Summary
יש דרישה לעשות ניסויים פרה-קליניים של בדיקות עבור מחלקה הרומן של תרופות היתום"בשם מלווים תרופתי לשחזור, מהיר ויעיל. פיתחנו assay המבוסס על תרבות של תאים פשוטים מאוד מתוקננת, תכליתי למסך המטופלים זכאים, כמו גם רומן המלווה תרופתי סמים.
Abstract
השימוש של רפואה אישית לטיפול במחלות monogenic נדירים כמו הפרעות באנזימים (LSDs) קוראים תיגר על ידי מורכבים עיצובים הניסיון הקליני, עלויות גבוהות ומספרים המטופל נמוך מאות אללים mutant הם מעורבים ברוב LSDs. המחלות מסווגים בדרך כלל 2-3 סוגים קליניים שונים בהתאם לחומרת. יתר על כן, אפיון מולקולרי גנוטיפ יכול לעזור לחזות את התוצאות הקליניות ולהודיע בחולה. לכן, פיתחנו assay התרבות של תאים פשוטים המבוסס על תאים HEK293H heterologously ביטוי יתר של מוטציות. שזוהו מחלת פברי, פומפה. לאחרונה כבר הציג assay דומה כמבחן פרה כדי לזהות מוטציות קלה עבור טיפול המלווה תרופתי (PCT) מחלת פברי. כתב יד זה מתאר assay תרבות של התא המתוקן אשר מאפשר הערכה פנוטיפי מהירה של גרסאות allelic מחלת פברי, פומפה לזהות חולים זכאי עבור PCT, עשויים לסייע בפיתוח של pharmacochaperones רומן.
Introduction
ישנם מעל תריסר באנזימים הפרעות (LSDs) הקשורים בתפקוד glycosidase בעקבות מוטציות העיקרי. פברי (OMIM #301500), מחלת הפומפה (OMIM #232300), יותר מ 500 ו 200 מוטציות missense1,2,3 דווחו, בהתאמה, אשר תואמת כ- 60% של הרוזן מוטציה הכולל. אינספור גרסאות חדשות של ג'ין עדיין להיות מזוהים, שרבים מהם יש נודע משמעות. מחקרים מקיפים הביוכימי חשף כי מסוימים אחרים ואינן להוביל להשלים אובדן-של-פונקציה של הגן GLA (OMIM * 300644) במחלת פברי, אבל לגרום האנזים המתאימים להיכשל להגיע למצב מתקפלים למה המועדף4 . התוצאה שמירה ER והשפלה מוקדמת של האנזים תפקודית אחרת. מסקנות דומות נמשכו ב אחרים LSDs כולל מחלת פומפה5. יתר על כן, אפיון מולקולרי של גרסאות יכול להקל על פרשנות קליני של מוטציות בזמנו של אבחון6, רומז התקדמות LSD הוא תהליך אישי המבוסס על טיב המוטציה. לכן, הסיווג המקובלת בדרך כלל 2-3 סוגים שונים קליני צריך להיות מחדש על מנת לייעל קליניים ייעוץ והחלטות טיפוליות.
טיפול בתחליפי האנזים (ERT) זמין עבור שתי המחלות. ERT, עם זאת, מוגבל יעילות המושפעת רקמות איברים כגון המוח ואת שרירי השלד. יתר על כן, ERT יכול להפיק תשובה immunogenic זה מסכנת את היתרונות הטיפוליים. מלווים תרופתי (אישיים) הם חלופה אטרקטיבית הטיפול בחולים עם מוטציות מגיבים כביכול. מחשבים משמשים לפיגום מולקולרית עבור קיפול חלבונים נכונה וייצוב המונע בתורו (ER) רשתית תוך-פלזמית השמירה והשפלה הקשורים במיון של האנזים. יתר על כן, מחשבים שניתן אוראלית, שעשוי להיות מסוגלים לחצות את מחסום הדם מוח. לכן, ייתכן PCT אפשרות מעשית יותר לטיפול בחולים עם מסוימים אחרים. עבור סקירה מקיפה על יישום מחשב ב- LSDs, להפנות הסקירה מצוינת על-ידי Parenti7.
הגילוי של מחלה הגורמת אללים mutant מאות אתגרים בדיקות סמים ניסויים פרה-קליניים, מחייבת הערכה פשוטה, מהירה, מתוקננת מאוד מהחולים קלה לגישה רפואה אישית. כדי להעריך את השפעות מזיקות של LSD מוטציות גנטיות, לבחון את המועמד מוטציות לחזות חולים קלה עבור PCT, הייתה מערכת סטנדרטית מאוד ביטוי יתר בתאים HEK293H המאפשרת למדידה פעילות האנזים מהירה ואמינה פיתח. ביטוי יתר מערכות דומות שתוארו קודם לכן עבור מחלת פברי, פומפה באמצעות COS-78,9,10,11, הלה תאים12, או HEK29313 ,14,15,16 תאים עבור הגן glycosidase.
שיטה דומה מאוד אפילו פטנט כשיטה"לחזות את התגובה לטיפול תרופתי מלווה במחלות"17 המציין את הרלוונטיות של תא תרבות בעלת יכולת להיות משולב לתוך הקלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מבנים pcDNA3.1/GLA ו- pcDNA3.1/גה מוטציה
הערה: אסטרטגיות שיבוט GLA ו גה קידוד רצפים (תקליטורים) כבר דווח על15,מוקדמת יותר18.
- מוטגנזה באמצעות מוטגנזה
- שימוש ההפניה רצף NM_000169.2 ו- NM_000152.4 כתבניות עבור מוטגנזה מכוונת של גנים gla בה , גה , בהתאמה. יש קבוצה של טוהר גבוהה מלח חינם תחל (25-37-מרס) מסונתז על ידי ספק מסחרי, עם תחל antisense והיגיון זה של השינויים רצף בהתאמה המרכזי שלהם אורך להציג בנפרד את המוטציה. השתמש בכלי העיצוב תחל חינם לתמיכה של עיצוב פריימר19.
- תערובת התגובה, לשימוש של תנאים סטנדרטיים של הפתרון התגובה ותנאים PCR המסופקים על ידי היצרן.
- מיקס 5 µL של 10 x תגובת מאגר, 10 ng של פלסמיד תבנית זוגית גדילי ה-DNA (pcDNA3.1/GLA או pcDNA3.1/גה), 125 ng של כל פריימר, µL 1 של תערובת dNTP שסופקו, 3 µL של דימתיל סולפוקסיד ריאגנט של אמצעי אחסון המתאים של מים יונים (התגובה האחרונה נפח : 50 ΜL). לבסוף, מוסיפים 2.5 U של DNA פולימראז ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כמו פקד שלילי, נושא לאורך מדגם לא-פריימר.
- להתחיל את ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: שלב 1: 95 ° C עבור 1 דקות, שלב 2: 95 ° C 50 s, שלב 3: 60 ° C 50 s, צעד 4: 68 ° C למשך 8 דקות, חזור על שלב 2-4 פעמים 18 ו צעד 5: 68 ° C למשך 10 דקות.
- בעקבות PCR, להוסיף 1 µL של Dpnאני אנזים הגבלה (10 U µL) נוסף דגירה המבחנה התגובה ב 37 ° C עבור 1 h.
- שינוי, הקרנה של השיבוט הרצוי
- שינוי צורה של aliquot של תאים ultracompetent בהתאם להמלצות היצרן. שימוש SOC בינוני (טריפטון 2% (w/v), שמרים לחלץ 0.5% (w/v), NaCl 10 מ מ, אשלגן כלורי 2.5 ממ, לעקר ב 121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף סטרילי-מסוננים פתרונות של MgCl2 ו גלוקוז עד ריכוזים הסופי של 10 עד 20 מ מ, בהתאמה) במקום של היצרן בינוני. לאחר הניתוח, צלחת 250 µL של מוטגנזה מכוונת הדגימה על ליברות צלחת המכיל אמפיצילין µg/mL 100, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 h.
- להבטיח שהמספר של transformants הוא > 10 והתגובה התשואות לפחות שלושה מושבות כמו התגובה לא-פריימר שליטה, למשל, באמצעות צלחת זוהר כדי להקל על המושבה לספור. לאחר מכן לבחור 3 מושבות, להכין 3 מ"ל תרבויות לילה LB ציר בינוני.
- למחרת, לבצע הכנה פלסמיד עם ערכת סטנדרטי ולנתח כל רצף באמצעות T7 (5ʹ-TAA טק GAC TCA CTA תג GG-3ʹ) ו BGHr (5ʹ-תג AAG GCA חטיבתי TCG AGG-3ʹ) תחל באמצעות תקן סנגר רצף.
- להשתמש בכלי מתאים ביולוגיה מולקולרית כדי לנתח את הרצף. כאשר מזוהה המוטציה הרצוי ולא עוד רצף חריג בהשוואה NM_000169.2 (α-galactosidase א) או NM_000152.4 (חומצה α-glucosidase) נתפסת, בחר השיבוט לטיהור פלסמיד תרביות תאים-כיתה.
- לקבוע את הטוהר של ה-DNA על ידי מדידה של ספיגת בספקטרופוטומטר.
הערה: לאפשר רק ההכנות המניבים טוהר פלסמיד עם 260/280 ספיגת יחס של > 1.8 עבור תא תרבות ניסויים.
2. טיפוח של תאים HEK293H
- לשמור על תאים HEK293H של גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) Dulbecco´s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין. להשאיר את התאים water-jacket החממה ב 37 ° C תחת אווירה2 CO 5%.
- לטפח את התאים כדי צפיפות של 80-90%.
- האחות המדיום ולשטוף לאחר שימוש פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא Ca2 + ו- Mg2 +.
- המעבר על-ידי הוספת 0.05% טריפסין-EDTA דגירה למשך 5 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.
- פצל של תאים 1:15 בינוני טריים, זרע בקבוקון T75 חדש כדי לשמור על תרבות קבוע. אל תשתמש תאים עם מעברים יותר מ 25.
3. pcDNA3.1/GLA, pcDNA3.1/גה פלסמיד תרביות תאים, טיפול של HEK293H
- 24 שעןת לפני תרביות תאים, לשטוף את התאים HEK293H בבקבוקון תרבות תא T75 פעם אחת עם PBS עם Ca2 +, Mg2 +. לקצור את התאים עם 0.05% טריפסין-EDTA כפי שנקבע לעיל, בתאי זרע 1.5 x 10-5 החללים של צלחת 24 תרבות היטב באמצעות 500 בינוני DMEM של µL, בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה.
- לבצע את פרוטוקול תרביות תאים על פי הוראות היצרן. בדרך כלל, להשתמש תערובת של 1 µg של ה-DNA פלסמיד µL 2.5 של תרביות תאים ריאגנט µL 100 של DMEM ללא סרום. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר ומוסיפים התאים בצורה drop-wise לאחר מכן.
- להסיר את המדיום המכיל הכימית תרביות תאים לאחר פרק זמן של 4 שעות-37 °C/5% CO2 ולהוסיף 500 µL של DMEM טריים עם 10% FBS / 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
הערה: במהלך שלב זה, 1-Deoxygalactonojirimycin הידרוכלוריד (DGJ) או 1-Deoxynojirimycin הידרוכלוריד (DNJ) עשוי להתווסף המדיום תרבות במקום המיועד (משתמשים בפתרון מניות מימית 10 מ מ על מנת לקבל ריכוז סופי של 20 מיקרומטר DGJ ו- DNJ ). טרי DGJ או DNJ נוסף 42 h לאחר פלסמיד תקנים.
4. תא קציר וα-galactosidase A או α חומצה-glucosidase פעילות מדידה
- תא קציר
- ביום תחילת הקציר, להסיר התאים החממה, תשאף המדיום. לשטוף היטב התאים פי 2 עם PBS עם Ca2 + ו- Mg2 +.
הערה: השלב זה קריטי מכיוון DGJ ו- DNJ הן מעכבי חזק של α-galactosidase וα-glucosidase, בהתאמה לכל שארית יכול לפסול את המבחן. - להוסיף 200 µL של מים יונים ישירות על גבי התאים. לשטוף את התאים מהצלחת ומעבירים אותם אל צינור התגובה 1.5 mL.
- ביום תחילת הקציר, להסיר התאים החממה, תשאף המדיום. לשטוף היטב התאים פי 2 עם PBS עם Ca2 + ו- Mg2 +.
- המגון על ידי הקפאה והפשרה
- לשים את הדגימות קצף המתאימה לארון תקשורת מערבולת עבור 5 s כדי לייעל את פירוק. לשים את הדגימות לסירוגין בחנקן נוזלי 10 s ו בתוך אמבט מים בטמפרטורת החדר עד הפשרתו היה מלא (5 דקות).
- חזור על הליך זה 5 פעמים, ואז לסובב את הדגימות למשך 5 דקות ב 10,000 x g.
- להתכונן צינור טריים כל מדגם המכיל 40 µL של יונים H2O ולהוסיף 10 µL מדגם. לערבב פתרון על ידי vortexing בקצרה ולהעביר 10 µL לתוך החור של צלחת טוב 96 (כל מדגם דולר). למהול 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) פתרון מניות יונים H2O כדלקמן כדי לקבל עיקול רגיל: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- להתחיל את התגובה על-ידי הוספת µL 200 של BCA ריאגנט (ריאגנט A ו- B ריאגנט מעורב ביחס 50:1) ואת תקופת דגירה של h 1 בחושך ב 37 ° C תחת עצבנות קלה על שייקר מסלולית (300 סל ד). למדוד את ספיגת-560 nm, קורא את הצלחת.
הערה: הדגימות מכילים בדרך כלל בין 1 ל- 1.5 µg חלבון ליום µL.
- לדלל סכום מחושב של כל מדגם pipet לתוך צינורות התגובה mL 1.5 טריים להשיג 0.05 (עבור α-galactosidase א) או 0.5 (עבור α-glucosidase חומצה) פתרונות חלבון/µL µg. מערבולת הדגימות עבור s שוב 5 ו pipet 10 µL של דילול זה לתוך 96-ובכן צלחת (כל דגימה של כפילויות).
- להתחיל את התגובה על-ידי הוספת 20 µL של הפתרון המצע המתאים:
עבור α-galactosidase ת 2 מ מ 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-גל) במאגר מ' 0.06 פוספט ציטראט, pH 4.7.
עבור α חומצה-glucosidase: 2 מ מ 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) ב 0.025 M סודיום אצטט, pH 4.0. - דגירה התגובות אנזים עבור h 1 בחושך ב 37 ° C תחת עצבנות קלה על שייקר מסלולית (300 סל ד). לסיים את התגובה על ידי התוספת של 200 µL של 1.0 M, pH 10.5 מנוכי עונתיות גליצין-NaOH מאגר.
- הכן עיקול רגיל של 4-methylumbelliferone (4-MU) מ- 0.01 מ"ג/מ"ל מניה כדלקמן:
100 µL H2O / לא 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; H2O / 4 100 µL-MU, pipet 10 µL של כל דילול לתוך הבאר 96 צלחת (שבו כפילויות) ולהוסיף 200 µL של המאגר גליצין-NaOH 1.0 M בכל טוב כדי לכוונן את עוצמת הקול ו- pH. - מדד הפעילות אנזים קורא פלורסצנטיות מצויד במסנן המתאים להגדיר ולנתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה עבור ההתקן הקורא זריחה.
הערה: שני מצעים 4-ספל מופחתים על 4-MU במהלך חשיפה α-galactosidase A או α-glucosidase חומצה. 4 המשוחררים-MU הוא fluorochrome, אשר ניתן למדוד-360 ו 465 nm כמו עירור, פליטה אורכי הגל, בהתאמה, שימוש בקורא זריחה microplate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההליך מוטגנזה מכוונת
כדי להעריך את היעילות של GLA ג'ין מוטגנזה מכוונת, מוטציות סווגו לאחת הקטגוריות הבאות. גישה זו ליצירת מוטציות חשף את זה כ- 66.5% מוטציות GLA התקבלו בניסיון הראשון. 25% נוספים יכולה להיות מושגת לאחר ה-PCR השני שונה במקצת.
קטגוריה 1: מוטגנזה מכוונת ה-PCR היה יעיל בהניסיון הראשון.
קטגוריה 2: הראשון מוטגנזה מכוונת PCR נכשל (אין מושבות על הצלחת, אין מוטציה שנוסף); חזרה באמצעות פריימר אותו את הגדר על ידי הגדלת הטמפרטורה מחזק עד 68 מעלות צלזיוס היה יעיל.
קטגוריה 3: מאמץ רב יותר היה צריך להתבצע להניב השיבוט הרצוי (למשל, בדרך כלל אחד או יותר סטים חדשים של תחל תוכננו).
Α-galactosidase A וα חומצה-glucosidase אנזים פעילות מדידה
פעילות אנזים של אנזימים מוטנטים שונים הוקלט לאחר דגירה הקודם של התאים transiently transfected נוכחות או היעדרות של PC. טבלה 1 מתייחס התוצאות עבור 3 α-galactosidase A וα-glucosidase חומצה 3 מוטציות. הנתונים מוצגים כמו (1) הערכים המוחלטים של תחלופת המצע (nmol 4-מו * מ ג חלבון-1* h-1) ו כערכים יחסיים (2) מנורמל של האנזים פראי סוג. שני הביטויים הם שימושיים, מאז המצע סך מחזור ממחיש את היעילות של התגובה ורמזים הרגישות של המערכת, בעוד הערכים מנורמל יכול לתת חשוב עבור הסבירות של הגידול של המוטציה מצד אחד ואת יעילות של טיפול PC יישומי מאידך. בשלב ניסיוני, תהליך עבודה מתואר באיור 1 הוקם, אשר מתוכנן תקופת הדגירה 60 h עם המתחם (בשל סיבות טכניות, למשל HEK293H תא לצמיחה מהירה בתנאים הציג). אף-על-פי כבר צויין כי 10 מיקרומטר ריכוז הפלסמה השגה המרבי משוער DGJ14, בפרוטוקול הנוכחי משתמש 20 מיקרומטר כמו ריכוז סביר לצורך הקרנה עבור PC תגובתיות נתמך על ידי רבים מהעבודות המוקדמות4,20,21,22,23. יתר על כן, אותו יש כבר הניחו כי רמות גבוהות של פלזמה ניתן להגיע24.
איור 1 : זרימת עבודה במבחנה מדידת פעילות האנזים. (א) ציר הזמן של הניסוי מראה מאמץ תרבות תא 90 h עם יחסית מעט הידיים-על-הזמן הנדרש בנקודות זמן שצוין. (B) מוצגים pcDNA3.1 וקטורים נציג פלסמיד המכיל את התקליטורים פראי סוג של gla בה , גה . פלסמידים פראי סוג GLA וגה פלסמידים כולל המוטציה שנוספו בהתאמה עניין שימשו כדי transiently transfect תאים HEK293H מצופה בתבנית 24 היטב. לאחר תקופה כדי לאפשר את התאים לסנתז את המוצרים המתאימים ג'ין ולאפשר עיבוד אנזים, תחבורה lysosomal ו PC פעולה, התאים היו lysed נמדד קורא צלחת פלורסצנטיות, נותחה באמצעות התוכנה המתאימים. C: מורפולוגיה תא ומצב הצמיחה של התאים HEK293H מוצגים לאורך כל זמן הניסוי. גודל ברים = 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פעילות אנזים במבחנה | |||||
| GLA | יליד | DGJ 20 מיקרומטר | |||
| מוטציה (AA) | nmol 4-ספל-גל/mg/h (ממוצע) | % ממוצע (±SD, N) | nmol 4-ספל-גל/mg/h (ממוצע) | % ממוצע (±SD, N) | משמעות |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8.8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44.2 (±3.6, 5) | **** |
| גה | יליד | DNJ 20 מיקרומטר | |||
| מוטציה (AA) | nmol 4-ספל-glu/mg/h (ממוצע) | % ממוצע (±SD, N) | nmol 4-ספל-glu/mg/h (ממוצע) | % ממוצע (±SD, N) | משמעות |
| p.Y455F | 41.1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31.4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65.7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166.5 | 16.7 (±1.5, 5) | ** |
| p.L552P | 0.0 | 0.0 (±. 2, 5) | 104.3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
טבלה 1: פעילות האנזים α-galactosidase A וα חומצה-glucosidase- הטבלה מציגה תוצאות נציג עבור A α-galactosidase 3 ו- 3 מוטציות α חומצה-glucosidase עם ובלי של מחשבים DGJ או DNJ. נתוני פעילות האנזים מוחלטת תוקנה עבור פעילות אנזים אנדוגני של תאי HEK293H. כדי להעריך את פעילות אנזים אנדוגני, התאים היו transfected עם וקטור ריק pcDNA3.1. הערכים היו 97.5 nmol 4-מו * מ ג חלבון-1* h-1 עבור α-galactosidase A ו- 41.6 nmol 4-מו * מ ג חלבון-1* h-1 עבור α חומצה-glucosidase, בהתאמה; ערכי פעילות האנזים היו מנורמל ל פראי סוג אנזים מן הניסויים המתאימים, מה שמסביר את הסטיות של ערכים יחסיים בין המוטציות שונים.לאחר ניסויים התרבות התא עצמאי 5 (N = 5), אחד ביצעו ב כפילויות טכני, סטיית התקן של נאסר עליה להיות > 15% של הממוצע. יחס T-בדיקות שימשו כדי לחשב את ההפרש שבין האנזים אינו מטופל ומטופל -PC.
* p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.005, * * * p < 0.001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מספק תוצאות חזקים להערכת הנזק האנזים במחלות lysosomal תורשתי של חילוף החומרים. כתב יד זה הוא שתיקון בפרוטוקול שפורסם מוקדם יותר15. השינויים המכריעים לערב לכתחילה (קרי, בתהליך הכנת הבונה וקטור מוטציה), סטנדרטיזציה של פרוטוקול התרבות התא (קרי, תחזוקה תא HEK293H ותנאי תרביות תאים), הגבוה מספר חזרות ניסיוני (לפחות 5), שתרמו מאוד הפארמצבטית של התוצאות. בסך הכל שני גנים יעד נגיש עבור מוטגנזה מכוונת, ריבוי של מוטציות באפשרותך להרכיב במקביל. יחס אות/רעש גבוה יחסית הושג בהתחשב בכך פעילות אנזים אנדוגני בתוך התאים HEK293H היתה זניחה 1/50 (α-galactosidase א) ו- 1/20 (חומצה α-glucosidase) של הגן יתר ביטוי פראי סוג. לפיכך, יש פתרון מעולה בין פראי סוג אנזים מוטציה. יצוין כי כמות שונה של חלבון סה כ הוחלה עבור פעילות וזמינותו של שני אנזימים (0.5 ו- 5 µg, בהתאמה), כי פעילות החומצה α-glucosidase היה בסדר גודל נמוך יותר מזה של α-galactosidase א
כאמור לעיל, פרמטרים assay לעיתים קרובות שנוי במחלוקת, מאחר מעבדות רבות פיתחו בעצמם מבחני לחקור lysosomal glycosidases. המערכות שיכול להיות שונה סוג התא, פלסמיד-וקטור, טיפוח תנאים, ועיצוב תקופת החשיפה לסמים רק עד כמה פרמטרים רבים שם. שפורסם לאחרונה מטא אנליזה על מחלת פברי הדגימו כי האנזים פעילות הקלטות (עם או בלי מחשב) של התא transfected מודלים (למשל, HEK293, כי-7) היה במידה רבה על פי התוצאות המתקבלות מ- (נגזר החולה תאים בעיקר לימפוציטים או fibroblasts) לגבי השאלה, אם יש מוטציה הוא מגיבים PC24. דו חות קודמים ישירות השוואת הנגזרות החולה תאים ומודלים תרביות תאים הוכיח כי ביטוי יתר מערכות ישקפו את המצב בתאים המטופל מבלי להתפשר על מסקנה13,14. ניתן לפיכך להסיק שמקדם, ללא קשר פרוטוקול מסוים, התוצאות המתקבלות על ידי סופרים שונים לא השתנה על-ידי מערכות סלולר שונות, אף-על-פי הגדרות המשיב יכול להיות מפוצלים. ההגדרה הנוכחית עבור מוטציה מגיבה הוא 20% עלייה יחסית אנזים 5% אנזים מוחלטת עלייה לעומת האנזים פראי סוג לאחר דגירה עם 20 מיקרומטר DGJ עבור 60 h. מסד נתונים מקיף, FabryCEP, מאפשר השוואת התוצאות המתקבלות על ידי גישות שונות במשך מאות מוטציות α-galactosidase25.
קריטריונים אלה מספיקים לחזות יתרונות קליניים של DGJ, DNJ עדיין לא ברור, שכן רמת הפעילות הדרושים למנוע מחלות סימפטומטי שנוי במחלוקת. מחקר לשעבר הציע שאולי מספיק עבור מערכת תקינה26על 10-15% של פעילות שיורית. עם זאת, בדו ח שפורסם לאחרונה ממחקר קליני שלב 2 עבור DGJ, עלייה 1% הוערך שעשוי להיות מועיל עבור המטופל, כאשר הפעילות הבסיסית הייתה פחות מ 1% של נורמלי27. תוצאות קליניות האחרונות מציע כי חולים חזה כדי להגיב על מחשבים אישיים על ידי הגדרה למשיב ≥ 20% עלייה יחסית ולהגדיל ≥ 3% מוחלטת של פראי סוג α-galactosidase פעילות בתאים HEK293H לאחר דגירה עם 10 מיקרומטר DGJ נגזר למעשה היתרון הקליני עם מייצב המחלה או אפילו שיפור על ידי פרמטרים כליות, לב28. בעוד DGJ כבר אושרה על ידי ה-FDA והנציבות האירופית כטיפול יחיד עבור מחלת פברי, הקורס של מחשבים אישיים כגון DNJ ו- N-בוטיל-DNJ הנגזרת של מחלת הפומפה נראה שונה. בגישה monotherapeutical עם DNJ הופסקה במהלך ניסוי קליני שלב II בשל תופעות לוואי חמורות בחלק של חולים29. עם זאת, הטיפול האישי בשילוב עם ERT שאושרו הראה תוצאות משופרות באופן משמעותי לגבי הפחתת המצע (גליקוגן) המחלה לעומת ERT יחידני30.
אנו ממליצים כי הגישה שהוצגו ניתן להרחיב אחרים LSDs ולמחשבים אחרים כגון Gaucher, קראבה, טיי-זקס/Sandhoff, GM1 gangliosidosis, אבל זה לא יפעלו במקרים ספציפיים, איפה לדוגמה יחס אות/רעש של המערכת אינה מספיקה. להקפיד לבחור שיטה הפרעה תא מתאים כדי להתכונן lysate תא בנחישות פעילות האנזים, כי התוספת של חומרי ניקוי למאגר פירוק שאולי מרמז על קרום מכורך אנזימים כגון גלוקוצרברוזידאז ב מחלת gaucher בעוד כמויות דומות של דטרגנט עלול לפגוע אנזימים אחרים. עבור α-galactosidase A, יש להימנע שיטה הפרעה המבוסס sonication cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר Loebert מנדי, טינה Czajka לתמיכה טכנית מצוינת. אנו מודים פלורה לואו (הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה ב) על שפת עריכה עזרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
