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Medicine

इन विट्रो एंजाइम माप Fabry और धूमधाम से रोग में औषधीय निगरानी जवाबदेही का परीक्षण करने के लिए

doi: 10.3791/56550 Published: December 20, 2017

Summary

वहां एक मांग के लिए पूर्व नैदानिक परीक्षण करने के लिए "अनाथ" दवाओं के एक उपंयास वर्ग के लिए बुलाया औषधीय chaperones प्रतिलिपि, तेज, और कुशल । हम विकसित एक सरल, उच्च मानकीकृत, और बहुमुखी कोशिका संस्कृति आधारित परख के लिए पात्र रोगियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपंयास औषधीय निगरानी दवाओं के लिए स्क्रीन ।

Abstract

व्यक्तिगत दवा का उपयोग लाइसोसोमल भंडारण विकारों (LSDs) की तरह दुर्लभ monogenic रोगों के इलाज के लिए जटिल नैदानिक परीक्षण डिजाइन, उच्च लागत, और कम रोगी संख्या द्वारा चुनौती दी है । उत्परिवर्ती alleles के सैकड़ों LSDs के अधिकांश में फंसा रहे हैं । रोगों आम तौर पर गंभीरता के अनुसार 2 से 3 अलग नैदानिक प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं । इसके अलावा, जीनोटाइप के आणविक लक्षण वर्णन मदद नैदानिक परिणामों की भविष्यवाणी और रोगी देखभाल सूचित कर सकते हैं । इसलिए, हम एक सरल सेल संस्कृति परख HEK293H कोशिकाओं पर आधारित heterologously पर Fabry और धूमधाम से रोग में पहचान उत्परिवर्तनों व्यक्त विकसित की है । इसी तरह की परख हाल ही में एक नैदानिक परीक्षण के रूप में पेश किया गया है Fabry रोग में औषधीय निगरानी चिकित्सा (पीसीटी) के लिए नवागत उत्परिवर्तनों की पहचान । इस पांडुलिपि एक संशोधन सेल संस्कृति परख जो Fabry और धूमधाम से allelic वेरिएंट के तेजी से phenotypic आकलन में सक्षम बनाता है पीसीटी के लिए पात्र रोगियों की पहचान और उपंयास pharmacochaperones के विकास में सहायता कर सकते है वर्णन करता है ।

Introduction

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वहां एक दर्जन से अधिक लाइसोसोमल भंडारण विकारों (LSDs) प्राथमिक जीन उत्परिवर्तनों का एक परिणाम के रूप में glycosidase रोग से संबंधित हैं । Fabry में (OMIM #301500) और धूमधाम (OMIM #232300) रोग, अधिक से अधिक ५०० और २००2भावना उत्परिवर्तनों,3 क्रमशः, रिपोर्ट किया गया है, जो कुल उत्परिवर्तन गिनती के बारे में ६०% से मेल खाती है । कई नए जीन वेरिएंट अभी भी पहचाना जा रहा है, जिनमें से बहुत से अज्ञात महत्व है । व्यापक जैव रासायनिक अध्ययन से पता चला कि कुछ पादी के लिए एक पूर्ण हानि का नेतृत्व नहीं करते-समारोह के GLA जीन (OMIM * ३००६४४) Fabry रोग में है, लेकिन इसी एंजाइम के कारण तक पहुंचने में विफल करने के लिए एक ऊष्मा इष्ट तह राज्य4 . एर प्रतिधारण और अंयथा कार्यात्मक एंजाइम की समय से पहले गिरावट में यह परिणाम है । इसी तरह के निष्कर्ष धूमधाम सेरोग सहित अन्य LSDs में तैयार किए गए हैं. इसके अलावा, एंजाइम वेरिएंट के आणविक लक्षण वर्णन6निदान के समय में उत्परिवर्तनों की नैदानिक व्याख्या की सुविधा कर सकते हैं, सुझाव है कि एलएसडी प्रगति एक व्यक्ति उत्परिवर्तन की प्रकृति के आधार पर प्रक्रिया है । इसलिए, आमतौर पर 2 से 3 विभिंन नैदानिक प्रकार में पारंपरिक वर्गीकरण क्रम में नैदानिक परामर्श और चिकित्सीय निर्णय को कारगर बनाने के लिए पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

एंजाइम रिप्लेसमेंट थेरेपी (ईआरटी) दोनों रोगों के लिए उपलब्ध है । ईआरटी, तथापि, प्रभावित ऊतकों में सीमित प्रभावकारिता/अंगों जैसे मस्तिष्क और कंकाल की मांसपेशी । इसके अलावा, ईआरटी एक immunogenic प्रतिक्रिया है कि अपने चिकित्सीय लाभ ख़तरे में डालना कर सकते हैं । औषधीय Chaperones (पीसीएस) तथाकथित उत्तरदाई उत्परिवर्तनों के साथ रोगियों के लिए एक आकर्षक उपचार विकल्प हैं । पीसी सही प्रोटीन तह और स्थिरीकरण के लिए एक आणविक पाड़ के रूप में सेवा जो बारी में endoplasmic जालिका (एर) प्रतिधारण और एर एंजाइम के जुड़े क्षरण को रोकता है । इसके अलावा, पीसी मौखिक रूप से प्रशासित किया जा सकता है और संभावित रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने में सक्षम हैं । इसलिए, पीसीटी कुछ पादी के साथ रोगियों के इलाज के लिए एक अधिक व्यवहार्य विकल्प हो सकता है । LSDs में पीसी आवेदन पर एक व्यापक समीक्षा के लिए, Parenti7द्वारा उत्कृष्ट समीक्षा करने के लिए देखें ।

उत्परिवर्ती alleles चुनौतियों पूर्व नैदानिक दवा परीक्षण और आवश्यक एक व्यक्तिगत दवा दृष्टिकोण के लिए नवागत रोगियों के एक सरल, तेज, और उच्च मानकीकृत आकलन के कारण रोग के सैकड़ों की खोज. आदेश में एलएसडी जीन उत्परिवर्तनों के हानिकारक प्रभावों का आकलन करने के लिए और उंमीदवार उत्परिवर्तनों परीक्षण के लिए पीसीटी के लिए नवागत रोगियों की भविष्यवाणी, एक उच्च मानकीकृत HEK293H कोशिकाओं है कि तेजी से और विश्वसनीय एंजाइम गतिविधि माप के लिए अनुमति देता में अभिव्यक्ति प्रणाली पर विकसित. इसी तरह की अधिक अभिव्यक्ति प्रणालियों पहले Fabry और धूमधाम से या तो प्रयोग रोग के लिए वर्णित किया गया है-78,9,10,11, हेला कोशिकाओं12, या HEK29313 ,glycosidase जीन के लिए14,15,16 कोशिकाएं हैं ।

एक बहुत ही विधि भी एक विधि "के रूप में पेटेंट कराया गया है रोगों के औषधीय निगरानी उपचार के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी"17 एक कोशिका संस्कृति नैदानिक अभ्यास में एकीकृत किया जा रहा करने में सक्षम प्रणाली की प्रासंगिकता का संकेत ।

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Protocol

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1. उत्परिवर्ती pcdna 3.1/GLA और pcdna 3.1/गाा constructs की तैयारी

नोट: GLA और गाा कोडिंग अनुक्रम (सीडीएस) के लिए क्लोनिंग रणनीतियों पहले15,18बताया गया है ।

  1. साइट-निर्देशित Mutagenesis का उपयोग कर साइट-निर्देशित Mutagenesis
    1. क्रमशः mutagenesis और GLA जीन के गाा के लिए टेंपलेट्स के रूप में संदर्भ अनुक्रम nm_ 000169.2 और nm_ 000152.4 का उपयोग करें । उच्च शुद्धता नमक मुक्त प्राइमरों का एक सेट है (25-37-mers) एक वाणिज्यिक प्रदाता द्वारा संश्लेषित, भावना और antisense संबंधित अनुक्रम उनकी लंबाई के लिए केंद्रीय संशोधनों में से एक को व्यक्तिगत रूप से उत्परिवर्तन शुरू करने के लिए ले जाने वाले प्राइमरों के साथ । प्राइमर डिजाइन19का समर्थन करने के लिए नि: शुल्क प्राइमरी डिजाइन उपकरण का प्रयोग करें ।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए, प्रतिक्रिया समाधान और पीसीआर शर्तों निर्माता द्वारा प्रदान के लिए मानक शर्तों का उपयोग करें ।
      1. मिक्स 5 µ 10x प्रतिक्रिया बफर के एल, 10 डबल के एनजी-फंसे टेंपलेट प्लाज्मिड डीएनए (pcdna 3.1/GLA या pcdna 3.1/गाा), १२५ प्रत्येक प्राइमर के एनजी, 1 µ प्रदान की एल के मिश्रण, dNTP के 3 µ एल के एक उपयुक्त मात्रा में जल (अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा : ५० µ l). अंत में, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा डीएनए पोलीमरेज़ और मिश्रण के २.५ यू जोड़ें । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक नहीं, प्राइमर नमूना साथ ले ।
    3. पीसीआर शुरू निंनलिखित कार्यक्रम का उपयोग: चरण 1:95 ° c के लिए 1 मिनट, चरण 2:95 ° c के लिए ५० s, चरण 3:60 ° c के लिए ५० s, चरण 4:68 ° c 8 मिनट के लिए, दोहराएँ चरण 2-4 18 बार, और चरण 5:68 ° c 10 मिनट के लिए.
      1. पीसीआर के बाद, Dpnमैं प्रतिबंध एंजाइम (10 U/µ एल) के 1 µ एल जोड़ें और आगे ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए प्रतिक्रिया शीशी मशीन ।
  2. परिवर्तन और स्क्रीनिंग वांछित क्लोन के लिए
    1. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार ultracompetent कक्षों की किसी aliquot को रूपांतरित करना. समाज माध्यम का उपयोग करें (tryptone 2% (डब्ल्यू/खमीर निकालने ०.५% (डब्ल्यू/वी), NaCl 10 मिमी, KCl २.५ मिमी, १२१ डिग्री सेल्सियस पर बंध्याकरण, और फिर MgCl2 और ग्लूकोज की अंतिम सांद्रता के लिए ऊपर बाँझ फ़िल्टर समाधान जोड़ने के लिए 10 और 20 मिमी, क्रमशः) के बजाय निर्माता की मध्यम. प्रक्रिया के बाद, प्लेट २५० µ एक पौंड प्लेट पर नमूना mutagenesis के एल १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन और मशीन के लिए ३७ ° c पर 18 ज.
    2. विश्वास दिलाता हूं कि transformants की संख्या & #62; 10 और रिएक्शन की पैदावार नहीं-प्राइमरी कंट्रोल रिएक्शन के रूप में कई कॉलोनियों के रूप में कम से तीन गुना, जैसे, एक चमकदार थाली का उपयोग करने के लिए कॉलोनी गिनती की सुविधा । फिर 3 कॉलोनियों उठाओ और पौंड शोरबा माध्यम में 3 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृतियों तैयार करते हैं ।
    3. अगले दिन, एक मानक किट के साथ प्लाज्मिड तैयारी बाहर ले और T7 का उपयोग कर पूरे अनुक्रम का विश्लेषण (5 पिरणामस्वरूप-ताा टीएसी को GAC टीसीए CTA टैग जीजी-3 पिरणामस्वरूप) और BGHr (5 पिरणामस्वरूप-टैग AAG जीसीए सीएजी TCG AGG-3 पिरणामस्वरूप) प्राइमरों के माध्यम से मानक सैंज अनुक्रमण ।
    4. अनुक्रम का विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त आणविक जीवविज्ञान उपकरण का उपयोग करें । जब वांछित उत्परिवर्तन का पता चला है और कोई आगे अनुक्रम विषमता nm_ 000169.2 (α-galactosidase ए) या nm_ 000152.4 (एसिड α-ग्लुकोसिडेस) की तुलना में देखा जाता है, अभिकर्मक ग्रेड प्लाज्मिड शुद्धिकरण के लिए क्लोन का चयन करें ।
    5. एक spectrophotometer में अवशोषण को मापने के द्वारा डीएनए की पवित्रता का निर्धारण ।
      नोट: सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए & #62; १.८ के 260/280 अवशोषक अनुपात के साथ एक प्लाज्मिड शुद्धता उपज है कि केवल तैयारी की अनुमति दें ।

2. HEK293H कोशिकाओं की खेती

  1. उच्च ग्लूकोज में HEK293H कोशिकाओं को बनाए रखने (४.५ g/Dulbecco ´ एस संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% CO2 वातावरण के अंतर्गत एक पानी जैकेट मशीन में कोशिकाओं रखो ।
  2. ८०-९०% के घनत्व के लिए कोशिकाओं की खेती ।
  3. मध्यम और महाप्राण एक बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) बिना सीए2 + और मिलीग्राम2 +का उपयोग कर धो लें ।
  4. ०.०५% Trypsin-EDTA और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर मशीन जोड़कर पारित2
  5. स्थायी संस्कृति को बनाए रखने के लिए नए T75 कुप्पी में ताजे मध्यम और बीज में 1:15 कोशिकाओं को विभाजित करें । 25 से अधिक अंश वाले कक्षों का उपयोग न करें ।

3. pcdna 3.1/GLA और pcdna 3.1/गाा प्लाज्मिड अभिकर्मक और HEK293H का उपचार

  1. 24 एच अभिकर्मक करने से पहले, एक T75 सेल संस्कृति कुप्पी में HEK293H कोशिकाओं को धोने के साथ पंजाबियों के साथ एक बार सीए2 +,2 मिलीग्राम +। फसल के रूप में ०.०५% Trypsin-EDTA के साथ कोशिकाओं को ऊपर कहा और बीज १.५ एक्स 105 कोशिकाओं की गुहाओं में एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति ५०० µ एल DMEM मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% FBS के साथ पूरक का उपयोग कर ।
  2. निर्माता के मैनुअल के अनुसार एक अभिकर्मक प्रोटोकॉल बाहर ले । आम तौर पर, प्लाज्मिड डीएनए के 1 µ जी और सीरम मुक्त µ के १०० DMEM एल में अभिकर्मक रिएजेंट के २.५ µ एल का एक मिश्रण का उपयोग करें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मशीन और उसके बाद एक बूंद वार तरीके से कोशिकाओं को जोड़ने ।
  3. ३७ ° c/5% CO2 पर 4 h की अवधि के बाद अभिकर्मक रिएजेंट वाले माध्यम को निकालें और 10% FBS के साथ ताजा DMEM के ५०० µ l को जोड़ें/1% पेनिसिलिन/streptomycin/
    नोट: इस चरण के दौरान, 1-Deoxygalactonojirimycin हाइडरोक्लॉराइड (DGJ) या 1-Deoxynojirimycin हाइडरोक्लॉराइड (DNJ) संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है जहां इरादा (10 मिमी के एक जलीय स्टॉक समाधान का उपयोग करने के लिए 20 µ एम DGJ और DNJ की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ). ताजा DGJ या DNJ प्लाज्मिड अभिकर्मक के बाद ४२ ज जोड़ा गया ।

4. कोशिका कटाई और α-galactosidase एक या अम्ल α-ग्लुकोसिडेस गतिविधि मापन

  1. सेल हार्वेस्ट
    1. फसल के दिन, कोशिकाओं को मशीन से निकालें और मध्यम महाप्राण । ध्यान से कोशिकाओं को 2 बार सीए2 + और मिलीग्राम2 +के साथ पंजाबियों के साथ धो ।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि DGJ और DNJ α-galactosidase और α-ग्लुकोसिडेस, क्रमशः के प्रबल अवरोधकों हैं, और किसी भी बचा परीक्षण अमान्य होगा ।
    2. कोशिकाओं के शीर्ष पर सीधे पानी के २०० µ एल जोड़ें । प्लेट से कुल्ला कोशिकाओं और उंहें एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
  2. ठंड से Homogenization और गल कर
    1. lysis अधिक कुशल बनाने के लिए 5 एस के लिए एक उचित फोम रैक और भंवर में नमूने रखो । 10 एस के लिए तरल नाइट्रोजन में बारी और एक कमरे के तापमान पानी स्नान में जब तक गल पूरा हो गया था नमूने रखो (5 मिनट) ।
    2. इस प्रक्रिया को 5 बार दोहराएं और फिर १०,००० x g पर 5 मिनट के लिए नमूनों को स्पिन करें ।
supernatant और पिपेट को एक नई रिएक्शन ट्यूब में रखें ।
  • प्रोटीन एकाग्रता bicinchoninic एसिड का उपयोग संकल्प (बीसीए) परख
    1. प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा ट्यूब तैयार करने के लिए ४० µ एल से युक्त H2O और नमूना के 10 µ l जोड़ें । संक्षेप में भंवर द्वारा मिश्रण समाधान और एक ९६ अच्छी तरह से थाली (तपसिल में प्रत्येक नमूने) की एक गुहा में 10 µ एल हस्तांतरण । एक 2 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में शेयर समाधान कमजोर एच2o के रूप में एक मानक वक्र प्राप्त करने के लिए निंनानुसार: ५० µ l H2o/50 µ l BSA; ६० µ l ज2O/40 µ l BSA; ७० µ l ज2O/30 µ l BSA; ८० µ l ज2O/20 µ l BSA; ९० µ l ज2O/10 µ l BSA; १०० µ l ज2हे.
    2. बीसीए रिएजेंट के २०० µ l को जोड़कर प्रतिक्रिया प्रारंभ करें (रिएजेंट ए और रिएजेंट बी एक 50:1 अनुपात में मिश्रित) और एक कक्षीय शेखर पर मामूली आंदोलन के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 1 ज के लिए मशीन (३०० rpm) । एक प्लेट रीडर में ५६० एनएम पर अवशोषक उपाय ।
      नोट: नमूनों में आमतौर पर 1 और १.५ के बीच µ ग्राम प्रोटीन प्रति µ एल होते हैं ।
  • कृत्रिम 4-Methylumbelliferyl सब्सट्रेट (4-मग) के साथ एंजाइम गतिविधि माप
    1. एक नमूना और प्लास्टिक की गणना की मात्रा ताजा १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में ०.०५ प्राप्त करने के लिए पतला (α-galactosidase ए के लिए) या ०.५ (एसिड α के लिए-ग्लुकोसिडेस) µ ग्राम प्रोटीन/µ एल समाधान । भंवर 5 एस के लिए फिर से नमूने और प्लास्टिक 10 µ एल इस कमजोर पड़ने के एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट में (डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने) ।
    2. संबंधित सब्सट्रेट समाधान के 20 µ एल जोड़कर प्रतिक्रिया प्रारंभ करें:
      α-galactosidase ए के लिए: 2 मिमी 4-Methylumbelliferyl-α-डी-galactopyranoside (4-म्यू-लड़की) ०.०६ मीटर फास्फेट साइट्रेट बफर में, पीएच ४.७ ।
      एसिड α के लिए-ग्लुकोसिडेस: 2 मिमी 4-methylumbelliferyl α-डी-glucopyranoside (4-म्यू-glu) में ०.०२५ मीटर सोडियम एसीटेट, पीएच ४.० ।
    3. एक कक्षीय शेखर (३०० rpm) पर मामूली आंदोलन के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 1 ज के लिए एंजाइम प्रतिक्रियाओं की मशीन । १.० मीटर की २०० µ एल के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया समाप्त, पीएच १०.५ glycine-NaOH बफर समायोजित ।
    4. एक ०.०१ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक से 4 methylumbelliferone (4 म्यू) के एक मानक वक्र निम्नानुसार तैयार:
      १०० µ l ज2O/4-म्यूर; ८० µ l ज2O/20 µ l 4-म्यूर; ६० µ l ज2O/४० µ l 4-म्यूर; ४० µ l ज2O/६० µ l 4-म्यूर; 20 µ l ज2O/८० µ l 4-म्यूर; सं H2O/१०० µ l 4-म्यू, प्लास्टिक 10 µ l प्रत्येक कमजोर पड़ने के ९६ अच्छी तरह से प्लेट में (डुप्लिकेट में) और जोड़ने २०० µ l के १.० M glycine-NaOH बफर के क्रम में मात्रा और पीएच को समायोजित करने के लिए.
    5. उचित फिल्टर सेट से सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति रीडर में एंजाइम गतिविधि को मापने और प्रतिदीप्ति रीडर डिवाइस के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण.
      नोट: दोनों 4-मग सब्सट्रेट α-galactosidase एक या एसिड α-ग्लुकोसिडेस के लिए जोखिम के दौरान 4-म्यू करने के लिए कम कर रहे हैं । जारी 4-म्यू एक fluorochrome है, जो उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के रूप में ३६० और ४६५ एनएम में मापा जा सकता है, क्रमशः, एक microplate प्रतिदीप्ति रीडर का उपयोग कर ।
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    Representative Results

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    mutagenesis कार्यविधि
    के लिए GLA जीन mutagenesis की दक्षता का आकलन, उत्परिवर्तनों निंनलिखित श्रेणियों में से एक में वर्गीकृत किया गया । इस दृष्टिकोण उत्परिवर्तनों उत्पंन करने के लिए पता चला है कि GLA उत्परिवर्तनों के बारे में ६६.५% पहले प्रयास में प्राप्त किया गया । एक और 25% एक थोड़ा संशोधित दूसरा पीसीआर के बाद प्राप्त किया जा सकता है ।

    श्रेणी 1: mutagenesis पीसीआर पहले प्रयास में प्रभावी था ।

    श्रेणी 2: पहले mutagenesis पीसीआर विफल (प्लेट पर कोई कालोनियों, कोई डाला उत्परिवर्तन); पुनरावृत्ति एक ही प्राइमर ६८ डिग्री सेल्सियस तक एनीलिंग तापमान में वृद्धि के द्वारा निर्धारित का उपयोग कर प्रभावी था ।

    श्रेणी 3: अधिक प्रयास के लिए वांछित क्लोन उपज किया जाना था (उदा, आमतौर पर एक या अधिक प्राइमरों के नए सेट डिजाइन किए गए थे) ।

    α-galactosidase एक और एसिड α-ग्लुकोसिडेस एंजाइम गतिविधि माप
    अलग उत्परिवर्ती एंजाइमों की एंजाइम गतिविधि उपस्थिति या एक पीसी की अनुपस्थिति में क्षणिक transfected कोशिकाओं के पिछले गर्मी के बाद दर्ज किया गया था । तालिका 1 3 α-galactosidase A और 3 एसिड α-ग्लुकोसिडेस उत्परिवर्तनों के लिए परिणामों को संदर्भित करता है । डेटा (1) सब्सट्रेट कारोबार (nmol 4-म्यू * मिलीग्राम प्रोटीन-1* h-1) और के रूप में (2) सापेक्ष जंगली प्रकार एंजाइम को सामान्यीकृत मूल्यों के लिए निरपेक्ष मूल्यों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. दोनों अभिव्यक्ति उपयोगी होते हैं, के बाद से कुल सब्सट्रेट कारोबार प्रतिक्रिया की दक्षता और प्रणाली की संवेदनशीलता दिखाता है, जबकि सामान्यीकृत मूल्यों एक हाथ पर उत्परिवर्तन के द्रोह की संभावना के लिए महत्वपूर्ण संकेत दे सकते हैं और दूसरी ओर एप्लाइड पीसी उपचार की दक्षता । प्रयोगात्मक चरण के लिए, कार्य प्रवाह चित्रा 1 में चित्रित किया गया था, जो यौगिक (तकनीकी कारणों के कारण, शुरू की शर्तों के तहत तेजी से HEK293H सेल विकास के लिए) के साथ एक ६० ज गर्मी की अवधि निर्धारित की गई थी । हालांकि यह कहा गया है कि 10 µ एम DGJ14के लिए अनुमानित अधिकतम प्राप्त प्लाज्मा एकाग्रता थी, वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में कई द्वारा समर्थित पीसी जवाबदेही के लिए एक स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए एक उचित एकाग्रता के रूप में 20 µ मीटर का उपयोग करता है इससे पहले काम करता है4,20,21,22,23। इसके अलावा, यह माने गया है कि उच्च प्लाज्मा स्तर को24तक पहुंचा जा सकता है ।

    Figure 1
    चित्र 1 : के कार्य प्रवाह इन विट्रो एंजाइम गतिविधि माप(क) प्रयोग की समयरेखा इंगित समय बिंदुओं पर अपेक्षाकृत कम हाथों पर आवश्यक समय के साथ एक ९० एच सेल संस्कृति प्रयास से पता चलता है । (ख) प्रतिनिधि प्लाज्मिड वैक्टर pcdna 3.1 जिसमे GLA और गाा के वाइल्ड टाइप cds दर्शाए गए हैं । GLA और गाा जंगली प्रकार plasmids और plasmids ब्याज की संबंधित डाला उत्परिवर्तन सहित क्षणिक transfect HEK293H 24 अच्छी तरह से प्रारूप में चढ़ाया कोशिकाओं को इस्तेमाल किया गया । एक अवधि के बाद संबंधित जीन उत्पादों को संश्लेषित करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति और एंजाइम प्रसंस्करण के लिए अनुमति देने के लिए, लाइसोसोमल परिवहन, और पीसी कार्रवाई, कोशिकाओं लीजड थे और एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में मापा और संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण. C: सेल आकृति विज्ञान और HEK293H कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति प्रयोग के समय पाठ्यक्रम में दिखाए जाते हैं. स्केल बार्स = १०० µm इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    इन विट्रो एंजाइम गतिविधि
    gla देशी 20 µ m DGJ
    उत्परिवर्तन (एए) nmol ४-मग-gal/mg/h (mean) % मतलब (± एसडी, एन) nmol ४-मग-gal/mg/h (mean) % मतलब (± एसडी, एन) महत्व
    पी. A143T २३८४.७ २९.२ (± २.६, 5) ४२२३.० ५२.० (± ४.४, 5) ***
    पी. A156V ३७९.२ ४.३ (± .8, 5) १४३७.५ १६.३ (± १.३, 5) ****
    पी. R301Q ७७७.४ ८.८ (± १.१, 5) ३००२.६ ४४.२ (± ३.६, 5) ****
    गाा देशी 20 µ m DNJ
    उत्परिवर्तन (एए) nmol 4-मग-glu/mg/h (mean) % मतलब (± एसडी, एन) nmol 4-मग-glu/mg/h (mean) % मतलब (± एसडी, एन) महत्व
    पी. Y455F ४१.१ ५.४ (± .4, 5) २४६.६ ३१.४ (± २.८, 5) ***
    पी. P545L ६५.७ ६.६ (± .4, 5) १६६.५ १६.७ (± १.५, 5) **
    पी. L552P ०.० ०.० (± .2, 5) १०४.३ १०.४ (± १.४, 5) ***

    तालिका 1: α के एंजाइम गतिविधि-galactosidase एक और एसिड α-ग्लुकोसिडेस । तालिका प्रतिनिधि परिणामों के लिए 3 α-galactosidase A और 3 एसिड α-ग्लुकोसिडेस म्यूटेंट के साथ और बिना पीसी DGJ या DNJ के लिए दिखाता है । पूर्ण एंजाइम गतिविधि डेटा HEK293H कोशिकाओं के अंतर्जात एंजाइम गतिविधि के लिए सही किया गया था । अंतर्जात एंजाइम गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं को एक pcdna 3.1 खाली सदिश के साथ transfected थे । मान ९७.५ nmol 4-म्यू * मिलीग्राम प्रोटीन-1* एच-1 के लिए α-galactosidase ए और ४१.६ nmol 4-म्यू * मिलीग्राम प्रोटीन-1* एच-1 एसिड α के लिए-ग्लुकोसिडेस, क्रमशः; एंजाइम गतिविधि मूल्यों इसी प्रयोगों, जो अलग म्यूटेंट के बीच रिश्तेदार मूल्यों की विचलन बताते से जंगली प्रकार एंजाइम को सामान्यीकृत किया गया.5 स्वतंत्र सेल कल्चर प्रयोगों (N = 5) के बाद, प्रत्येक तकनीकी डुप्लिकेट में किया जाता है, मानक विचलन की अनुमति नहीं दी गई थी & #62; 15% माध्य. अनुपात टी परीक्षण अनुपचारित और पीसी इलाज एंजाइम के बीच अंतर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
    * प & #60; ०.०५, * * प & #60; ०.०१, * * * प & #60; ०.००५, * * * * प & #60; ०.००१

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    Discussion

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    यहां वर्णित प्रोटोकॉल चयापचय के वंशानुगत लाइसोसोमल रोगों में एंजाइम क्षति आकलन के लिए मजबूत परिणाम बचाता है । यह पांडुलिपि पहले15प्रकाशित प्रोटोकॉल में एक संशोधन है । सबसे महत्वपूर्ण संशोधनों शामिल stringency (यानी, उत्परिवर्ती वेक्टर तैयार करने की प्रक्रिया में), सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के मानकीकरण (यानी, HEK293H सेल रखरखाव और अभिकर्मक शर्तों), और उच्च प्रयोगात्मक पुनरावृत्तियों की संख्या (कम से कम 5), जो अत्यधिक परिणामों के reproducibility के लिए योगदान दिया । कुल मिलाकर, दोनों लक्ष्य जीन mutagenesis के लिए आसानी से सुलभ है और उत्परिवर्तनों की बहुलता समानांतर में इकट्ठे किया जा सकता है । एक अपेक्षाकृत उच्च संकेत/शोर अनुपात HEK293H कोशिकाओं के भीतर कि अंतर्जात एंजाइम गतिविधि पर विचार हासिल किया गया था एक नगण्य 1/50 (α-galactosidase ए) और 1/20 (एसिड α-ग्लुकोसिडेस) पर व्यक्त जंगली प्रकार जीन. इस प्रकार, वहां जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती एंजाइम के बीच एक उत्कृष्ट संकल्प है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुल प्रोटीन की एक अलग राशि दोनों एंजाइमों की गतिविधि परख के लिए आवेदन किया गया था (०.५ और 5 µ जी, क्रमशः), क्योंकि एसिड α-ग्लुकोसिडेस गतिविधि परिमाण के एक आदेश था कि α की तुलना में कम-galactosidase ए ।

    जैसा कि ऊपर कहा, परख मापदंडों अक्सर विवादास्पद रहे हैं, के बाद से कई प्रयोगशालाओं अपनी परख विकसित किया है लाइसोसोमल glycosidases की जांच । सिस्टम सेल प्रकार, प्लाज्मिड-वेक्टर डिजाइन, खेती की स्थिति, और दवा जोखिम की अवधि में अलग कर सकते है बस कई मापदंडों के कुछ नाम है । Fabry रोग के लिए हाल ही में प्रकाशित मेटा-विश्लेषण का प्रदर्शन किया कि एंजाइम गतिविधि रिकॉर्डिंग (के साथ और पीसी के बिना) transfected सेल मॉडल (उदा, HEK293, क्योंकि-7) मुख्यतः रोगी से प्राप्त परिणामों के अनुसार था व्युत्पंन कोशिकाओं ( ज्यादातर लिम्फोसाइटों या fibroblasts) सवाल के संबंध में, कि क्या एक उत्परिवर्तन पीसी के लिए उत्तरदाई है24। पूर्व रिपोर्ट रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं और अभिकर्मक मॉडल की तुलना सीधे प्रदर्शन किया है कि ओवर-एक्सप्रेशन सिस्टम निष्कर्ष13,14समझौता किए बिना रोगी कोशिकाओं में स्थिति को प्रतिबिंबित । इसलिए यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि, विशेष प्रोटोकॉल की परवाह किए बिना, अलग अलग लेखकों द्वारा प्राप्त परिणामों के विभिंन सेलुलर सिस्टम द्वारा नहीं बदला गया था, भले ही उत्तरदाता परिभाषा अलग जा सकता है । एक जवाब उत्परिवर्तन के लिए वर्तमान परिभाषा 20% सापेक्ष एंजाइम गतिविधि में वृद्धि और 5% पूर्ण एंजाइम गतिविधि वृद्धि ६० एच के लिए 20 µ एम DGJ के साथ मशीन के बाद जंगली प्रकार एंजाइम की तुलना में है । एक व्यापक डाटाबेस, FabryCEP, α के सैकड़ों के लिए अलग प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से प्राप्त परिणामों की तुलना परमिट-galactosidase म्यूटेंट25

    क्या इन मानदंडों DGJ और DNJ के नैदानिक लाभ की भविष्यवाणी करने के लिए पर्याप्त है अस्पष्ट रहता है, के बाद से रोगसूचक रोग को रोकने के लिए आवश्यक गतिविधि के स्तर विवादास्पद है । एक पूर्व अध्ययन का सुझाव दिया है कि अवशिष्ट गतिविधि के 10 से 15% प्रणाली ठीक से काम करने के लिए26के लिए पर्याप्त हो सकता है । हालांकि, DGJ, एक 1% गतिविधि वृद्धि के लिए एक चरण 2 नैदानिक अध्ययन से हाल ही में प्रकाशित रिपोर्ट में रोगी के लिए संभावित रूप से लाभप्रद माना जाता था, जब आधार रेखा गतिविधि सामांय से कम 1% था27। हाल के नैदानिक परिणाम सुझाव है कि रोगियों ≥ 20% सापेक्ष वृद्धि और ≥ के उत्तरदाता परिभाषा द्वारा पीसी के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमानित 3% पूर्ण जंगली प्रकार α की वृद्धि-galactosidase 10 HEK293H एम µ के साथ मशीन के बाद DGJ कोशिकाओं में एक गतिविधि वास्तव में व्युत्पंन रोग स्थिरीकरण या गुर्दे और हृदय के मापदंडों से भी सुधार के साथ नैदानिक लाभ28. जबकि DGJ पहले से ही Fabry रोग के लिए एक मोनोथेरापी के रूप में एफडीए और यूरोपीय आयोग द्वारा अनुमोदित किया गया है, इस तरह के DNJ के रूप में पीसी के पाठ्यक्रम और व्युत्पंन N-Butyl-DNJ-धूमधाम से रोग में अलग प्रतीत होता है । DNJ के साथ एक monotherapeutical दृष्टिकोण एक चरण द्वितीय नैदानिक रोगियों में से कुछ में गंभीर प्रतिकूल घटनाओं के कारण परीक्षण के दौरान समाप्त किया गया है29। हालांकि, अनुमोदित ईआरटी के साथ संयोजन में पीसी उपचार के साथ काफी बेहतर परिणाम दिखाया रोग सब्सट्रेट (ग्लाइकोजन) ईआरटी मोनोथेरापी30की तुलना में कमी करने के लिए संबंध है.

    हमारा सुझाव है कि प्रस्तुत किए गए दृष्टिकोण को अन्य LSDs और अन्य कंप्यूटरों जैसे गौचर, Krabbe, Tay-सैक्स/Sandhoff, और GM1 gangliosidosis के लिए बढ़ाया जा सकता है, लेकिन यह उन विशिष्ट मामलों में काम नहीं कर सकता है, जहां उदाहरण के लिए सिस्टम का सिग्नल/ देखभाल के लिए एक उपयुक्त कोशिका विघटन विधि का चयन करने के लिए एंजाइम गतिविधि निर्धारण के लिए एक सेल lysate तैयार करने के लिए लिया जाना चाहिए, क्योंकि lysis बफर में डिटर्जेंट के अलावा में glucocerebrosidase के रूप में झिल्ली से बंधे एंजाइम का संकेत हो सकता है गौचर रोग जबकि डिटर्जेंट की समान मात्रा अंय एंजाइमों को नुकसान पहुंचा सकता है । α-galactosidase के लिए, एक sonication-आधारित सेल व्यवधान विधि से बचना चाहिए ।

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    Disclosures

    लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

    Acknowledgments

    लेखक मैंडी Loebert और टीना Czajka को उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । भाषा संपादन मदद के लिए हम फ्लोरा लुओ (हार्वर्ड मेडिकल स्कूल, बोस्टन, एमए, यूएसए) को धन्यवाद देते हैं ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Material
    QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit  Stratagene, La Jolla, CA, USA #200522
    Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany n.a.
    Tryptone Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8952.1
    Yeast Extract Merck, Darmstadt, Germany 103,753
    Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,064,041,000
    Potasium chloride Merck, Darmstadt, Germany 1,049,360,500
    MgCl2 x 6H2O Merck, Darmstadt, Germany 1,058,330,250
    D (+)-Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 1,083,422,500
    Sodium Hydroxide Merck, Darmstadt, Germany 1,064,980,500
    Glycine Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3908.2
    Citric acid Carl Roth, Karlsruhe, Germany X863.3
    disodium hydrogen phosphate Merck, Darmstadt, Germany 1,065,860,500
    Sodium acetate Merck, Darmstadt, Germany 1,062,640,050
    Glacial acetic acid Sigma Aldrich, Munich, Germany A6283
    LB Agar Carl Roth, Karlsruhe, Germany X969.2
    LB Medium Carl Roth, Karlsruhe, Germany X968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit ZymoResearch, Freiburg, Germany D4020
    QIAfilter Plasmid Midi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12245
    HEK293H cell line Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11631-017 
    Dulbecco´s Modified Eagle Medium  Invitrogen, Karlsruhe, Germany 31966-047
    HyClone fetal bovine serum  GE Healthcare, South Logan, Utah, USA SV30160.03
    Penicillin/streptomycin Invitrogen, Karlsruhe, Germany 15140-122
    CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One VWR International GmbH, Hannover, Germany 82050-854
    Cell culture plates (24 well) Sarstedt, Nümbrecht, Germany 831,836
    Cellstar 96 well plate Greiner bio one, Frickenhausen, Germany 655185
    SafeSeal reaction tubes, 1,5mL  Sarstedt, Nümbrecht, Germany 72,706
    Lipofectamine 2000 Invitrogen, Karlsruhe, Germany 11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride  Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada D236500
    1-Deoxynojirimycin  Sigma Aldrich, Munich, Germany D9305
    PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium Biochrom, Berlin, Germany L 1825
    Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 25300054
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific, Braunschweig, Germany 23225
    4-Methylumbelliferone Sigma Aldrich, Munich, Germany M1381
    4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M7633
    4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside Sigma Aldrich, Munich, Germany M9766
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    incubator type T6 Heraeus Instruments, Hanau, Germany n.a.
    Luminous Plate Gr. 2 E Carl Roth, Karlsruhe, Germany P265.1
    3130 xl Genetic Analyzer  Applied Biosystems, Darmstadt, Germany n.a.
    GFL-3032 bacterial shaker GFL, Burgwedel, Germany  n.a.
    Avanti J-25 centrifuge Beckman/Coulter, Krefeld, Germany n.a.
    Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom n.a.
    water-jacket incubator  Binder, Tuttlingen, Germany n.a.
    Vortex Genie 1 touch mixer Scientific Industries, Bohemia, NY, USA n.a.
    Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge Hermle, Tuttlingen, Germany  n.a.
    LaboStar ultrapure water device Siemens, Berlin, Germany n.a.
    Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker Biosan, Riga, Latvia n.a.
    Tecan GENios Reader Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    HI 223 Microprocessor pH Meter HANNA Instruments, Arvore, Portugal n.a.
    CASY
    Cell Counter + Analyser System
    Model TT
    Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Magellan data analysis software v6.6 Tecan, Männedorf, Switzerland n.a.
    GraphPad Prism 5.04 GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA n.a.
    Microsoft Office 2010 Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA n.a.
    BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html n.a.
    Abbreviations
    frw = forward; rev = reverse
    n.a. = not applicable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    इन <em>विट्रो</em> एंजाइम माप Fabry और धूमधाम से रोग में औषधीय निगरानी जवाबदेही का परीक्षण करने के लिए
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    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).More

    Lukas, J., Knospe, A. M., Seemann, S., Citro, V., Cubellis, M. V., Rolfs, A. In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease. J. Vis. Exp. (130), e56550, doi:10.3791/56550 (2017).

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