Summary
Det er et behov å pre-klinisk testing av en roman klasse av "linjer" legemidler kalt farmakologiske chaperones reproduserbare, rask og effektiv. Vi utviklet en enkel, svært standardisert og allsidig celle kultur-baserte analysen til skjermen for kvalifisert pasienter samt romanen farmakologiske Anstandsdame narkotika.
Abstract
Bruk av personlig medisin for å behandle sjeldne monogenic sykdommer som lysosomale lagring lidelser (LSDs) er utfordret av komplekse kliniske prøve design, høye kostnader og lav pasienten tall. Hundrevis av mutant alleler er innblandet i de fleste av LSDs. Sykdommer er vanligvis klassifisert i 2 til 3 forskjellige kliniske typer etter alvorlighetsgrad. Molekylær karakterisering av genotype kan videre hjelpe forutsi kliniske utfall og informere pasientbehandlingen. Derfor utviklet vi en enkel kultur analysen basert på HEK293H celler heterologously over uttrykke mutasjoner i Fabrys og Pompe sykdom. En lignende analysen har nylig blitt introdusert som en prekliniske test å identifisere mutasjoner mottakelig for farmakologisk Anstandsdame terapi (PCT) i Fabrys sykdom. Dette manuskriptet beskriver en endret celle kultur analysen som muliggjør rask fenotypiske vurdering allel varianter i Fabrys og Pompe sykdom å identifisere kvalifiserte pasienter for PCT og kan hjelpe til med utviklingen av romanen pharmacochaperones.
Introduction
Det er over et dusin lysosomale lagring lidelser (LSDs) knyttet til glycosidase dysfunksjon som følge av primære genet mutasjoner. I Fabrys (sette OMIM #301500) og Pompe (sette OMIM #232300) sykdom, mer enn 500 og 200 eks. missense mutasjoner har blitt rapportert1,2,3 , henholdsvis som tilsvarer ca 60% av den totale mutasjon tellingen. Mange nye genet varianter er fremdeles identifisert, hvorav mange har ukjente betydning. Omfattende biokjemiske studier viste at visse genotyper ikke føre til en fullstendig tap-av-funksjon av GLA genet (sette OMIM * 300644) i Fabrys sykdom, men føre tilsvarende enzymet mislykkes å nå en thermodynamically favoriserte folding tilstand4 . Dette resulterer i ER oppbevaring og tidlig nedbrytning av ellers funksjonelle enzymet. Lignende konklusjoner er trukket i andre LSDs inkludert Pompe sykdom5. Videre kan molekylær karakteristikk av enzymet varianter lette klinisk tolkning av mutasjoner ved diagnose6, antyder at LSD progresjon er en enkelt prosess basert på innholdet i mutasjon. Derfor bør konvensjonelle klassifisering i vanligvis 2 til 3 forskjellige kliniske bli omvurdere å effektivisere klinisk rådgivning og terapeutiske beslutninger.
Enzym erstatning terapi (ERT) er tilgjengelig for begge to sykdommen. ERT, men har begrenset effekt i berørte vev/organer som hjernen og skjelettlidelser muskel. Videre kan ERT framprovosere en immunogenic svar som truer de terapeutiske fordelene. Farmakologiske Chaperones (stk.) er et attraktivt behandling alternativ for pasienter med såkalte forståelsesfull mutasjoner. PCer tjene som en molekylær stillaset for riktig proteinfolding og stabilisering som igjen hindrer endoplasmatiske retikulum (ER) oppbevaring og ER-assosiert nedbrytning av enzymet. Videre PCer kan gis muntlig og kunne potensielt krysse blod-hjernebarrieren. Derfor kan PCT være et mer levedyktig alternativ for behandling av pasienter med visse genotyper. Se utmerket gjennomgang av Parenti7for en omfattende gjennomgang på PC-programmet i LSDs.
Oppdagelsen av hundrevis av sykdomsfremkallende mutert alleler utfordrer pre-klinisk narkotikatesting og nødvendiggjør en enkel, rask og svært standardisert vurdering av mottakelig pasienter for en personlig medisin tilnærming. For å vurdere de skadelige virkningene av LSD genet mutasjoner og teste kandidat mutasjoner å forutsi mottakelig pasienter for PCT, var en svært standardisert over uttrykk systemet i HEK293H celler som gir rask og pålitelig enzym Aktivitetemåling utviklet. Lignende over uttrykk systemer har vært beskrevet tidligere for Fabrys og Pompe sykdom med enten COS-78,9,10,11, HeLa celler12eller HEK29313 ,14,15,16 celler for glycosidase genet.
En tilsvarende metode selv er patentert som "Metode for å forutsi respons på farmakologiske Anstandsdame behandling av sykdommer"17 som indikerer relevansen av en celle kultur system som kan være integrert i klinisk praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utarbeidelse av Mutant pcDNA3.1/GLA og pcDNA3.1/GAA konstruksjoner
Merk: Kloning strategier for GLA og GAA koding sekvenser (cds) har vært rapportert tidligere15,18.
- Nettstedet-rettet mutagenese bruke nettstedet-rettet mutagenese
- Bruk referansen sekvenser NM_000169.2 og NM_000152.4 som maler for mutagenese av GLA og GAA gener, henholdsvis. Har et sett av høy renhetsgrad salt ledig grunning (25-37-mers) syntetisert av en kommersiell leverandør, med fornuft og antisense primere bærer en av de respektive rekkefølge modifikasjonene sentrale til sine lengde individuelt introdusere mutasjon. Bruk verktøyet gratis primer design støtte primer design19.
- Reaksjonsblandingen, bruke standard betingelsene for det reaksjon og PCR betingelsene av produsenten.
- Mix 5 µL av 10 x reaksjon buffer, 10 ng av double-strandet mal plasmider DNA (pcDNA3.1/GLA eller pcDNA3.1/GAA), 125 ng av hver primer, 1 µL av angitte dNTP blandingen, 3 µL av DMSO reagensen i en passende mengde deionisert vann (siste reaksjon volum : 50 ΜL). Endelig legge 2,5 U DNA utvalg og blande av pipettering opp og ned. Som en negativ kontroll, kan du bære med et nei-primer utvalg.
- Starte PCR bruker følgende program: trinn 1: 95 ° C for 1 min, trinn 2: 95 ° C for 50 s, trinn 3: 60 ° C for 50 s, trinn 4: 68 ° C i 8 min, Gjenta trinn 2 til 4 18 ganger, og trinn 5: 68 ° C i 10 min.
- Etter PCR, Legg 1 µL av Dpnjeg begrensning enzym (10 U/µL) og ytterligere Inkuber reaksjon ampullen ved 37 ° C i 1 time.
- Transformasjon og Screening for ønsket klone
- Transformere en aliquot av ultracompetent celler i henhold til produsentens anbefalinger. Bruk SOC medium (tryptone 2% (w/v), gjær ekstra 0,5% (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, sterilisere 121 ° c, og deretter legge sterilt-filtrert løsninger av MgCl2 og glukose til siste konsentrasjoner av 10 og 20 mM, henholdsvis) i stedet for produsentens medium. Etter inngrepet, plate 250 µL av eksempel-mutagenese på en LB plate som inneholder 100 µg/mL ampicillin og ruge på 37 ° C 18 h.
- Sikre at transformants er > 10 og reaksjonen gir minst tre ganger så mange koloniene som no-primer kontroll reaksjonen, f.eksmed en lysende plate for å lette kolonien teller. Deretter plukke 3 kolonier og forberede 3 mL overnatting kulturer i LB kjøttkraft medium.
- Neste dag, utføre plasmider forberedelser med en standard utstyr og analysere hele sekvensen med T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) og BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primer via standard Sanger.
- Bruke et egnet molekylærbiologi verktøy for å analysere sekvensen. Da ønskede mutasjon oppdages og ingen ytterligere sekvens unormalt forhold til NM_000169.2 (α-galactosidase A) eller NM_000152.4 (syre α-glucosidase) er sett, Velg klone for hva førsteklasses plasmider rensing.
- Bestemme renheten av DNA ved å måle absorbansen i et spektrofotometer.
Merk: Tillater bare forberedelser som gir en plasmider renhet med 260/280 absorbansen forholdet > 1,8 for celle kultur eksperimenter.
2. dyrking av HEK293H celler
- Opprettholde HEK293H celler i høy glukose (4.5 g/L) Dulbecco´s endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin. Holde cellene en water-jacket inkubator på 37 ° C under en 5% CO2 atmosfære.
- Dyrke cellene til en tetthet 80-90%.
- Sug opp mediet og vaske når bruker fosfat bufret saltvann (PBS) uten Ca2 + og Mg2 +.
- Passasjen ved å legge til 0,05% Trypsin-EDTA og Inkuber i 5 min på 37 ° C og 5% CO2.
- Dele cellene 1:15 i frisk medium og frø i en ny MT75 kolbe å opprettholde faste kulturen. Ikke bruk celler med mer enn 25 passasjer.
3. pcDNA3.1/GLA og pcDNA3.1/GAA plasmider Transfection og behandling av HEK293H
- 24 timer før transfection, vask HEK293H cellene i en MT75 celle kultur kolbe gang med PBS med Ca2 +, Mg2 +. Høste cellene med 0,05% Trypsin-EDTA som nevnt ovenfor og frø 1,5 x 105 celler i i hulrom i en 24 godt kultur plate ved hjelp av 500 µL DMEM medium med 10% FBS uten antibiotika.
- Utføre en hva protokoll i henhold til produsentens håndbok. Vanligvis bruk en blanding av 1 µg plasmider DNA og 2,5 µL av transfection reagensen i 100 µL av serum-free DMEM. Inkuber for 20 min ved romtemperatur og legge til cellene i en drop-wise måte etterpå.
- Fjerne mediet som inneholder transfection reagensen etter en periode av 4 h 37 °C/5% CO2 og legge til 500 µL av ferske DMEM med 10% FBS / 1% penicillin/streptomycin.
Merk: I dette trinnet, 1-Deoxygalactonojirimycin hydroklorid (DGJ) eller 1-Deoxynojirimycin hydroklorid (DNJ) kan legges til kultur medium der ment (bruk en lager vannløsning 10 mm for å få en endelig konsentrasjon på 20 µM DGJ og DNJ ). Friske DGJ eller DNJ til 42 h etter plasmider transfection.
4. celle Harvest og α-galactosidase A eller syre α-glucosidase Aktivitetemåling
- Cellen harvest
- På dagen av innhøstingen, fjerne celler fra inkubator og Sug opp mediet. Nøye vask cellene 2 ganger med PBS med Ca2 + og Mg2 +.
Merk: Dette trinnet er viktig fordi DGJ og DNJ er potente hemmere av α-galactosidase og α-glucosidase, henholdsvis, og noen leftover ugyldiggjøre testen. - Legge til 200 µL deionisert vann direkte på cellene. Skyll cellene fra platen og overføre dem til en 1,5 mL reaksjon rør.
- På dagen av innhøstingen, fjerne celler fra inkubator og Sug opp mediet. Nøye vask cellene 2 ganger med PBS med Ca2 + og Mg2 +.
- Homogenisering av fryses
- Sett prøvene i en passende skummet stativ og vortex 5 s gjøre lyse mer effektivt. Sett prøvene vekslende i flytende nitrogen for 10 s og i romtemperatur vannbad før den tiner var fullstendig (5 min).
- Gjenta dette 5 ganger og deretter spinne prøvene i 5 min på 10 000 x g.
- Forberede en fersk rør for hvert utvalg som inneholder 40 µL av deionisert H2O og legge 10 µL av prøven. Bland løsning av vortexing kort og overføre 10 µL i et hulrom i en 96 godt plate (hvert utvalg i tre eksemplarer). Fortynne en 2 mg/mL bovin serum albumin (BSA) lagerløsning i deionisert H2O som følger for å få en standardkurve: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- Starte reaksjonen ved å legge til 200 µL av BCA reagensen (reagens A og reagens B blandet i 50:1 forholdet) og Inkuber 1t i mørket på 37 ° C liten agitasjon på en orbital shaker (300 rpm). Måle absorbansen på 560 nm i en plate-leser.
Merk: Prøvene vanligvis inneholde mellom 1 og 1,5 µg protein per µL.
- Fortynne det beregnede beløpet av hver prøve og Pipetter i frisk 1,5 mL reaksjon rør å få 0,05 (for α-galactosidase) eller 0,5 (for acid α-glucosidase) µg protein/µL løsninger. Vortex prøvene for 5 s igjen og Pipetter 10 µL av dette fortynning i en 96 godt plate (hvert utvalg i duplikat).
- Starte reaksjonen ved å legge til 20 µL av respektive substratløsningen:
For α-galactosidase A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) i 0,06 M fosfat citrate buffer, pH 4.7.
For acid α-glucosidase: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) i 0.025 M natrium acetate, pH 4.0. - Inkuber enzym reaksjonene 1t i mørket på 37 ° C liten agitasjon på en orbital shaker (300 rpm). Avslutte reaksjonen ved tilsetning av 200 µL 1,0 m, pH 10.5 justert glycine-NaOH-buffer.
- Forbered en standard kurve av 4-methylumbelliferone (4-MU) fra en 0,01 mg/mL lager som følger:
100 µL H2O / ikke 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; ingen H2O / 100 µL 4-MU, Pipetter 10 µL av hver fortynning i 96 brønnen plate (i duplikater) og legge 200 µL 1,0 M glycine-NaOH bufferen i hver brønn for å justere volum og pH. - Mål enzymaktiviteten i en fluorescens leser utstyrt med de aktuelle filteret og analysere dataene ved hjelp av riktig programvare for fluorescens leser enheten.
Merk: Begge 4-KRUS underlag er redusert til 4-MU ved eksponering for α-galactosidase A eller syre α-glucosidase. Utgitt 4-MU er en fluorochrome, som kan måles på 360 og 465 nm som eksitasjon og utslipp bølgelengdene, henholdsvis bruker en microplate fluorescens reader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutagenese prosedyren
For å vurdere effektiviteten av GLA genet mutagenese, ble mutasjoner klassifisert i en av følgende kategorier. Denne tilnærmingen til å generere mutasjoner avslørt som ca 66,5% av GLA mutasjoner ble oppnådd ved første forsøk. En ytterligere 25% kan oppnås etter en litt modifisert andre PCR.
Kategori 1: Mutagenese PCR var effektiv på første forsøk.
Kategori 2: Første mutagenese PCR mislyktes (ingen kolonier på plate, ikke innsatte mutasjon). repetisjon bruker samme primer satt ved å øke annealing temperaturen opptil 68 ° C var effektiv.
Kategori 3: Mer innsats hadde foretas til ønsket klone (f.eksvanligvis én eller flere nye sett med primere ble utformet).
Α-galactosidase A og syre α-glucosidase enzym Aktivitetemåling
Enzym aktivitet av ulike mutant enzymer ble innspilt etter forrige inkubasjon transiently transfekterte cellene i tilstedeværelse eller fravær av en PC. Tabell 1 refererer til resultatene for 3 α-galactosidase A og 3 syre α-glucosidase mutasjoner. Data vises som (1) absolutte verdier for substrat omsetning (nmol 4-MU * mg protein-1* h-1) og (2) relative verdier normalisert til vill type enzymet. Begge uttrykkene er nyttig, siden totale substrat omsetning illustrerer effektiviteten av reaksjonen og følsomheten til systemet, mens de normaliserte verdiene kan gi viktig tips for sannsynligheten for malignancy av mutasjon på den ene siden og effektiviteten av brukte PC behandlingen derimot. For den eksperimentelle fasen, ble arbeidsflyten avbildet i figur 1 satt opp, som planlagt en 60t inkubasjonstid med sammensatte (av tekniske grunner, f.eks rask HEK293H cellevekst under introdusert forhold). Selv om det har vært sagt at 10 µM var den omtrentlige maksimale oppnåelige plasma konsentrasjonen for DGJ14, gjeldende protokollen bruker 20 µM som en rimelig konsentrasjon for en screening for PC respons som støttes av mange tidligere arbeider4,20,21,22,23. Videre har det blitt postulert at høyere Plasmanivåer kan nås24.
Figur 1 : Arbeide flyten av den i vitro enzym Aktivitetemåling. (A) tidslinjen i eksperimentet viser en 90 h celle kultur innsats med relativt liten hands-på-tid kreves på de angitte tidspunkt. (B) representant plasmider vektorer pcDNA3.1 med wild type cds GLA og GAA vises. GLA og GAA vill type plasmider og plasmider inkludert respektive innsatte mutasjon av interesse ble brukt til transiently transfect HEK293H celler belagt i 24 godt format. Etter en periode slik at cellene å syntetisere den respektive gene produkter og tillate enzym behandling, lysosomale transport- og PC handling, cellene var lysed og målt i en fluorescens plate leser og analysert ved hjelp av respektive programvare. C: celle morfologi og vekst status for de HEK293H cellene vises i gang løpet av eksperimentet. Skalere barer = 100 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| i vitro enzym aktivitet | |||||
| GLA | Opprinnelig | 20 ΜM DGJ | |||
| mutasjon (AA) | nmol 4-KRUS-gal/mg/t (gjennomsnitt) | % mener (±SD, N) | nmol 4-KRUS-gal/mg/t (gjennomsnitt) | % mener (±SD, N) | betydning |
| p.A143T | 2384.7 | 29,2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8.8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44,2 (±3.6, 5) | **** |
| GAA | Opprinnelig | 20 ΜM DNJ | |||
| mutasjon (AA) | nmol 4-KRUS-glu/mg/t (gjennomsnitt) | % mener (±SD, N) | nmol 4-KRUS-glu/mg/t (gjennomsnitt) | % mener (±SD, N) | betydning |
| p.Y455F | 41.1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31.4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65,7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166.5 | 16,7 (±1.5, 5) | ** |
| p.L552P | 0,0 | 0,0 (±. 2, 5) | 104.3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Tabell 1: enzym aktivitet av α-galactosidase A og syre α-glucosidase. Tabellen viser representant resultater for 3 α-galactosidase A og 3 syre α-glucosidase mutanter med og uten PC DGJ eller DNJ. Absolutt enzym aktivitetsdata ble korrigert for endogene enzym aktivitet av HEK293H celler. For å evaluere endogene enzym aktivitet, cellene var transfekterte med en pcDNA3.1 tom vektor. Verdiene var 97.5 nmol 4-MU * mg protein-1* h-1 for α-galactosidase A og 41.6 nmol 4-MU * mg protein-1* h-1 for acid α-glucosidase, henholdsvis; enzym aktivitet verdier var normalisert til vill type enzymet fra tilsvarende eksperimenter, som forklarer avvik av relative verdier mellom ulike mutanter.Etter 5 uavhengige cellekulturer eksperimenter (N = 5), hver gjennomført i teknisk duplikater, standardavviket var ikke lov å være > 15% av gjennomsnittet. Forholdet T-tester ble brukt til å beregne forskjellen mellom ubehandlede og PC-behandlet enzym.
* p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0.005, *** p < 0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her gir robust resultater enzym skade vurdering i arvelige lysosomale sykdommer stoffskifte. Dette manuskriptet er en endring i protokollen publisert tidligere15. Største endringene involverer stringens (dvs., under mutant vektor konstruere forberedelse), standardisering av celle kultur protokollen (dvs., HEK293H celle vedlikehold og hva forhold), og høye antall eksperimentelle repetisjoner (minst 5), som sterkt bidratt til reproduserbarhet resultatene. Helt, både målet gener er lett tilgjengelig for mutagenese og et mangfold av mutasjoner kan settes sammen i parallell. En relativt høy signal/støyforhold ble oppnådd vurderer at endogene enzym aktivitet i HEK293H cellene var en ubetydelig 1/50 (α-galactosidase A) og 1/20 (syre α-glucosidase) over uttrykt vill-type genet. Dermed er det en utmerket løsning mellom wild type og mutant enzym. Det bør bemerkes at et annet beløp totale protein ble brukt for aktivitet analysen av både enzymer (0,5 og 5 µg, henholdsvis), fordi syre α-glucosidase aktivitet var en størrelsesorden lavere enn α-galactosidase A.
Som nevnt ovenfor, er ofte analysen parametere kontroversielle, siden mange laboratorier har utviklet egne analyser for å undersøke lysosomale glycosidases. Systemene kan variere i celle type plasmider-vektor design, dyrking forhold og perioden narkotika eksponering bare for å nevne noen av de mange parameterne. En nylig publisert meta-analyse for Fabrys sykdom viste at enzym aktivitet opptak (med og uten PC) transfekterte celle modeller (f.eksHEK293, COS-7) var i stor grad i samsvar med resultatene fra pasient-avledet celler ( hovedsakelig lymfocytter eller fibroblaster) med hensyn til spørsmålet om en mutasjon, svarer til PCen24. Tidligere rapporter direkte sammenligne pasient-avledet celler og hva modeller viste at over uttrykk systemer reflekterer situasjonen i pasienten celler uten at den konklusjon13,14. Det kan derfor konkluderes at uavhengig av den bestemte protokollen, resultatene av forskjellige forfattere ikke ble endret av de forskjellige cellulære systemene, selv om responder definisjoner kan være forskjellige. Den gjeldende definisjonen for en svarer mutasjon er 20% relativ enzym aktivitet økning og 5% absolutt enzym aktivitet økning sammenlignet med vill type enzymet etter inkubasjon med 20 µM DGJ 60 h. En omfattende database, FabryCEP, tillater sammenligning av resultatene av eksperimentelle fremgangsmåter for hundrevis av α-galactosidase mutanter25.
Om disse kriteriene er tilstrekkelig til å forutsi klinisk fordelene med DGJ og DNJ er fortsatt uklart, siden aktivitetsnivået nødvendig for å hindre symptomatisk sykdom er kontroversiell. En tidligere studie antydet at 10 til 15% av gjenværende aktivitet kan være tilstrekkelig for at systemet skal fungere26. Men en nylig publisert rapport fra en fase 2 klinisk studie for DGJ, en 1% aktivitet økning ble ansett som potensielt gunstig for pasienten, da den opprinnelige aktiviteten var mindre enn 1% av normal27. Siste kliniske resultatene tyder på at pasienter spådd til å svare på PCer ved responder definisjonen av økningen ≥20% og ≥3% absolutt økning av vill type α-galactosidase en aktivitet i HEK293H celler etter inkubasjon med 10 µM DGJ faktisk avledet klinisk fordel med sykdom stabilisering eller selv forbedring av nyre og kardiale28. Mens DGJ har allerede blitt godkjent av FDA og Europakommisjonen som monoterapi for Fabrys sykdom, synes løpet av PCer som DNJ og deriverte N-Butyl-DNJ i Pompe sykdom å være forskjellig. En monotherapeutical tilnærming med DNJ er avsluttet i løpet av en fase II kliniske på grunn av alvorlige bivirkninger i noen pasienter29. Men viste PC behandling i kombinasjon med godkjente ERT betydelig bedre resultater med hensyn til sykdom substrat (glykogen) reduksjon sammenlignet ERT monoterapi30.
Vi foreslår at presentert tilnærming kan utvides til andre LSDs og andre PCer som Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff og GM1 gangliosidosis, men dette kan ikke fungere i bestemte tilfeller der for eksempel signal/støy-forhold av systemet er utilstrekkelig. Forsiktighet bør utvises velge en egnet cellen avbrudd metode å forberede en celle lysate enzym aktivitet besluttsomhet, fordi i tillegg vaskemidler i lyseringsbuffer kunne være indikativ av membran-bundet enzymer som glucocerebrosidase i Gaucher sykdom mens lignende mengder vaskemiddel kan skade andre enzymer. For α-galactosidase, bør en sonication-baserte celle avbrudd metode unngås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Mandy Loebert og Tina Czajka utmerket kundestøtte. Vi takker Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) for språket redigering hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
