Summary
再現性の高い、高速、かつ効率的に薬理学的シャペロンと呼ばれる「オーファン」薬の新規クラスのテスト前臨床をする需要があります。新規の薬理学的シャペロン薬と同様に、対象となる患者の画面に、高度に標準化、シンプルで汎用性の高い細胞培養技術を用いた試験を行った。
Abstract
複雑な臨床試験デザイン、コストが高い、低い患者数でリソソーム貯蔵障害 (Lsd) のようなまれなイネの病気を治療するために個人化された薬の使用に挑戦します。何百もの突然変異体の対立遺伝子は、Lsd のほとんどに関与しています。病気は重症度に応じて異なる臨床型を 2、3 に普通分類されます。さらに、遺伝子型の解析は臨床転帰を予測し、患者のケアに通知を助けることができます。そこで、クローン ファブリとポンペ病の突然変異を過剰発現する HEK293H 細胞に基づく単純な細胞培養の試金。似たようなアッセイは、ファブリー病の従順な変異の薬理学的シャペロン療法 (PCT) を識別するために臨床試験として最近導入されています。本稿では、PCT の対象患者を識別するファブリとポンペ病の allelic 変形の迅速な形質の評価を可能にする新規 pharmacochaperones の開発に役立つ可能性があります修正された細胞培養の試金について説明します。
Introduction
1 ダース ライソゾーム疾患 (Lsd) に関連する主な遺伝子の突然変異の結果として各種グリコシダーゼ機能不全があります。ファブリ (OMIM #301500)、ポンペ (OMIM #232300) 病、1,2,3が報告されている以上 500 と 200 のミスセンス変異で、それぞれ総突然変異数の約 60% に対応します。多数の新しい遺伝子の変形はまだ識別されている、多くの未知の意義。広範な生化学的研究で明らかにGLA遺伝子の完全な損失関数に-に特定の遺伝子がつながらない (OMIM * 300644) ファブリー病が熱力学的に支持された折りたたみ状態4 に到達する失敗に対応する酵素が発生.これは、結果、ER 保存、関数的な酵素の低下を引き起こす。同様の結論は、ポンペ病5を含む他の Lsd で描かれています。さらに、分子酵素変異株については、診断の6LSD の進行が突然変異の性質に基づいて個々 のプロセスであることを示唆している時に突然変異の臨床的な解釈を促進できます。したがって、従来通常 2、3 の異なる臨床型分類は臨床カウンセリングと治療方針の決定を合理化するために再評価されるべき。
酵素補充療法 (ERT) は両方の病気です。ERT はただし、脳や骨格筋などの影響を受ける組織/臓器の効力を制限されています。また、専門家レビュー チームは、その治療効果を損ないます免疫原性の応答を引き出すことができます。薬理学的シャペロン (Pc) は、いわゆる応答性遺伝子変異を有する患者のための魅力的な治療法代わりです。Pc は正しいタンパク質フォールディングと順番防ぐ小胞体 (ER) の保持と小胞体関連分解酵素の安定化のための分子足場として機能します。また、Pc は経口的に投与することができます、可能性のある血液脳関門を通過することができます。したがって、PCT は、特定の遺伝子を持つ患者を治療するためのより現実的なオプションかもしれません。Lsd で PC アプリケーションの広範なレビュー、Parenti7によって優秀なレビューを参照してください。
何百もの突然変異体の対立遺伝子を引き起こす病気の発見は、前臨床薬物検査に挑戦し、従順な患者個別化医療のアプローチのための単純な高速で、高度に標準化された評価が必要になります。LSD 遺伝子突然変異の有害な影響を評価するために、PCT の従順な患者を予測する候補者突然変異をテストするのには、高速かつ信頼性の高い酵素活性測定できる HEK293H 細胞で過剰発現の高い標準化されたシステムだった開発しました。同様の過剰発現システムは、ファブリとポンペ病 COS 78,9,10、11、HeLa 細胞12HEK293 のいずれかを使用して以前記載されている13 ,14,15,16糖加水分解遺伝子の細胞。
非常に同じような方法は「疾患の薬理学的シャペロン治療へ反応を予測する方法」として特許を取得されても17セルの関連性を示す文化システム臨床実践に統合されることができます。
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Protocol
1. 変異体 pcDNA3.1/GLA および pcDNA3.1/GAA 構造の作製
注: GLAおよびGAA塩基配列 (cd) のクローニングの戦略は、報告された以前15,18をされています。
- サイト指示された突然変異誘発を使用してサイト指示された突然変異誘発
- 使用参照シーケンス NM_000169.2 と NM_000152.4 GLAおよびGAAの遺伝子の突然変異誘発のためのテンプレートとしてそれぞれ。センスとアンチセンスのプライマーを個別に突然変異を導入する長さ中央それぞれのシーケンスの修正の 1 つを運ぶ商業プロバイダーによって合成高純度塩無料プライマー (25-37-mers) のセットがあります。無料プライマー設計ツールを使用してプライマー デザイン19をサポートします。
- 反応混合物を反応液の標準的条件と、製造元から提供された PCR 条件を使用します。
- ミックス 5 μ L 反応バッファー、10 x 10 の二重鎖テンプレート プラスミド (pcDNA3.1/GLA または pcDNA3.1/GAA) の ng 125 各プライマーの ng、提供 dNTP の混合物の 1 μ L、3 μ L の脱イオン水 (最終反応ボリュームの適切なボリュームで DMSO 試薬: 50 Μ L)。最後に、2.5 U の DNA ポリメラーゼを追加し、上下にピペッティングで混ぜます。ネガティブ コントロールとしてのプライマーのサンプルに沿って運ぶ。
- 次のプログラムを使用して PCR を開始: 1:95 ° C 1 分ステップ 50 2:95 ° C、s、ステップ 3時 60分 50 ° C s、ステップ 4:68 ° C で 8 分、18 回手順 2-4 を繰り返し、ステップ 5:68 ° C で 10 分間。
- PCR、 Dpnの 1 μ L を追加します私制限酵素 (10 U/μ L) とさらに 1 h の 37 ° C で反応、バイアルを孵化させなさい。
- 変換および目的のクローンのスクリーニング
- 製造元の推奨事項に従って ultracompetent 細胞の因数を変換します。使用 SOC 培地 (トリプトン 2% (w/v)、酵母エキス 0.5% (w/v)、塩化ナトリウム 10 mM KCl 2.5 mM、121 ° C で滅菌、MgCl2 10 および 20 の mM の最終濃度までブドウ糖の無菌ろ過ソリューションをそれぞれ追加) メーカーの代わりに媒体。手順の後 LB のサンプルの突然変異のプレート 250 μ L プレート含む 100 μ g/mL アンピシリンと 18 h の 37 ° C で孵化させなさい。
- 確実に形質転換体数 > 10 と反応の結果は少なくとも 3 倍多く植民地にプライマーなしコントロールの反応は、例えば、発光プレートを使用してコロニー カウントを容易にします。3 コロニーをピックアップし、流体培養基 LB 培地で一晩培養 3 mL を準備します。
- 次の日は標準的なキットでプラスミッドの準備を行い T7 を使用してシーケンス全体を分析 (5ʹ TAA TAC GAC TCA CTA タグ GG-3ʹ) 標準サンガー経由 (5ʹ タグ AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) bghr あるプライマーの配列。
- 分子生物学の適切なツールを使用して、シーケンスを分析します。望ましい突然変異が検出された場合、さらにシーケンス NM_000169.2 (α-ガラクトシダーゼ A) と比較して異常なしまたは NM_000152.4 (酸性 α-グルコシダーゼ) を見て、トランスフェクション グレード プラスミッドの浄化のためのクローンを選択します。
- 分光光度計で吸光度を測定することによって DNA の純度を決定します。
注: 許可の 260/280 吸光度比を持つプラスミドの純度をもたらす準備のみ > 1.8 細胞培養します。
2. HEK293H 細胞の培養
- 高グルコース (4.5 g/L) Dulbecco´s Modified イーグル培 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンの HEK293H 細胞を維持します。セルをおいて、5% CO2雰囲気下で 37 ° c の定温器を water-jacket。
- 80-90% の密度に細胞を養います。
- 培地を吸引し、生理食塩水 (PBS) Ca2 +と Mg2 +なしをバッファリングされるリン酸を使用してを洗ってください。
- 0.05% を追加することにより通路トリプシン-EDTA し 37 ° C、5% CO2で 5 分間インキュベートします。
- 恒久的な文化を維持するために新しい T75 フラスコに新鮮な媒体および種子内のセル 1:15 を分割します。以上 25 通路でセルを使用しないでください。
3. pcDNA3.1/GLA と pcDNA3.1/GAA プラスミド トランスフェクションと HEK293H 治療
- 24 時間、トランスフェクション前は、Ca2 +Mg2 +を持つ PBS で一度コート t75 フラスコ細胞培養用フラスコの HEK293H セルを洗浄します。収穫の 10% を 500 μ l 添加 DMEM 培を使用して 24 よく培養プレートの空洞中 0.05% トリプシン-EDTA 上記細胞と種子 1.5 x 105 FBS 抗生物質なし。
- 製造元のマニュアルによるとトランスフェクション プロトコルを実行します。通常、無血清 DMEM の 100 μ L に 1 μ g のプラスミド DNA とトランスフェクション試薬の 2.5 μ L の混合物を使用します。室温で 20 分間インキュベートし、その後伝の方法でセルに追加します。
- 37 °C/5% CO2で 4 時間の期間の後のトランスフェクション試薬を含む培地を取り除き、10% 新鮮な DMEM を 500 μ l 添加 FBS/1% ペニシリン/ストレプトマイシン。
注: この手順では、1-Deoxygalactonojirimycin 塩酸塩 (DGJ) または塩酸 1 ‐ デオキシノジリマイシン (DNJ) 可能性がありますに追加培意図した場所 (20 μ M の最終濃度を得るために 10 mM の水性原液を使用 DGJ、DNJ).新鮮な DGJ または DNJ は、プラスミド トランスフェクション後 42 h を追加しました。
4. 細胞収穫と α-ガラクトシダーゼ A または酸性 α-グルコシダーゼ活性の測定
- セル収穫
- 収穫の日、インキュベーターからセルを削除し、培地を吸引します。Ca2 +と Mg2 +を PBS で 2 回細胞を慎重に洗います。
注: DGJ と DNJ は、それぞれ α-ガラクトシダーゼの α-グルコシダーゼ阻害剤と残ったテストが無効になるために、この手順は重要です。 - セルの上に直接脱イオン水の 200 μ L を追加します。リンスのプレートから細胞と 1.5 mL の反応管にそれらを転送します。
- 収穫の日、インキュベーターからセルを削除し、培地を吸引します。Ca2 +と Mg2 +を PBS で 2 回細胞を慎重に洗います。
- 凍結融解による均質化
- 適切な泡ラックと 5 の渦にサンプルを置く s、換散をより効率的に。交互に 10 の液体窒素でサンプルを置く s と解凍が完了 (5 分) になるまで室温水のお風呂に。
- 5 回この手順を繰り返すし、10,000 × g で 5 分間のサンプルをスピンします。
- 各サンプルについては 40 μ L の脱イオン H2O を含む新鮮なチューブを準備し、10 μ L のサンプルを追加します。ボルテックスによって簡単にソリューションをミックスし、96 well プレート (各 3 通サンプル) の空洞に 10 μ L を転送します。脱イオン H2O 標準曲線を取得する次のように 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) 原液を希釈: 50 μ L H2O/50 μ L BSA;60 μ L H2O/40 μ L BSA;70 μ L H2O/30 μ L BSA;80 μ L H2O/20 μ L BSA;90 μ L H2O/10 μ L BSA;100 μ L H2o.
- BCA 試薬 200 μ L を追加することによって、反応を開始 (試薬 A と試薬 B は 50: 1 の比率で混合) し軌道シェーカー (300 の rpm) に若干の動揺の下で 37 ° C で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。560 で吸光度を測定プレート リーダーで nm。
注: サンプルは通常 1 μ L あたり 1.5 μ g タンパク質間含まれています。
- (Α-ガラクトシダーゼ A) の 0.05 または (酸性 α-グルコシダーゼ) の 0.5 μ g/μ L タンパク質ソリューションを取得する新鮮な 1.5 mL 反応管にピペットで移しなさい各サンプルの計算量を希釈します。渦 5 s をもう一度と、96 にこの希釈ピペット 10 μ L のサンプルはウェル プレート (重複の各サンプル)。
- それぞれの基質溶液 20 μ L を追加することで反応を開始します。
Α-ガラクトシダーゼ a: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-ガラクトピラノシド (4 MU gal) 0.06 M リン酸クエン酸バッファー pH 4.7 に。
酸性 α-グルコシダーゼの: 2 mM-メチルウンベリフェリルグリコシド α-d-グルコピラノシド (4-MU-glu) 0.025 M 酢酸ナトリウム, pH 4.0 で。 - 1 h 軌道シェーカー (300 の rpm) に若干の動揺の下で 37 ° C で暗闇の中での酵素反応を孵化させなさい。1.0 M、pH 10.5 調整グリシン-水酸化ナトリウム緩衝の 200 μ L 添加による反応を停止させます。
- 4-メチルウンベリフェロン (4 MU) 0.01 mg/mL の在庫からの標準曲線を次のとおり準備します。
100 μ L H2O/いいえ 4 MU;80 μ L H2O/20 μ L 4 MU;60 μ L H2O/40 μ L 4 MU;40 μ L H2O/60 μ L 4 MU;20 μ L H2O/80 μ L 4 MU;H2O/100 μ L 4 MU、96 ウェルに各希釈ピペット 10 μ L (重複) のプレート、ボリュームと pH を調整するために各ウェルに 1.0 M 水酸化ナトリウム、グリシン緩衝の 200 μ L を追加。 - 蛍光リーダーの酵素活性測定は適切なフィルター セットを搭載した、蛍光リーダー デバイスの適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。
注: 両方 4 マグカップ基板 4 mu α-ガラクトシダーゼ A または酸性 α-グルコシダーゼに露光中に削減されます。リリース 4 MU は、測定できる 360 と 465 nm 励起と放射の波長, マイクロ プレート蛍光リーダーを使用して螢光色素です。
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Representative Results
突然変異誘発の手順
GLA遺伝子突然変異誘発性を評価するために突然変異は次のカテゴリの 1 つに分類されました。突然変異を生成するこの方法では、 GLAの突然変異の約 66.5% が最初の試行で得られたことを明らかにしました。さらに 25% をわずかに変更された第 2 PCR 後取得でした。
カテゴリー 1: 突然変異誘発 PCR は最初の試行で効果的です。
カテゴリー 2: 最初の突然変異誘発 PCR (プレートなしの挿入変異に植民地) に失敗しました。同じプライマーを用いた繰り返し設定、アニール温度の上昇によって有効 68 ° C であった。
カテゴリー 3: 目的のクローンを生成するために引き受けられるべきより多くの努力を持っていた (例えば、通常 1 つまたは複数の新しい組のプライマー設計された)。
Α-ガラクトシダーゼ A と酸性 α-グルコシダーゼ酵素活性測定
異なる変異酵素の酵素活性は、PC の有無で一時的に transfected セルの前培養後記録されました。表 1は、3 α-ガラクトシダーゼ A および 3 酸性 α-グルコシダーゼの突然変異の結果を表します。基板回転率の絶対値 (1) として表示されます (nmol 4-MU * mg タンパク質-1* h-1) と野生型酵素に正規化 (2) 相対値として。両方の式が役に立つので基板の総売り上げ高は反応の効率を示しています、正規化された値を与えることが重要なシステムの感度は一方で突然変異の悪性の可能性をヒントとその一方で応用の PC 処理の効率化。実験の段階では、作業の流れを図 1に示します (技術的な理由により、導入された条件の下で例えば高速 HEK293H 細胞の増殖) 化合物と 60 h 潜伏期間を予定する、設定しました。10 μ M DGJ14おおよそ最大達成可能な血中濃度でサポートされている、現在のプロトコルは PC の応答性のスクリーニングを目的として合理的な濃度として、20 μ M を使用が記載されているにもかかわらず多数以前の4,20,21,22,23 を作品します。さらより高い血漿濃度に到達できること24と仮定されています。
図 1:の流れ、体外酵素活性の測定。(A)実験のタイムラインは、比較的少し手-上-時間が示された時点で必要な 90 h 細胞文化努力を示しています。(B)代表的なプラスミッドのベクトル pcDNA3.1 GLAおよびGAAの野生型 cd を含むが表示されます。GLAとGAAの野生型プラスミドとプラスミドを含む興味のそれぞれ挿入変異は一過性 transfect 24 の井戸のフォーマットでメッキ HEK293H 細胞に使用されました。それぞれの遺伝子産物を合成し、酵素処理、リソソーム輸送および PC アクションを許可するセルを許容する期間後、細胞は溶解しと蛍光プレート リーダーで測定、それぞれのソフトウェアを使用して分析します。C: HEK293H 細胞の細胞形態と成長状態は実験の時間にわたって表示されます。スケール バー 100 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 体外酵素活性 | |||||
| GLA | ネイティブ | 20 Μ M DGJ | |||
| 突然変異 (AA) | nmol 4 マグカップ gal/mg/時間 (平均) | % 平均 (±SD N) | nmol 4 マグカップ gal/mg/時間 (平均) | % 平均 (±SD N) | 意義 |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6、5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4、5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (± 8, 5)。 | 1437.5 | 16.3 (±1.3、5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8.8 (±1.1、5) | 3002.6 | 44.2 (±3.6、5) | **** |
| GAA | ネイティブ | 20 Μ M の DNJ | |||
| 突然変異 (AA) | nmol 4-マグカップ-グルタミン酸/mg/時間 (平均) | % 平均 (±SD N) | nmol 4-マグカップ-グルタミン酸/mg/時間 (平均) | % 平均 (±SD N) | 意義 |
| p.Y455F | 41.1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31.4 (±2.8、5) | *** |
| p.P545L | 65.7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166.5 | 16.7 (5 ± 1.5) | ** |
| p.L552P | 0.0 | 0.0 (± 2、5)。 | 104.3 | 10.4 (±1.4、5) | *** |
表 1: α-ガラクトシダーゼ A と酸性 α-グルコシダーゼの酵素活性します。テーブルは、3 α-ガラクトシダーゼ A と 3 Pc DGJ 有無 DNJ と酸性 α-グルコシダーゼ突然変異体の代表的な結果を示しています。HEK293H 細胞の内因性酵素活性の絶対酵素活性データが修正されました。内因性酵素活性を評価するには、セルは pcDNA3.1 の空のベクターを導入させた。値が 97.5 nmol 4-MU * mg タンパク質-1* h-1 α-ガラクトシダーゼ A と 41.6 nmol 4-MU * mg タンパク質-1* h-1酸性 α-グルコシダーゼ、それぞれ;酵素活性値は、実験に対応する、別の突然変異体間の相対値の偏差を説明するから野生型酵素に正規化されました。5 独立した細胞培養試験後 (N = 5)、それぞれは技術的な重複で実施、標準偏差がすることはできません > 平均の 15%。比 T 検定は、未処理と PC 処理の酵素の違いを計算に使用されました。
* p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.005、* * * p < 0.001
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Discussion
記載プロトコルは、代謝の遺伝性ライソゾーム病の酵素損傷評価のための強力な結果を提供します。この原稿は、議定書の改正発行以前15です。最も重要な変更を伴う逼迫 (すなわち、ベクター構築準備の過程で)、(すなわち、HEK293H 細胞のメンテナンス、トランスフェクション条件)、細胞培養のプロトコル、高の標準化結果の再現性に著しく貢献した実験繰り返し (少なくとも 5) の数です。完全に、両方のターゲット遺伝子は突然変異誘発のため簡単にアクセスされているし、突然変異の多様性は並列で組み立てることができます。HEK293H 細胞内の内因性酵素活性がごくわずか 1/50 (α-ガラクトシダーゼ A) と 1/20 (酸性 α-グルコシダーゼ) 過剰発現の野生型遺伝子のことを考慮した比較的高いシグナル/ノイズ比を実現しました。したがって、野生型と変異体酵素の優れた分解能があります。両酵素の活性測定法の総蛋白質量が異なるが適用されたことに注意してください (0.5 〜 5 μ g、それぞれ) 酸性 α-グルコシダーゼ活性が桁違いに α-ガラクトシダーゼ A のそれより低いため、
前述のように、分析パラメーターが多い物議を醸す、以来、多くの実験室はライソゾーム グリコシダーゼを調査する独自のアッセイを開発しています。多数のパラメーターのいくつかの名前にだけ細胞型、プラスミッドのベクトルのデザイン、栽培条件や薬曝露の期間システムが異なる場合します。ファブリー病の最近公開されたメタ分析が transfected セル モデル (例えばHEK293、COS 7) の酵素活動記録 (と PC なし) が主 (患者由来の細胞から得られた結果に基づき示した主にリンパ球や線維芽細胞) について、質問かどうか突然変異は PC24に対応します。以前の報告書患者由来細胞と遺伝子導入のモデルの直接比較を示した過剰発現システムが結論13,14を損なうことがなく患者細胞の状況を反映します。従って考えられる、特定のプロトコルに関係なく異なった著者によって得られた結果が変更されなかったこと別の携帯電話システムにもかかわらず、レスポンダーの定義は発散することができます。応答の突然変異のための現在の定義は 20% 相対酵素活動増加し 20 μ m DGJ 60 時間培養後の野生型酵素と比較して 5% 絶対酵素活動増加。包括的なデータベース、FabryCEP、α-ガラクトシダーゼの突然変異体の25の何百ものさまざまな実験的アプローチによって得られた結果との比較を許可します。
これらの条件が DGJ、DNJ の臨床的有用性を予測するのに十分であるかどうかは不明で、症候性疾患を防ぐために必要な活動のレベルが物議を醸す。元の研究は、残存活性の 10 ~ 15% 可能性があります26正常に動作するシステムのための十分なことを示唆しました。ただし、DGJ フェーズ 2 臨床研究の最近公開された報告では、アクティビティ 1% 増加と判断された潜在的に有益な患者は、ベースライン活性は通常27の 1% 未満であった場合。最近の臨床結果は 10 μ M と孵化後 HEK293H 細胞における活性 ≥20% の相対的な増加と野生型 α-ガラクトシダーゼの 3% の絶対増加のレスポンダー定義して Pc に応答する予想される症例 DGJ 実際に派生したことを示唆しています。臨床疾患の安定化と腎臓と心臓のパラメーター28も改善。DGJ がファブリー病に対する単独療法として FDA と欧州委員会によって既に承認されて、一方、DNJ やポンペ病の誘導体の N-ブチル-DNJ など Pc のコースは異なるように見えます。DNJ と monotherapeutical のアプローチが患者29のいくつかの深刻な有害事象による第 II 相臨床試験中に終了しました。ただし、承認された専門家との組み合わせで PC 処理は、ERT 療法30病基板 (グリコーゲン) 減に関して大幅に改善の結果を示した。
私達は他の Lsd と GM1 ガングリオシドーシス、テイ-サックス/サンドホフ、クラッベ病など他の Pc に提示されたアプローチを拡張できますが、これは特定の場合、たとえばシステムの信号対雑音比が十分働かないかもしれない提案します。換散バッファーへの界面活性剤の添加は膜結合酵素でグルコセレブロシダーゼなどの示すかもしれないので酵素活性測定用セル lysate を準備する適切なセルの中断方法を選択には注意が必要似たような洗剤量、ゴーシェ病は他の酵素に害を与えます。Α-ガラクトシダーゼ A の超音波処理に基づく細胞破壊方法は避けてください。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、優れたテクニカル サポートのマンディ Loebert とティナの Czajka を認めたいと思います。編集のヘルプ言語ありがとうフローラ羅 (ハーバード大学医学部、ボストン、マサチューセッツ州、米国)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
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