Summary
Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.
Abstract
El uso de la medicina personalizada para tratar enfermedades monogénicas raras como trastornos de depósito lisosomal (LSDs) es desafiado por diseños de ensayos clínicos, altos costos y bajo número de pacientes. Cientos de alelos del mutante están implicados en la mayoría de los LSDs. Las enfermedades se clasifican típicamente en 2 a 3 diferentes tipos clínicos según la gravedad. Por otra parte, la caracterización molecular del genotipo puede ayudar a predecir los resultados clínicos e informar a la atención de los pacientes. Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo de cultivo de célula simple basado en HEK293H las células con heterologously sobreexpresión las mutaciones identificadas en la enfermedad de Fabry y Pompe. Un análisis similar se ha introducido recientemente como prueba preclínica para identificar mutaciones susceptibles de terapia farmacológica de acompañante (PCT) en la enfermedad de Fabry. Este manuscrito describe un ensayo de cultivo de células modificadas que permiten una rápida evaluación fenotípica de variantes alélicas en la enfermedad de Fabry y Pompe a identificar a los pacientes elegibles para el PCT y puede ayudar en el desarrollo de nuevos pharmacochaperones.
Introduction
Hay más de una docena trastornos de lysosomal del almacenaje (LSDs) relacionados con la disfunción glucosidasa como resultado de mutaciones en el gen primario. Fabry (OMIM #301500) y la enfermedad de Pompe (OMIM #232300), más de 500 y 200 mutaciones sin sentido ha informado de1,2,3 , respectivamente, que corresponde a cerca del 60% de la cuenta total mutación. Numerosas nuevas variantes de genes todavía están siendo identificadas, muchos de los cuales tienen desconocido significado. Estudios bioquímicos revelaron que ciertos genotipos no conducen a una pérdida de función completa del gen GLA (OMIM * 300644) en la enfermedad de Fabry, pero hacer que la enzima correspondiente para no llegar a un estado plegado termodinámicamente favorecido4 . Esto resulta en retención de ER y degradación prematura de la enzima funcional de lo contrario. Conclusiones similares han sido elaborados en otras LSDs como Pompe enfermedad5. Por otra parte, la caracterización molecular de las variantes de la enzima puede facilitar la interpretación clínica de las mutaciones en el momento del diagnóstico6, sugiriendo que la progresión de la LSD es un proceso individual basado en la naturaleza de la mutación. Por lo tanto, la clasificación convencional en diferentes tipos clínicos típicamente de 2 a 3 debe ser reevaluada para optimizar el asesoramiento clínico y decisiones terapéuticas.
La terapia de reemplazo de la enzima (ERT) está disponible para ambas enfermedades. ERT, sin embargo, ha limitado eficacia en tejidos/órganos afectados como cerebro y músculo esquelético. Además, ERT puede provocar una respuesta inmunogénica que ponga en peligro sus beneficios terapéuticos. Chaperonas farmacológicas (PC) son una alternativa de tratamiento atractiva para los pacientes con mutaciones sensibles supuestos. PC sirve como un andamio molecular para el plegamiento de la proteína correcta y estabilización que a su vez impide la retención del retículo endoplásmico (ER) y ER-asociados de degradación de la enzima. Además, el PC puede administrarse por vía oral y es potencialmente capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, la PCT puede ser una opción más viable para el tratamiento de pacientes con ciertos genotipos. Una extensa revisión sobre la aplicación de PC en LSDs, consulte la excelente revisión por Parenti7.
El descubrimiento de cientos de enfermedades que causan alelos del mutante desafía a pruebas de drogas clínico previo y requiere una evaluación sencilla, rápida y altamente estandarizada de pacientes susceptibles de un enfoque de la medicina personalizada. Con el fin de evaluar los efectos perjudiciales de las mutaciones de gene de LSD y probar mutaciones del candidato para predecir a pacientes susceptibles para el PCT, era un sistema altamente estandarizados sobreexpresión en células HEK293H que permite la medición de la actividad enzimática rápida y fiable desarrollado. Sistemas de expresión similares se han descrito previamente para la enfermedad de Fabry y Pompe con COS-78,9,10,11, HeLa células12o HEK29313 ,14,15,16 células para el gen de la glucosidasa.
Un método muy similar incluso ha sido patentado como "Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico acompañante de enfermedades"17 que indica la relevancia de una célula sistema capaz de integrarse a la práctica clínica de la cultura.
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Protocol
1. preparación del mutante pcDNA3.1/GLA y pcDNA3.1/GAA construcciones
Nota: Las estrategias de clonación de GLA y GAA codificación secuencias (cds) han sido reportados de15,anterior18.
- Mutagénesis sitio-dirigida mediante mutagénesis sitio-dirigida
- Uso la referencia de las secuencias NM_000169.2 y NM_000152.4 como plantillas para la mutagénesis de los genes GLA y GAA , respectivamente. Tienen un conjunto de sal iniciadores libres de alta pureza (25-37-mers) sintetizada por un proveedor comercial, con iniciadores sentido y antisentido llevando una de las modificaciones de la secuencia respectiva central a su longitud para presentar individualmente la mutación. Utilice la herramienta de diseño de la cartilla libre para apoyar el primer diseño19.
- Para la mezcla de reacción, uso las condiciones estándar para la solución de reacción y condiciones PCR suministradas por el fabricante.
- Mezcla 5 μl de 10 x buffer de reacción, 10 ng de plásmido de plantilla doble cadena DNA pcDNA3.1/GLA o pcDNA3.1/GAA, 125 ng de cada primer, 1 μl de la mezcla de dNTP proporcionado, 3 μl de reactivo de DMSO en un volumen adecuado de agua desionizada (volumen de reacción final : 50 ΜL). Por último, añadir 2,5 U de ADN polimerasa y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Como control negativo, llevan a lo largo de una muestra no-primer.
- Iniciar la polimerización en cadena usando el siguiente programa: paso 1: 95 ° C por 1 min, paso 2: 95 ° C durante 50 s, paso 3: 60 ° C durante 50 s, paso 4: 68 ° C durante 8 min, repita el paso 2-4 18 veces y paso 5: 68 ° C durante 10 minutos.
- Tras la PCR, añadir 1 μl de la DpnI enzima de la restricción (10 U/μL) y más Incube el frasco de reacción a 37 ° C durante 1 hora.
- Transformación y proyección para el clon deseado
- Transformar una alícuota de células ultracompetent con arreglo a las recomendaciones del fabricante. Medio SOC de uso (triptona 2% (w/v), levadura Extracto de 0.5% (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, esterilizar a 121 ° C y luego agregar soluciones de filtrado estéril de MgCl2 y glucosa hasta concentraciones finales de 10 y 20 mM, respectivamente) en lugar del fabricante medio. Después del procedimiento, placa 250 μl de la mutagénesis de muestra en un LB de la placa que contiene ampicilina 100 de μg/mL e incubar a 37 ° C por 18 h.
- Asegurar que el número de transformantes es > 10 y la reacción produce al menos tres veces más colonias como la reacción no-primer control, por ejemplo, usando una placa luminosa para facilitar conteo de colonias. Luego escoger 3 colonias y preparar 3 mL culturas durante la noche en medio LB caldo.
- Al día siguiente, llevar a cabo la preparación de plásmido con un kit estándar y analizar toda la secuencia utilizando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) y cartillas de BGHr (TCG CAG AGG-3ʹ del GCA 5ʹ-TAG de AAG) vía estándar Sanger secuenciación.
- Utilice una herramienta de biología molecular adecuado para analizar la secuencia. Cuando se detecta la mutación deseada y no más la secuencia de anormalidad en comparación con el NM_000169.2 (α-galactosidasa A) o NM_000152.4 (α-glucosidasa ácida) aparece, seleccione el clon para la purificación del plásmido transfección-grado.
- Determine la pureza de la DNA midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro.
Nota: Deje que sólo los preparados que producen una pureza de plásmido con una relación de absorbancia 260/280 de > experimentos de la cultura de 1.8 para la célula.
2. cultivo de células de HEK293H
- Mantener las células de la HEK293H en glucosa alta (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina. Mantener las células una incubadora a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO2 de water-jacket.
- Cultivar las células a una densidad de 80-90%.
- Aspire el medio y lavar una vez utilizando fosfato tampón salino (PBS) sin Ca2 + y Mg2 +.
- Paso mediante la adición de 0.05% tripsina-EDTA e incubar 5 min a 37 ° C y 5% CO2.
- Dividir las células 1:15 en medio fresco y semilla en un frasco de T75 nueva para mantener la cultura permanente. No utilice las células con más de 25 pasos.
3. pcDNA3.1/GLA y pcDNA3.1/GAA transfección del plásmido y tratamiento de HEK293H
- 24 h antes de la transfección, lave las células HEK293H en un frasco de cultivo celular T75 una vez con PBS con Ca2 +, Mg2 +. Cosecha de las células con el 0,05% tripsina-EDTA como indicado arriba y semilla 1.5 x 105 células en las cavidades de una placa de 24 bien cultura con 500 μl DMEM suplementado con 10% SBF sin antibióticos.
- Llevar a cabo un protocolo de la transfección según el manual del fabricante. Normalmente, utilizar una mezcla de 1 μg de DNA plasmídico y 2,5 μl de reactivo de transfección en 100 μl de DMEM libre de suero. Incubar por 20 min a temperatura ambiente y agregar a las células de una manera drop-wise después de eso.
- Retire el medio que contiene el reactivo de transfección después de un período de 4 h a 37 °C/5% CO2 y agregar 500 μl de DMEM fresco con 10% FBS / 1% de penicilina/estreptomicina.
Nota: Durante este paso, clorhidrato de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) o clorhidrato de 1-Desoxinojirimicina (DNJ) puede ser añadido al medio de cultivo donde la intención (utilizar una solución acuosa de 10 mM para obtener una concentración final de 20 μm DGJ y DNJ ). 42 h se agregó fresco DGJ o DNJ después de transfección del plásmido.
4. la célula cosecha y α-galactosidasa A o medición de la actividad de α-glucosidasa ácida
- Cosecha de células
- En el día de la cosecha, eliminar las células de la incubadora y aspirar el medio. Lave cuidadosamente las células 2 veces con PBS con Ca2 + y Mg2 +.
Nota: Este paso es fundamental porque DGJ y DNJ son potentes inhibidores de la α-galactosidasa y α-glucosidasa, respectivamente, y ninguna sobra invalidaría la prueba. - Añadir 200 μL de agua desionizada directamente sobre las células. Enjuague las células de la placa y transferirlas a un tubo de reacción de 1,5 mL.
- En el día de la cosecha, eliminar las células de la incubadora y aspirar el medio. Lave cuidadosamente las células 2 veces con PBS con Ca2 + y Mg2 +.
- Homogeneización por congelación y descongelación
- Poner las muestras en un bastidor espuma adecuada y vortex durante 5 s para hacer más eficiente la lisis. Poner las muestras que se alternan en nitrógeno líquido durante 10 s y en un baño de temperatura ambiente hasta la descongelación completa (5 min).
- Repetir este procedimiento 5 veces y luego centrifugar las muestras durante 5 min a 10.000 x g.
- Preparar un fresco tubo para cada muestra con 40 μl de desionizada H2O y añadir 10 μl de muestra. Mezcle la solución con un vórtex brevemente y transferir 10 μL en una cavidad de una placa bien 96 (cada muestra por triplicado). Diluir una solución stock de albúmina de suero bovino (BSA) de 2 mg/mL en desionizada de H2O como se indica a continuación para obtener una curva estándar: 50 μl de H2O/50 μl BSA; 60 μL H2O/40 μl BSA; 70 μl H2O/30 μL BSA; 80 μl H2O/20 μl BSA; 90 μl H2O/10 μl BSA; 100 μl de H2O.
- Iniciar la reacción mediante la adición de 200 μL de reactivo BCA (reactivo A y reactivo B mezclan en una proporción de 50: 1) e incubar durante 1 h en la oscuridad a 37 ° C bajo agitación leve en un agitador orbital (300 rpm). Medir la absorbancia a 560 nm en un lector de placas.
Nota: Las muestras contienen típicamente entre 1 y 1,5 μg de proteína por μl.
- Diluir la cantidad calculada de cada muestra y pipetear en tubos de reacción de 1,5 mL fresco para obtener 0.05 (para α-galactosidasa A) o 0.5 (para α-glucosidasa ácida) μg proteína/μl soluciones. Vórtice de las muestras por 5 s otra vez y pipetee 10 μl de esta dilución en un 96 placa bien (cada muestra).
- Iniciar la reacción añadiendo 20 μl de la solución sustrato respectivo:
De α-galactosidasa A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopiranosida (4-MU-gal) en 0,06 M de tampón citrato fosfato, pH 4.7.
Para el ácido α-glucosidasa: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) en acetato de sodio de 0,025 M de pH 4.0. - Incubar las reacciones enzimáticas para 1 h en la oscuridad a 37 ° C bajo agitación leve en un agitador orbital (300 rpm). Terminar la reacción por la adición de 200 μL de tampón de glicina-NaOH ajustado pH 10.5 de 1,0 M.
- Preparar una curva estándar de 4-methylumbelliferone (4-MU) de un stock de 0,01 mg/mL como sigue:
100 μl de H2O / no 4-MU; 80 μl de H2O 20 μl 4-MU; 60 μL de H2O 40 μl 4-MU; 40 μl de H2O / 60 μL 4-MU; 20 μl de H2O / 80 μl 4-MU; no de H2O 100 μl 4-MU, pipetee 10 μl de cada dilución en el 96 pozo de la placa (por duplicado) y añada 200 μL del buffer de glicina-NaOH de 1,0 M a cada pocillo para ajustar el volumen y el pH. - Medida la actividad enzimática en un lector de fluorescencia equipado con el sistema de filtro apropiado y analizar los datos utilizando el software apropiado para el dispositivo de lector de fluorescencia.
Nota: Ambos sustratos 4 taza se reducen a 4 MU durante la exposición a la α-galactosidasa A o α-glucosidasa ácida. Publicado 4-MU es un fluorocromo, que puede ser medida en 360 y 465 nm como las longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente, usando un lector de fluorescencia de microplacas.
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Representative Results
El procedimiento de mutagénesis
Para evaluar la eficiencia de mutagénesis GLA gen, las mutaciones se clasificaron en una de las siguientes categorías. Este enfoque para generar mutaciones reveló que cerca de 66,5% de las mutaciones de GLA se obtuvieron en el primer intento. Un 25% podría obtenerse después de un PCR de segunda ligeramente modificada.
Categoría 1: La mutagénesis PCR fue efectivo en el primer intento.
Categoría 2: Primer mutagénesis PCR fracasado (no hay colonias en la placa, ninguna mutación insertada); repetición con el mismo primer set al aumentar la temperatura de recocido hasta 68 ° C fue eficaz.
Categoría 3: Más esfuerzo tuvo que llevarse a cabo para producir el clon deseado (por ejemplo, normalmente uno o varios nuevos conjuntos de iniciadores fueron diseñados).
Α-galactosidasa A y la medición de actividad de enzima α-glucosidasa ácida
La actividad enzimática de las enzimas mutantes diferentes se registró después de la incubación previa de las células transfected transitorio en la presencia o ausencia de un PC. Tabla 1 se refiere a los resultados de 3 mutaciones de la α-glucosidasa ácida y 3 α-galactosidasa A. Datos se muestran como (1) valores absolutos para el volumen de sustrato (nmol 4-MU * mg proteína-1* h-1) y (2) relativos valores normalizados a la enzima de tipo salvaje. Ambas expresiones son útiles, ya que el volumen de sustrato total ilustra la eficacia de la reacción y la sensibilidad del sistema, mientras que los valores normalizados pueden dar importantes consejos para la probabilidad de malignidad de la mutación en una mano y la eficacia del tratamiento aplicado de PC en otra parte. Para la fase experimental, el flujo de trabajo representado en la figura 1 se estableció, que programar un período de incubación de 60 h con el compuesto (debido a razones técnicas, por ejemplo, rápido HEK293H crecimiento de la célula en las condiciones introducidas). Aunque se ha dicho que 10 μm fue la concentración del plasma alcanzable máximo aproximado para DGJ14, el protocolo actual utiliza 20 μm como una concentración razonable con el fin de una investigación de respuesta PC apoyada por numerosos antes trabaja4,20,21,22,23. Por otra parte, se ha postulado que niveles más altos de plasma pueden llegar a24.
Figura 1 : Flujo de trabajo la en vitro medición de la actividad enzimática. (A) la línea de tiempo del experimento muestra un esfuerzo de cultura celular 90 h con relativamente poco las manos-en-tiempo requerida en los puntos de tiempo indicado. (B) se muestran representante plásmido pcDNA3.1 de vectores que contienen los cds de tipo salvaje de GLA y GAA . Plásmidos de tipo salvaje GLA y GAA y plásmidos incluyendo la respectiva mutación insertada de interés fueron utilizados para transitoriamente transfectar las células HEK293H plateadas en formato bien 24. Después de un período para permitir que las células sintetizar los productos del gen respectivo y permitir el procesamiento de la enzima, transporte lisosomal y acción de PC, las células fueron sometidas a lisis y miden en un lector de fluorescencia y analizan usando el software respectivo. C: celda estado morfología y crecimiento de las células HEK293H se muestran durante todo el curso del tiempo del experimento. Barras de escala = 100 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| actividad enzimática in vitro | |||||
| GLA | nativo | 20 ΜM DGJ | |||
| mutación (AA) | nmol/mg/4-taza-gal h (medio) | % media (±SD, N) | nmol/mg/4-taza-gal h (medio) | % media (±SD, N) | significado |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16.3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8.8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44.2 (±3.6, 5) | **** |
| GAA | nativo | 20 ΜM DNJ | |||
| mutación (AA) | nmol/mg/4-taza-glu h (medio) | % media (±SD, N) | nmol/mg/4-taza-glu h (medio) | % media (±SD, N) | significado |
| p.Y455F | 41.1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31.4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65.7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166.5 | 16.7 (±1. 5, 5) | ** |
| p.L552P | 0.0 | 0.0 (±. 2, 5) | 104.3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Tabla 1: actividad enzimática de α-galactosidasa A y α-glucosidasa ácida. La tabla muestra resultados representativos de 3 α-galactosidasa A y 3 mutantes de la α-glucosidasa ácida con y sin la PC DGJ o DNJ. Datos de la actividad enzimática absoluta fue corregidos para la actividad enzimática endógena de las células HEK293H. Para evaluar la actividad enzimática endógena, las células fueron transfectadas con un vector vacío pcDNA3.1. Los valores fueron nmol 97,5 4-MU * mg proteína-1* h-1 para α-galactosidasa A y 41,6 nmol 4-MU * mg proteína-1* h-1 para α-glucosidasa ácida, respectivamente; valores de actividad enzimática se normalizaron a la enzima de tipo salvaje de experimentos correspondientes, lo que explica las desviaciones de los valores relativos entre los diferentes mutantes.Después de 5 experimentos de cultivo de células independientes (N = 5), cada uno realizado en técnicas duplicados, la desviación estándar no debe ser > 15% de la media. Relación de pruebas T se utilizaron para calcular la diferencia entre enzima no tratada y tratados con PC.
* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005, *** p < 0.001
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Discussion
El protocolo descrito en el presente documento ofrece resultados robustos para la evaluación de daños de la enzima en enfermedades lisosomales hereditarias del metabolismo. Este manuscrito es que una enmienda al protocolo publicado anterior15. Las modificaciones más importantes implican rigor (es decir, en el proceso de preparación de construcción de vector mutante), normalización del Protocolo de la cultura de célula (es decir, las condiciones de mantenimiento y transfección de la célula HEK293H) y el número de repeticiones experimentales (menos 5), que contribuyeron altamente a la reproducibilidad de los resultados. En conjunto, ambos genes de la blanco han sido accesibles para mutagénesis y una multiplicidad de mutaciones puede ser montada en paralelo. Se logró una relación señal/ruido relativamente alta Considerando que la actividad de la enzima endógena dentro de las células de HEK293H era un insignificante 1/50 (α-galactosidasa A) y 1/20 (α-glucosidasa ácida) del gen de tipo salvaje sobreexpresados. Por lo tanto, es una excelente resolución entre el tipo salvaje y enzima del mutante. Cabe señalar que una cantidad diferente de la proteína total se aplicó para el análisis de la actividad de ambas enzimas (0.5 a 5 μg, respectivamente), porque la actividad de la α-glucosidasa ácida era un orden de magnitud menor que la de la α-galactosidasa A.
Como se ha dicho, parámetros de ensayo son a menudo polémicos, ya que muchos laboratorios han desarrollado sus propios ensayos para investigar glicosidasas lysosomal. Los sistemas pueden diferir en el tipo de células, plásmido-vector diseño, condiciones de cultivo y período de exposición de la droga sólo para nombrar algunos de los numerosos parámetros. Un metaanálisis recientemente publicado para la enfermedad de Fabry demostraron que grabaciones de actividad enzimática (con y sin PC) de los modelos de células transfected (p. ej., HEK293, COS-7) fue en gran medida según los resultados obtenidos de las células derivadas de paciente ( sobre todo los linfocitos o fibroblastos) con respecto a la pregunta, si una mutación es sensible a la PC24. Informes anteriores directamente comparando modelos de transfección y células derivadas del paciente demostraron que los sistemas de expresión reflejan la situación en células del paciente sin comprometer la conclusión13,14. Por lo tanto se deduce que, sin importar el protocolo particular, los resultados obtenidos por diversos autores no fue cambiado por los diferentes sistemas celulares, a pesar de las definiciones de respuesta pueden ser divergentes. La definición actual para una mutación respondieron a esta pregunta es aumento de actividad del enzima relativa de 20% y aumento de actividad enzimática absoluta 5% comparado con la enzima de tipo salvaje tras la incubación con 20 μm DGJ de 60 h. Una base de datos completa, FabryCEP, permite la comparación de los resultados obtenidos por diferentes aproximaciones experimentales para cientos de α-galactosidasa mutantes25.
Si estos criterios son suficientes para predecir los beneficios clínicos de la DGJ y DNJ sigue siendo confusa, puesto que el nivel de actividad necesario para prevenir la enfermedad sintomática es controvertido. Un estudio anterior sugirió que 10 a 15% de actividad residual podría ser suficiente para que el sistema funcione correctamente26. Sin embargo, en un informe publicado recientemente de un estudio clínico de fase 2 para DGJ, un aumento de 1% de actividad se consideró potencialmente beneficioso para el paciente, cuando la actividad de base era menos del 1% de normal27. Los resultados clínicos recientes sugieren que pacientes previstos para responder a la PC por la definición de respondedor de ≥20% relativo y ≥ 3% absoluta de tipo salvaje α-galactosidasa una actividad en las células de HEK293H después de la incubación con el μm 10 DGJ realmente derivados beneficio clínico con estabilización de la enfermedad o incluso mejoría de parámetros renales y cardíacos28. Considerando que el DGJ ya ha sido aprobado por la FDA y la Comisión Europea como monoterapia para la enfermedad de Fabry, el curso de PC como DNJ y el derivado N-Butil-DNJ en la enfermedad de Pompe parece ser diferente. Un enfoque monotherapeutical con la DNJ ha cancelado durante un ensayo clínico de fase II debido a eventos adversos graves en algunos de los pacientes29. Sin embargo, el tratamiento PC en combinación con Tre aprobado mostró resultados significativamente mejorados con respecto a la reducción de sustrato (glucógeno) de enfermedad en comparación con la monoterapia ERT30.
Sugerimos que el método presentado puede ampliarse a otros LSDs y otro PC como Gaucher, Krabbe, enfermedad de Tay-Sachs/Sandhoff, gangliosidosis GM1, pero esto no podría funcionar en casos específicos, donde por ejemplo la relación señal/ruido del sistema es insuficiente. Debe tenerse cuidado para seleccionar un método de interrupción celular adecuado para preparar un lisado de células para la determinación de la actividad del enzima, debido a la adición de detergentes en el búfer de lisis puede ser indicativa de enzimas de membrana como glucocerebrosidasa en La enfermedad de Gaucher y cantidades similares de detergente puede dañar otras enzimas. De α-galactosidasa A, debe evitarse un método de interrupción de la célula base de sonicación.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer la Loebert Mandy y Tina Czajka excelente soporte técnico. Agradecemos Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) lengua ayuda de edición.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
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