en endelig koncentration på 20 µM DGJ og DNJ ). Frisk DGJ eller DNJ blev tilføjet 42 h efter plasmid Transfektion.
4. celle høst og α-galactosidase A eller syre α-glucosidase aktivitet måling
- Celle høst
- På dagen for høsten, fjerne celler fra rugemaskinen og Opsug mediet. Forsigtigt vaske cellerne 2 gange med PBS med Ca2 + og Mg2 +.
Bemærk: Dette trin er kritisk, fordi DGJ og DNJ er potente hæmmere af α-galactosidase og α-glucosidase, henholdsvis, og eventuelle rester ville afkræfte testen. - Tilføje 200 µL med deioniseret vand direkte på cellerne. Skyl celler fra pladen og overføre dem til en 1,5 mL reaktion tube.
- På dagen for høsten, fjerne celler fra rugemaskinen og Opsug mediet. Forsigtigt vaske cellerne 2 gange med PBS med Ca2 + og Mg2 +.
- Homogenisering af nedfrysning og optøning
- Sætte prøverne i en passende skum rack og vortex for 5 s til at effektivisere lysering. Sætte prøver skiftevis i flydende nitrogen for 10 s og i vandbad i stuetemperatur indtil optøs var komplet (5 min).
- Gentag denne procedure 5 gange og derefter dreje prøver i 5 min på 10.000 x g.
- Forberede en frisk rør til hver prøve, der indeholder 40 µL med deioniseret vand H2O og tilsæt 10 µL af prøven. Bland løsning af vortexing kort og overføre 10 µL i et hulrum i en 96 godt plade (hver prøve i tre eksemplarer). Fortynde en 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) stamopløsning i ionbyttet H2O således at opnå en standardkurve: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- Start reaktionen ved at tilføje 200 µL af BCA reagens (reagens A og reagens B blandes i forholdet 50: 1) og Inkuber i 1 time i mørke ved 37 ° C under lille agitation på en orbitalryster (300 rpm). Absorbansen måles på 560 nm i en pladelæseren.
Bemærk: Prøverne indeholder typisk mellem 1 og 1,5 µg protein pr. µL.
- Fortynd det beregnede beløb for hver stikprøve og afpipetteres i frisk 1,5 mL reaktion rør få 0,05 (til α-galactosidase A) eller 0,5 (for acid α-glucosidase) µg protein/µL løsninger. Vortex prøver for 5 s igen og afpipetteres 10 µL af denne fortynding i en 96 godt plade (hver prøve i to eksemplarer).
- Start reaktionen ved at tilføje 20 µL af de respektive substratopløsning:
Til α-galactosidase A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) i 0,06 M fosfat citratbuffer, pH 4.7.
For syre α-glucosidase: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) i 0,025 M natriumacetat, pH 4,0. - Inkuber enzym reaktioner i 1 timer i mørke ved 37 ° C under lille agitation på en orbitalryster (300 rpm). Opsige reaktionen ved tilsætning af 200 µL i 1,0 M, pH 10.5 justerede glycin-NaOH buffer.
- Forberede en standardkurve for 4-methylumbelliferone (4-MU) fra en 0,01 mg/mL bestand som følger:
100 µL H2O / ikke 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; H2O / 100 µL 4-MU, afpipetteres 10 µL af hver fortynding i 96 brønden plade (i dubletter) og tilføje 200 µL i 1,0 M Glycin-NaOH buffer til hver brønd for at justere lydstyrken og pH. - Foranstaltning enzymaktivitet i et fluorescens læser udstyret med passende filtersæt og analysere data ved hjælp af passende software til fluorescens læser indretning.
Bemærk: Begge 4-krus substrater er reduceret til 4-MU under eksponering til α-galactosidase A eller syre α-glucosidase. Udgivet 4-MU er en fluorokrom, der kan måles på 360 og 465 nm som excitations- og bølgelængder, henholdsvis ved hjælp af en mikrotiterplade fluorescens læser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutagenese procedure
For at vurdere effektiviteten af GLA genet mutagenese, var mutationerne klassificeret i en af følgende kategorier. Denne fremgangsmåde til at generere mutationer afslørede, at omkring 66,5% af GLA mutationer blev indhentet i første forsøg. Yderligere 25% kunne opnås efter en lidt ændret andet PCR.
Kategori 1: Mutagenese PCR var effektive i første forsøg.
Kategori 2: Første mutagenese PCR mislykkedes (ingen kolonier på pladen, ingen indsatte mutation); gentagelse ved hjælp af den samme primer indstillet ved at øge den udgloedning temperatur op til 68 ° C var effektiv.
Kategori 3: Mere indsats skulle være forpligtet sig til at give den ønskede klon (f.eks.typisk et eller flere nye sæt primere var designet).
Α-galactosidase A og syre α-glucosidase enzym aktivitet måling
Enzymaktivitet af forskellige enzymer, mutant blev optaget efter tidligere inkubation af forbigående transfected celler i tilstedeværelse eller fravær af en PC. Tabel 1 henviser til resultaterne for 3 α-galactosidase A og 3 syre α-glucosidase mutationer. Data vises som absolutte værdier (1) substrat omsætning (nmol 4-MU * mg protein-1* h-1) og (2) relative værdier normaliseret til vildtype enzym. Begge udtryk er nyttige, da samlede substrat omsætning viser effektiviteten af reaktionen og følsomheden af systemet, mens de normaliserede værdier kan give vigtige tips til sandsynligheden for malignitet af mutation på den ene side og den effektiviteten af de anvendte PC behandling på anden side. For den eksperimentelle fase, blev arbejdsflow afbildet i figur 1 sat op, som planlagt en 60 h inkubationstiden med sammensatte (af tekniske årsager, fx hurtig HEK293H cellevækst på indførte betingelser). Selvom det er blevet sagt, at 10 µM var det omtrentlige maksimale opnåelige plasmakoncentration til DGJ14, den nuværende protokol bruger 20 µM som en rimelig koncentration med henblik på screening for PC lydhørhed som støttet af talrige tidligere arbejder4,20,21,22,23. Derudover har været postuleret, at højere plasmaniveauer nås24.
Figur 1 : Arbejde flow af de in vitro- enzym aktivitet måling. (A) tidslinjen af eksperimentet viser en 90 h celle kultur indsats med relativt lille hands-on-on-tid, der kræves på de angivne tidspunkter. (B) repræsentative plasmid vektorer pcDNA3.1 indeholdende vildtype cds af GLA og GAA er vist. GLA og GAA vildtype plasmider og plasmider, herunder de respektive indsatte mutation af interesse blev brugt til forbigående transfect HEK293H celler beklæde i 24 godt format. Efter en periode at tillade cellerne til at syntetisere de respektive genprodukter og muliggøre enzym behandling, lysosomale transport og PC handling, cellerne var mængden og målt i et fluorescens-Pladelæser og analyseret ved hjælp af de respektive software. C: celle morfologi og vækst status af HEK293H celler er vist hele tiden løbet af eksperimentet. Skalere barer = 100 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| in vitro-enzymaktivitet | |||||
| GLA | Native | 20 ΜM DGJ | |||
| mutation (AA) | nmol 4-krus-gal/mg/h (gennemsnit) | % betyder (±SD, N) | nmol 4-krus-gal/mg/h (gennemsnit) | % betyder (±SD, N) | betydning |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8.8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44,2 (±3.6, 5) | **** |
| GAA | Native | 20 ΜM DNJ | |||
| mutation (AA) | nmol 4-krus-glu/mg/h (gennemsnit) | % betyder (±SD, N) | nmol 4-krus-glu/mg/h (gennemsnit) | % betyder (±SD, N) | betydning |
| p.Y455F | 41,1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31.4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65,7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166.5 | 16,7 (±1.5, 5) | ** |
| p.L552P | 0,0 | 0,0 (±. 2, 5) | 104.3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Tabel 1: enzymaktivitet af α-galactosidase A og syre α-glucosidase. Tabellen viser repræsentative resultater for 3 α-galactosidase A og 3 syre α-glucosidase mutanter med og uden stk DGJ eller DNJ. Absolut enzym aktivitetsdata blev korrigeret for endogene enzymaktivitet af HEK293H celler. For at evaluere endogene enzymaktiviteten, var cellerne transfekteret med en pcDNA3.1 tomt vektor. Værdierne var 97.5 nmol 4-MU * mg protein-1* h-1 for α-galactosidase A og 41.6 nmol 4-MU * mg protein-1* h-1 for syre α-glucosidase, henholdsvis; enzym aktivitet værdier var normaliseret til vildtype enzym fra tilsvarende eksperimenter, hvilket forklarer afvigelser af relative værdier mellem de forskellige mutanter.Efter 5 uafhængige celle kultur eksperimenter (N = 5), hver udført i tekniske dubletter, standardafvigelsen fik ikke lov til at være > 15% af gennemsnitlige. Forholdet T-test anvendtes til at beregne forskellen mellem ubehandlet og PC-behandlede enzym.
* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005, *** p < 0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet heri leverer solide resultater for enzymet skadesvurdering i arvelige lysosomale sygdomme i stofskiftet. Dette manuskript er en ændring til protokollen offentliggjort tidligere15. De mest afgørende ændringer indebærer strenghed (dvs., ved at mutant vektor konstruere forberedelse), standardisering af celle kultur protokol (dvs, HEK293H celle vedligeholdelse og Transfektion betingelser), og høje antallet af eksperimentelle gentagelser (mindst 5), der stærkt bidraget til reproducerbarhed af resultaterne. Helt, begge mål gener er blevet let tilgængelig for mutagenese og en mangfoldighed af mutationer kan samles i parallel. Et relativt højt signal/støj forholdet blev opnået at endogene enzymaktivitet inden for HEK293H cellerne var en ubetydelig 1/50 (α-galactosidase A) og 1/20 (syre α-glucosidase) af over udtrykt vildtype genet. Der er således en fremragende beslutning mellem vildtype og mutant enzym. Det skal bemærkes, at en forskellige mængde af total protein blev anvendt til aktivitet assay af begge enzymer (0,5 og 5 µg, henholdsvis), fordi syre α-glucosidase aktivitet var en størrelsesorden lavere end α-galactosidase-A.
Som anført ovenfor, er assay parametre ofte kontroversielle, da mange laboratorier har udviklet deres egen assays for at undersøge lysosomale glykosidaser. Systemerne kan afvige i celletype, plasmid-vektor design, dyrkning betingelser og periode af stof eksponering bare for at nævne et par af de mange parametre. En nyligt offentliggjort meta-analyse for Fabry sygdom viste, at enzym aktivitet optagelser (med og uden PC) transfekteret cell modeller (f.eks.HEK293, COS-7) var stort set i overensstemmelse med resultaterne fra patient-afledte celler ( for det meste lymfocytter eller fibroblaster) med hensyn til spørgsmålet, om en mutation er lydhør over for PC24. Tidligere rapporter direkte sammenligning af patient-afledte celler og Transfektion modeller viste, at overdrevne udtryk systemer afspejler situationen i patientens celler uden at kompromittere konklusion13,14. Det kan derfor konkluderes, at uanset den protokol, resultaterne af forskellige forfattere ikke blev ændret ved de forskellige cellulære systemer, selvom responder definitioner kan være divergerende. Den nuværende definition for en besvarende mutation er 20% relativ enzym aktivitet stigning og 5% absolut enzym aktivitet stigning sammenlignet med vildtype enzym efter inkubation med 20 µM DGJ for 60 h. En omfattende database, FabryCEP, tillader sammenligning af resultaterne af forskellige eksperimentelle metoder for hundredvis af α-galactosidase mutanter25.
Om disse kriterier er tilstrækkelig til at forudsige kliniske fordele af DGJ og DNJ er fortsat uklart, da aktivitetsniveauet nødvendigt at forhindre symptomatisk sygdom er kontroversielle. En tidligere undersøgelse antydede, at 10-15% af resterende aktivitet kan være tilstrækkelig for at systemet kan fungere korrekt26. Dog i en nyligt offentliggjort rapport fra en fase 2 klinisk undersøgelse for DGJ, en stigning på 1% aktivitet blev anset for potentielt gavnlig for patienten, når den oprindelige aktivitet var mindre end 1% af normal27. Nylige kliniske resultater tyder på, at patienter forudsagt til at reagere på pc'er med responder definitionen af ≥20% relativ stigning og ≥3% absolut stigning af vildtype α-galactosidase en aktivitet i HEK293H celler efter inkubation med 10 µM DGJ faktisk stammer klinisk fordel med sygdom stabilisering eller endog forbedring af nyre og hjerte parametre28. DGJ er allerede blevet godkendt af FDA og Europa-Kommissionen som en monoterapi for Fabry sygdom, synes løbet af pc'er som DNJ og afledt N-Butyl-DNJ i Pompe sygdom at være anderledes. En monotherapeutical tilgang med DNJ har været afbrudt under en fase II klinisk studie på grund af alvorlige uønskede hændelser i nogle af patienterne29. PC behandling i kombination med godkendte ERT viste imidlertid betydeligt bedre resultater med hensyn til sygdommen substrat (glykogen) reduktion i forhold til ERT monoterapi30.
Vi foreslår at den præsenterede tilgang kan udvides til at omfatte andre LSDs og andre pc'er som Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff og GM1 gangliosidosis, men dette kan ikke arbejde i særlige tilfælde, hvor for eksempel signal/støjforhold af systemet er utilstrækkelig. Pleje bør tages til at vælge en passende celle forstyrrelser metode til at forberede en lysate celle til enzym aktivitet bestemmelse, fordi tilsætning af vaske-og rengøringsmidler i lysisbuffer kan være vejledende for membran-bundet enzymer såsom glucocerebrosidase i Gaucher sygdom samtidig tilsvarende mængder af vaske-og rengøringsmidler kan skade andre enzymer. Til α-galactosidase A, bør en sonikering-baserede celle forstyrrelser metode undgås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende Mandy Loebert og Tina Czajka for fremragende teknisk support. Vi takker Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) for sprog redigering hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
