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Medicine

In Vitro Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56550

Summary

Il existe une demande pour faire précliniques Essais pour une nouvelle classe de médicaments « orphelins » appelées chaperons pharmacologiques reproductible, rapide et efficace. Nous avons développé un test culture cellule simple, très standardisé et polyvalent à écran pour patients admissibles ainsi que des médicaments nouveaux chaperons pharmacologiques.

Abstract

L’utilisation de la médecine personnalisée pour traiter les maladies monogéniques rares comme lysosomales (DSL) est contestée par des conceptions du procès cliniques complexes, des coûts élevés et faible nombre de patients. Des centaines d’allèles mutants sont impliqués dans la plupart de la DSL. Les maladies sont généralement classés en 2 ou 3 types cliniques différentes selon la gravité. De plus, la caractérisation moléculaire du génotype peut aider à prédire les résultats cliniques et informer des soins aux patients. Donc, nous avons mis au point un essai de culture de cellule simple basé sur des cellules de HEK293H façon hétérologue surexprimant les mutations identifiées dans la maladie de Fabry et Pompe. Un test semblable a récemment été introduit comme un test préclinique pour identifier les mutations se prête pour la thérapie pharmacologique de chaperon (PCT) la maladie de Fabry. Ce manuscrit décrit un essai de culture de cellule modifiée qui permet une évaluation rapide de phénotypique des variants alléliques dans la maladie de Fabry et Pompe pour identifier les patients éligibles pour le PCT et peut aider au développement de nouveaux pharmacochaperones.

Introduction

Il existe plus d’une douzaine lysosomales (DSL) associés au dysfonctionnement de glycosidase par suite de mutations géniques primaires. Fabry (OMIM #301500) et la maladie de Pompe (OMIM #232300), plus de 500 et 200 mutations faux-sens ont1,2,3 , respectivement, ce qui correspond à environ 60 % du nombre total de mutation. Nombreuses nouvelles variantes du gène sont toujours identifiés, beaucoup dont ayez inconnu signification. Des études biochimiques ont révélé que certains génotypes ne conduisent pas à une perte de fonction complète du gène GLA (OMIM * 300644) dans la maladie de Fabry, mais provoquer l’enzyme correspondante à l’échec atteindre un État thermodynamiquement favorisé pliant4 . Cela se traduit par la rétention de l’ER et la dégradation prématurée de l’enzyme fonctionnelle dans le cas contraire. Des conclusions similaires ont été tirées dans autres DSL, y compris la maladie de Pompe5. De plus, la caractérisation moléculaire des variantes de l’enzyme peut faciliter l’interprétation clinique des mutations au moment du diagnostic6, ce qui suggère que la progression de LSD est un processus individualisé, basé sur la nature de la mutation. Par conséquent, la classification conventionnelle en généralement de 2 à 3 différents types cliniques devrait être réévaluée afin de rationaliser les conseils cliniques et les décisions thérapeutiques.

Enzymatique substitutive (ERT) est disponible pour ces deux maladies. ERT, cependant, a une efficacité limitée en tissus/organes touchés comme le cerveau et les muscles squelettiques. En outre, ERT peut provoquer une réaction d’immunogène qui met en péril ses bienfaits thérapeutiques. Chaperons pharmacologiques (PCs) sont une alternative séduisante de traitement pour les patients présentant des mutations réactives ce qu’on appelle. SCP service un échafaudage moléculaire pour le repliement des protéines correcte et de stabilisation, qui à son tour empêche la rétention de réticulum endoplasmique (re) et ER-associés de la dégradation de l’enzyme. En outre, PCs peuvent être administrés par voie orale et sont potentiellement capables de traverser la barrière hémato-encéphalique. Par conséquent, le PCT peut être une option plus viable pour le traitement des patients atteints de certains génotypes. Pour une étude approfondie sur l’application de PC en DSL, veuillez consulter l’excellente revue par Parenti7.

La découverte de centaines d’allèles mutants pathogène défie le dépistage des drogues précliniques et nécessite une évaluation simple, rapide et hautement normalisée des patients se prêtent à une approche de la médecine personnalisée. Afin d’évaluer les effets néfastes des mutations du gène LSD et de tester des mutations de candidat pour prédire les patients se prêtent pour le PCT, un système très standardisé surexpression dans les cellules HEK293H qui permet de mesurer l’activité enzymatique rapide et fiable a été mis au point. Des systèmes similaires de surexpression ont été décrits précédemment pour la maladie de Fabry et Pompe utilisant COS-78,9,10,11, HeLa cellules12ou HEK29313 ,14,15,16 cellules pour le gène glycosidase.

Une méthode très similaire a même été brevetée comme « Méthode pour prédire la réponse au traitement pharmacologique chaperon des maladies »17 indiquant la pertinence d’une cellule culture système capable de s’intégrer dans la pratique clinique.

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Protocol

1. préparation du Mutant pcDNA3.1/GLA et pcDNA3.1/GAA constructions

Remarque : Les stratégies de clonage pour la GLA et GAA (cds) de séquences codantes ont été signalés plus tôt15,18.

  1. Mutagenèse dirigée à l’aide de mutagenèse
    1. La référence des séquences NM_000169.2 et NM_000152.4 en tant que modèles pour la mutagénèse des gènes GLA et GAA , respectivement. Disposer d’un ensemble de haute pureté sel gratuit amorces (25-37-mers) synthétisé par un fournisseur commercial, avec des amorces sens et anti-sens transportant un des modifications respectives séquence centrales à leur longueur de présenter individuellement la mutation. Utilisez l’outil de conception d’amorce libre pour soutenir l’apprêt conception19.
    2. Pour le mélange réactionnel, utiliser les conditions standards pour la solution de réaction et des conditions d’amplification fournies par le fabricant.
      1. Mix 5 µL de 10 x tampon de réaction, 10 ng de plasmide modèle bicaténaire ADN pcDNA3.1/GLA ou pcDNA3.1/GAA, 125 ng de chaque amorce, 1 µL du mélange dNTP fourni, 3 µL de réactif de DMSO dans un volume approprié d’eau désionisée (volume de réaction finale : 50 ΜL). Enfin, ajouter 2,5 U de l’ADN polymérase et la composition de pipetage de haut en bas. Comme témoin négatif, portent sur un échantillon non-primer.
    3. Commencer la PCR en utilisant le programme suivant : étape 1 : 95 ° C pendant 1 min, étape 2 : 95 ° C pendant 50 s, étape 3 : 60 ° C pendant 50 s, étape 4 : 68 ° C pendant 8 min, répétez l’étape 2-4 18 fois et étape 5 : 68 ° C pendant 10 min.
      1. Après les PCR, ajouter 1 µL de la Dpnj’ai enzyme de restriction (10 U/µL) et incuber encore le flacon de réaction à 37 ° C pendant 1 h.
  2. Transformation et dépistage pour le Clone désiré
    1. Transformer une partie aliquote de cellules ultracompetent conformément aux recommandations du fabricant. Moyen SOC utilisation (tryptone 2 % (p/v), levure extrait de 0,5 % (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, stériliser à 121 ° C et puis ajoutez les solutions stérile filtrée de MgCl2 et le glucose jusqu'à la concentration finale de 10 et 20 mM, respectivement) au lieu du fabricant milieu. Après l’intervention, plaque 250 µL de la mutagénèse d’échantillon sur un LB plaque contenant 100 ampicilline de µg/mL et incuber à 37 ° C pendant 18 heures.
    2. S’assurer que le nombre de transformants est > 10 et la réaction des rendements au moins trois fois plus de colonies comme la réaction de contrôle non-apprêt, par exemple, en utilisant une plaque lumineuse pour faciliter le dénombrement de la colonie. Prélever 3 colonies, puis préparer 3 mL cultures une nuit ou Pluss dans un milieu LB bouillon.
    3. Le lendemain, procéder à la préparation de plasmide avec un kit standard et analyser la séquence entière à l’aide de T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA LTC TAG GG-3ʹ) et le séquençage des amorces BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) par l’intermédiaire de Sanger standard.
    4. Un outil adapté de biologie moléculaire permet d’analyser la séquence. Quand la mutation souhaitée est détectée et non plus de séquences anomalie par rapport aux NM_000169.2 (α-galactosidase A) ou NM_000152.4 (α-glucosidase acide) apparaît, sélectionnez le clone pour la purification de plasmide de transfection-grade.
    5. Déterminer la pureté de l’ADN en mesurant l’absorbance dans un spectrophotomètre.
      Remarque : Laissez seulement des préparations qui donnent une pureté de plasmide avec un ratio d’absorbance 260/280 de > 1.8 pour cell culture expériences.

2. culture de cellules de HEK293H

  1. Maintenir les cellules HEK293H à forte concentration de glucose (4,5 g/L) Dulbecco´s mise à jour le Eagle Medium (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine. Garder les cellules un incubateur à 37 ° C sous une atmosphère de2 CO 5 % de water-jacket.
  2. Cultiver les cellules à une densité de 80 à 90 %.
  3. Aspirer le milieu et laver une fois à l’aide de phosphate solution saline tamponnée (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +.
  4. Passage en ajoutant 0,05 % trypsine-EDTA et incuber pendant 5 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
  5. Fractionner les cellules 01:15 dans un milieu frais et graines dans un nouveau ballon T75 pour maintenir la culture permanente. Ne pas utiliser de cellules avec plus de 25 passages.

3. pcDNA3.1/GLA et pcDNA3.1/GAA plasmide Transfection et traitement de HEK293H

  1. 24 h avant la transfection, laver les cellules de HEK293H dans un flacon de culture cellulaire T75 une fois avec du PBS avec Ca2 +, Mg2 +. Récolter les cellules avec 0,05 % trypsine-EDTA comme indiqué ci-dessus et semences 1,5 x 105 cellules dans les cavités d’une plaque de culture bien 24 à l’aide de 500 µL de milieu DMEM supplémenté de 10 % FBS sans antibiotiques.
  2. Réaliser un protocole de transfection selon le manuel du constructeur. En général, utilisez un mélange de 1 µg d’ADN plasmidique et 2,5 µL de réactif de transfection dans 100 µL de milieu sans sérum DMEM. Incuber pendant 20 min à température ambiante et ensuite ajouter aux cellules d’une manière goutte-à-goutte.
  3. Retirer le support contenant le réactif de transfection après une période de 4 h à 37 °C/5% CO2 et ajouter 500 µL de frais DMEM avec 10 % FBS / 1 % pénicilline/streptomycine.
    Remarque : Au cours de cette étape, le chlorhydrate de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) ou 1-désoxynojirimycine chlorhydrate (DNJ) peut-être être ajouté à du milieu de culture lorsque destiné (utiliser une solution aqueuse de stock de 10 mM afin d’obtenir une concentration finale de 20 µM DGJ et DNJ ). Frais de DGJ ou DNJ a été ajouté 42 h après la transfection de plasmide.

4. cellule récolte et α-galactosidase A ou la mesure de l’activité α-glucosidase acide

  1. Récolte de cellules
    1. Le jour de la récolte, enlever les cellules de l’incubateur et aspirer le milieu. Se laver soigneusement les cellules 2 fois avec du PBS avec Ca2 + et Mg2 +.
      Remarque : Cette étape est cruciale car DGJ et DNJ sont de puissants inhibiteurs de le α-galactosidase et α-glucosidase, respectivement, et aucun vestige n’invaliderait le test.
    2. Ajouter 200 µL d’eau désionisée directement sur les cellules. Rincer les cellules de la plaque et de les transférer dans un tube de réaction de 1,5 mL.
  2. Homogénéisation de gel et de dégel
    1. Placer les échantillons dans un carré de mousse appropriées et vortexer pendant 5 s pour accroître l’efficacité de la lyse. Placer les échantillons en alternance dans l’azote liquide pour 10 s et dans un bain d’eau de température ambiante jusqu'à ce que la décongélation a été complète (5 min).
    2. Répétez l’opération 5 fois et puis essorer les échantillons pendant 5 min à 10 000 x g.
Conserver le liquide surnageant et pipette dans un nouveau tube de réaction.
  • Détermination de concentration de protéine à l’aide de dosage de l’acide (BCA) bicinchoninic
    1. Préparer un nouveau tube pour chaque échantillon contenant 40 µL de désionisée H2O et ajouter 10 µL de l’échantillon. Mélanger la solution au vortex brièvement et transférer 10 µL dans une cavité d’une plaque 96 puits (chaque échantillon en triple exemplaire). Diluer une solution albumine sérique bovine (BSA) 2 mg/mL dans désionisée H2O comme suit pour obtenir une courbe standard : 50 µL H2O/50 µL BSA ; 60 µL H2O/40 µL BSA ; 70 µL H2O/30 µL BSA ; 80 µL H2O/20 µL BSA ; 90 µL H2O/10 µL BSA ; 100 µL H2O.
    2. Démarrer la réaction en ajoutant 200 µL de réactif BCA (réactif A et réactif B mélangé à un ratio de 50 : 1) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation légère dans un agitateur orbital (300 tr/min) dans l’obscurité. Mesurer l’absorbance à 560 nm dans un lecteur de plaque.
      Remarque : Les échantillons contiennent généralement entre 1 et 1,5 µg de protéines par µL.
  • Mesure de l’activité enzymatique avec des substrats artificiels 4-méthylumbelliféryl (4-MUG)
    1. Diluer la quantité calculée de chaque échantillon et la pipette en tubes de réaction des frais de 1,5 mL pour obtenir des solutions de protéine/µL de µg de 0,05 (pour α-galactosidase A) ou 0,5 (pour α-glucosidase acide). Échantillons pour 5 s à nouveau et ajouter 10 µL de cette dilution dans un 96 bien plaque de Vortex (chaque échantillon en double exemplaire).
    2. Démarrer la réaction en ajoutant 20 µL de la solution de substrat respectifs :
      Pour α-galactosidase A: 2 mM 4-méthylumbelliféryl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) dans un tampon citrate 0,06 M phosphate, pH 4,7.
      Pour α-glucosidase acide : 2 mM 4-méthylumbelliféryl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) en acétate de sodium 0,025 M, pH 4,0.
    3. Incuber les réactions enzymatiques dans l’obscurité à 37 ° C sous agitation légère dans un agitateur orbital (300 tr/min) pendant 1 heure. Mettre fin à la réaction par l’addition de 200 µL de 1,0 M, tampon de pH 10,5 glycine-NaOH ajusté.
    4. Préparer une courbe standard de 4-méthylumbelliférone (4-MU) d’un stock de 0,01 mg/mL comme suit :
      100 µL H2O / 4 non-MU ; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU ; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU ; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU ; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU ; aucun H2O / 4 100 µL-MU, ajouter 10 µL de chaque dilution dans le puits 96 plaque (en double) et ajouter 200 µL de la mémoire tampon glycine-NaOH de 1,0 M dans chaque puits afin d’ajuster le volume et le pH.
    5. Mesure l’activité enzymatique dans un lecteur de fluorescence équipé du filtre approprié, définir et analyser les données en utilisant le logiciel approprié pour le périphérique de lecture de fluorescence.
      Remarque : Les deux substrats 4-MUG sont réduits à 4-MU pendant l’exposition à le α-galactosidase A ou α-glucosidase acide. Publié 4-MU est un fluorochrome, qui peut être mesuré à 360 et 465 nm par les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, respectivement, à l’aide d’un lecteur de microplaques fluorescence.
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    Representative Results

    La procédure de mutagenèse
    Afin d’évaluer l’efficacité de la mutagénèse gène GLA , les mutations ont été classées dans une des catégories suivantes. Cette approche pour générer des mutations a révélé qu’environ 66,5 % des mutations GLA ont été obtenus dans la première tentative. Un autre 25 % pourrait être obtenu après une PCR deuxième légèrement modifiée.

    Catégorie 1 : La mutagénèse PCR était efficace du premier coup.

    Catégorie 2 : Mutagénèse première PCR a échoué (pas de colonies sur la plaque, aucune mutation insérée) ; répétition en utilisant la même amorce mis en augmentant la température de recuit jusqu'à 68 ° C a été efficace.

    Catégorie 3 : Plus d’efforts devaient être entrepris pour donner le clone désiré (par exemple, généralement un ou plusieurs nouveaux ensembles d’amorces ont été conçus).

    Α-galactosidase A et α-glucosidase acide mesure l’activité enzymatique
    L’activité enzymatique des différentes enzymes mutantes a été enregistrée après la précédente d’incubation des cellules transfectées transitoirement dans la présence ou l’absence d’un PC. Tableau 1 se réfère aux résultats pour α-galactosidase 3 A et 3 mutations de α-glucosidase acide. Données sont affichées comme (1) valeurs absolues pour le chiffre d’affaires de substrat (nmol 4-MU * mg protéine-1* h-1) et (2) relative valeurs normalisées à l’enzyme de type sauvage. Les deux expressions sont utiles, car le chiffre d’affaires total de substrat illustre l’efficacité de la réaction et la sensibilité du système, tandis que les valeurs normalisées peuvent donner importants conseils pour la probabilité de la malignité de la mutation d’une part et la efficacité du traitement appliqué PC d’autre part. Pour la phase expérimentale, le flux de travail représenté dans la Figure 1 a été mis en place, qui demande une période d’incubation de 60 h avec le composé (pour des raisons techniques, par exemple rapide croissance de cellules de HEK293H dans les conditions introduites). Même s’il a été indiqué que 10 µM était la concentration plasmatique de réalisable maximale approximative pour DGJ14, le protocole actuel utilise 20 µM comme une concentration raisonnable aux fins d’un examen préalable une réceptivité PC, soutenue par les nombreux premières œuvres4,20,21,22,23. En outre, il a été postulé que des niveaux plus élevés de plasma est joignable24.

    Figure 1
    Figure 1 : Travailler le débit de la à la vitro mesure de l’activité enzymatique. (A) la chronologie de l’expérience montre un effort 90 h de culture cellulaire avec relativement peu hands-on-time requis aux points d’heure indiquée. (B) représentant plasmide pcDNA3.1 de vecteurs contenant les CD de type sauvage du GLA et GAA apparaissent. GLA et GAA plasmides de type sauvage et plasmides dont la mutation insérée respectif d’intérêt ont servi à transfecter transitoirement HEK293H cellules plaqués au format bien 24. Après une période pour permettre les cellules de synthétiser les produits des gènes respectifs et permettant un traitement enzymatique, transport lysosomal et PC action, les cellules sont lysées et mesurée à un lecteur de fluorescence et analysées à l’aide du logiciel respectif. C: cellule statut de morphologie et de la croissance des cellules HEK293H sont affichés tout au long de l’évolution temporelle de l’expérience. Barreaux de l’échelle = 100 µm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

    activité enzymatique in vitro
    GLA Native DGJ 20 ΜM
    mutation (AA) nmol 4-MUG-gal/mg/h (moyenne) % de moyenne (±et, N) nmol 4-MUG-gal/mg/h (moyenne) % de moyenne (±et, N) signification
    p.A143T 2384.7 29.2 (±2.6, 5) 4223.0 52,0 (±4.4, 5) ***
    p.A156V 379,2 4.3 (±. 8, 5) 1437.5 16.3 (±1, 3, 5) ****
    p.R301Q 777.4 8.8 (±1.1, 5) 3002.6 44.2 (± 3,6, 5) ****
    GAA Native DNJ 20 ΜM
    mutation (AA) nmol 4-MUG-glu/mg/h (moyenne) % de moyenne (±et, N) nmol 4-MUG-glu/mg/h (moyenne) % de moyenne (±et, N) signification
    p.Y455F 41,1 5.4 (±. 4, 5) 246,6 31,4 (±2, 8, 5) ***
    p.P545L 65,7 6.6 (±. 4, 5) 166,5 16,7 (±1, 5, 5) **
    p.L552P 0.0 0,0 (±. 2, 5) 104.3 10.4 (1,4, 5) ***

    Tableau 1 : activité de l’Enzyme α-galactosidase A et en acide α-glucosidase. Le tableau montre les résultats représentatifs de α-galactosidase 3 A et 3 mutants α-glucosidase acide avec et sans la DGJ PCs ou DNJ. Données d’activité enzymatique absolu a été corrigées pour l’activité de l’enzyme endogène des cellules HEK293H. Pour évaluer l’activité de l’enzyme endogène, les cellules ont été transfectées avec un vecteur vide pcDNA3.1. Les valeurs étaient 97,5 nmol 4-MU * mg protéine-1* h-1 A de le α-galactosidase et 41,6 nmol 4-MU * mg protéine-1* h-1 pour α-glucosidase acide, respectivement ; les valeurs de l’activité enzymatique ont été normalisées à l’enzyme de type sauvage des expériences correspondants, ce qui explique les écarts des valeurs relatives entre les différents mutants.Après des expériences de culture de cellules indépendantes 5 (N = 5), chacune réalisée en techniques doublons, l’écart n’était pas autorisé à être > 15 % de la moyenne. T-Tests du rapport ont servi à calculer la différence entre l’enzyme PC traités et non traité.
    * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005, *** p < 0,001

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    Discussion

    Le protocole décrit ci-après fournit des résultats robustes pour l’évaluation des dommages enzyme dans les maladies lysosomales héréditaires du métabolisme. Ce manuscrit est qu'un amendement au protocole publiée plus tôt15. Les plus importantes modifications impliquent la rigueur (c'est-à-dire, dans le processus de préparation de construction de vecteur mutant), normalisation de la protocole de culture cellulaire (p. ex., conditions de maintenance et de transfection cellulaire HEK293H) et la haute nombre de répétitions expérimentales (au moins 5), qui a fortement contribué à la reproductibilité des résultats. Au total, les deux gènes cibles ont été facilement accessibles pour la mutagénèse et une multiplicité des mutations peut être Assemblée en parallèle. Un rapport signal/bruit relativement élevé a été atteint étant donné que l’activité de l’enzyme endogène dans les cellules de HEK293H était une négligeable 1/50 (α-galactosidase A) et 1/20 (α-glucosidase acide) du gène surexprimé type sauvage. Il y a donc une excellente résolution entre le type sauvage et enzyme mutante. Il est à noter qu’un montant différent de protéines totales a été appliqué pour le dosage de l’activité de deux enzymes (0,5 à 5 µg, respectivement), parce que l’activité de le α-glucosidase acide était un ordre de grandeur plus faible que celle de le α-galactosidase A.

    Comme indiqué ci-dessus, les paramètres de dosage sont souvent controversés, puisque de nombreux laboratoires ont mis au point leurs propres essais afin d’étudier les glycosidases lysosomales. Les systèmes peuvent différer dans le type de cellule, la conception du vecteur plasmidique, conditions de culture et période d’exposition au médicament pour n’en nommer que quelques-uns des nombreux paramètres. Une méta-analyse publiée récemment pour la maladie de Fabry a démontré que les enregistrements de l’activité enzymatique (avec ou sans PC) des modèles de cellules transfectées (p. ex., HEK293, COS-7) était en grande partie selon les résultats obtenus à partir de cellules dérivées de patient ( pour la plupart des lymphocytes ou des fibroblastes) en ce qui concerne la question, si une mutation est sensible à la PC24. Précédents rapports comparant directement les cellules dérivées de patient et modèles de transfection a démontré que les systèmes de surexpression reflètent la situation dans les cellules de patients sans compromettre la conclusion13,14. On peut donc conclure que, quel que soit le protocole particulier, les résultats obtenus par différents auteurs n’était pas changé par les différents systèmes cellulaires, même si les définitions de répondeur peuvent être divergentes. La définition actuelle d’une mutation ayant répondu au questionnaire est l’augmentation de l’activité enzymatique relative 20 % et 5 % augmentation de l’activité enzymatique absolu par rapport à l’enzyme de type sauvage après incubation avec 20 µM DGJ pour 60 h. Une base de données complète, FabryCEP, permet la comparaison des résultats obtenus par différentes approches expérimentales depuis des centaines de α-galactosidase mutants25.

    Si ces critères sont suffisantes pour prédire des avantages cliniques de DGJ et DNJ reste incertaine, étant donné que le niveau d’activité nécessaire pour prévenir une maladie symptomatique est controversé. Une première étude a suggéré que 10 à 15 % de l’activité résiduelle peut être suffisante pour que le système fonctionne correctement26. Toutefois, dans un rapport publié récemment par une étude clinique de phase 2 pour DGJ, une augmentation de 1 % de l’activité a été jugée potentiellement bénéfique pour le patient, lorsque l’activité de base est moins de 1 % de la normale27. Résultats cliniques récents suggèrent que les patients devraient pour répondre aux PCs, par la définition de répondeur de ≥20 % hausse relative et ≥ 3 % augmentation absolue de type sauvage α-galactosidase, une activité dans les cellules HEK293H après incubation avec 10 µM DGJ effectivement obtenue avantages cliniques avec stabilisation de la maladie ou même amélioration par les paramètres rénaux et cardiaques28. Considérant que la DGJ a déjà été approuvé par la FDA et la Commission européenne en monothérapie pour la maladie de Fabry, le cours de PC comme DNJ et le dérivé N-Butyl-DNJ dans la maladie de Pompe semble être différente. Une approche monotherapeutical avec DNJ a pris fin au cours d’un essai clinique de Phase II en raison de manifestations indésirables graves dans certains des patients29. Traitement de la PC en combinaison avec ERT approuvé indiquent cependant considérablement améliorer les résultats en ce qui concerne la réduction du substrat (glycogène) maladies comparée à la monothérapie ERT30.

    Nous suggérons que l’approche présentée peut être étendue aux autres PC comme Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff et gangliosidose à GM1 et autres DSL, mais cela pourrait ne pas fonctionner dans certains cas, où par exemple le rapport signal/bruit du système est insuffisant. Il faut sélectionner une méthode de désorganisation cellulaire appropriée pour préparer un lysat cellulaire pour la détermination de l’activité enzymatique, parce que l’addition de détergents dans le tampon de lyse pourrait être le signe d’enzymes membranaires telles que de la glucocérébrosidase dans La maladie de gaucher en quantités similaires de détergent peut-être nuire aux autres enzymes. Pour α-galactosidase A, une méthode de perturbation axée sur la sonication cellulaire doit être évitée.

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    Disclosures

    Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

    Acknowledgments

    Les auteurs aimeraient remercier Mandy lenainquitousse et Tina Czajka excellent soutien technique. Nous remercions langue édition aide Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, é.-u.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Tags

    Médecine numéro 130 lysosomale phénotype glycosidase médicaments à petites molécules les essais précliniques thérapie personnalisée
    <em>In Vitro</em> Mesure d’enzyme à Test pharmacologique chaperon réactivité Fabry et la maladie de Pompe
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    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann,More

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

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