Summary
Det finns en efterfrågan att göra prekliniska test för en ny klass av ”särläkemedel” kallas farmakologiska chaperones reproducerbara, snabb och effektiv. Vi utvecklat en enkel, mycket standardiserad och mångsidig cell kultur-baserad analys till skärmen för kvalificerade patienter samt nya farmakologiska förkläde droger.
Abstract
Användning av personlig medicin för behandling av sällsynta monogena sjukdomar som lysosomala lagring sjukdomar (LSDs) utmanas av komplexa kliniska prov konstruktioner, höga kostnader och låg Patientantalet. Hundratals muterade alleler är inblandade i de flesta av LSDs. Sjukdomarna indelas normalt i 2 till 3 olika kliniska typer enligt allvarlighetsgrad. Molekylär karakterisering av genotyp kan dessutom hjälpa förutsäga kliniska resultat och informera patienten vård. Därför utvecklade vi en enkel cell kultur analys utifrån HEK293H celler som heterologously över uttrycker de mutationer som identifierats i Fabry och Pompes sjukdom. En liknande analys har nyligen införts som ett prekliniska test för att identifiera mottagliga mutationer för farmakologiska förkläde Therapy (PCT) i Fabrys sjukdom. Detta manuskript beskriver ett test av ändrade cell-kultur som möjliggör snabb fenotypiska bedömning av alleliska varianter i Fabry och Pompes sjukdom att identifiera berättigade patienter för PCT och får stöd i utvecklingen av nya pharmacochaperones.
Introduction
Det finns över ett dussin lysosomala lagring sjukdomar (LSDs) relaterade till glycosidase dysfunktion till följd av primära genmutationer. Fabry (OMIM #301500) och Pompe (OMIM #232300) sjukdom, mer än 500 och 200 missense mutationer1,2,3 har rapporterats, respektive, som motsvarar till omkring 60% av den totala mutation räkningen. Många nya genvarianter är fortfarande identifieras, varav många har okänd betydelse. Omfattande biokemiska studier visat att vissa genotyper inte leder till en fullständig förlust-av-funktion av GLA -genen (OMIM * 300644) i Fabrys sjukdom, men orsakar motsvarande enzymet misslyckas att nå en thermodynamically gynnade fällbara tillstånd4 . Detta resulterar i ER retention och tidig nedbrytning av enzymet annars funktionell. Liknande slutsatser har dragits i andra LSDs inklusive Pompes sjukdom5. Molekylär karakterisering av enzymet varianter kan dessutom underlätta klinisk tolkning av mutationerna vid tidpunkten för diagnos6, tyder på att LSD progression är en individuell process som baserat på vilken typ av mutation. Konventionella klassifikationen in i normalt 2 till 3 olika kliniska typer bör därför omprövas för att effektivisera klinisk rådgivning och terapeutiska beslut.
Enzym ersättningsterapi (ERT) är tillgänglig för båda sjukdomarna. ERT, men har begränsad effekt hos drabbade vävnader/organ som hjärnan och skelettmuskulaturen. Dessutom kan ERT framkalla ett immunogent svar som äventyrar dess terapeutiska fördelar. Farmakologiska Chaperones (st) är ett attraktivt behandlingsalternativ för patienter med så kallad responsiv mutationer. Datorer fungera som en molekylär byggnadsställning för rätt proteinveckning och stabilisering som i sin tur förhindrar endoplasmatiska nätverket (ER) lagring och ER-associerade nedbrytning av enzymet. Dessutom datorer kan administreras oralt och kan potentiellt passera blod-hjärnbarriären. PCT kan därför ett mer lönsamt alternativ för behandling av patienter med vissa genotyper. För en omfattande översyn på PC-program i LSDs, se den utmärkt recension av Parenti7.
Upptäckten av hundratals sjukdom som orsakar muterade alleler utmanar prekliniska drogtester och kräver en enkel, snabb och mycket standardiserade bedömning av mottagliga patienter en personlig medicin strategi. För att bedöma de skadliga effekterna av LSD genmutationer och att testa kandidaten mutationer att förutsäga mottagliga patienter för PCT, var ett högt standardiserade över uttryck system i HEK293H celler som möjliggör snabb och pålitlig enzym aktivitet mätning utvecklat. Liknande över uttryck system har beskrivits tidigare för Fabry och Pompes sjukdom med antingen COS-78,9,10,11, HeLa celler12eller HEK29313 ,14,15,16 celler för glycosidase genen.
En mycket liknande metod har även patenterats som en ”metod att förutsäga farmakologiska förkläde behandlingssvaret av sjukdomar”17 som visar betydelsen av en cell kultur system som kan integreras i klinisk praxis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Mutant pcDNA3.1/GLA och pcDNA3.1/GAA konstruktioner
Obs: De kloning strategierna för GLA och GAA kodande sekvenser (cds) har varit rapporterade tidigare15,18.
- Webbplats riktad mutagenes med webbplats riktad mutagenes
- Använd referensen sekvenser NM_000169.2 och NM_000152.4 som mallar för mutagenicitet av GLA och GAA gener, respektive. Har en uppsättning av hög renhet salt gratis primers (25-37-mers) syntetiseras av en kommersiell leverantör, med förnuft och antisense grundfärg som bär en av respektive sekvens ändringar central till deras längd individuellt införa mutationen. Använd verktyget gratis primer design för att stödja primer design19.
- För reaktionsblandningen, använda de standard villkor för reaktion lösningen och PCR som tillhandahålls av tillverkaren.
- Blanda 5 µL 10 x reaktion buffert, 10 ng av mall för dubbelsträngat plasmid DNA (pcDNA3.1/GLA eller pcDNA3.1/GAA), 125 ng varje grundfärg, 1 µL av medföljande dNTP blandningen, 3 µL av DMSO reagens i en lämplig volym av avjoniserat vatten (slutliga reaktionsvolym : 50 ΜL). Slutligen tillsätt 2,5 U av DNA-polymeras och blanda genom pipettering upp och ner. Som en negativ kontroll, bära längs en no-primer provet.
- Starta PCR använder följande program: steg 1: 95 ° C i 1 min, steg 2: 95 ° C för 50 s, steg 3: 60 ° C för 50 s, steg 4: 68 ° C i 8 min, upprepa steg 2-4 18 gånger och steg 5: 68 ° C i 10 min.
- Efter PCR, tillsätt 1 µL av Dpnjag restriktionsenzym (10 U/µL) och ytterligare Inkubera injektionsflaskan reaktion vid 37 ° C i 1 h.
- Omvandling och Screening för önskad klonen
- Förvandla en alikvot av ultracompetent celler i enlighet med tillverkarens rekommendationer. Användning SOC medium (trypton 2% (w/v), jäst extrakt 0,5% (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, sterilisera vid 121 ° C och tillsätt sedan steril-filtrerad lösningar av MgCl2 och glukos upp till slutliga koncentrationer av 10-20 mM, respektive) i stället för tillverkarens medium. Efter ingreppet, tallrik 250 µL av de prov mutagenicitet på en LB skylt innehållande 100 µg/mL ampicillin och inkubera vid 37 ° C i 18 h.
- Försäkra att antalet transformants är > 10 och reaktionen ger minst tre gånger så många kolonier som nr-primer kontroll reaktion, t.ex., med en lysande plattan för att underlätta kolonin räknar. Sedan plocka 3 kolonier och förbereda 3 mL övernattning kulturer i LB buljong medium.
- Nästa dag, utföra plasmid preparationen med en standardsats och analysera hela sekvensen med T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) och BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primers via standard Sanger sekvensering.
- Använd en lämplig molekylärbiologiska verktyg för att analysera sekvensen. När önskad mutationen upptäcks och inga ytterligare sekvens abnormitet jämfört med NM_000169.2 (α-galaktosidas A) eller NM_000152.4 (surt α-glukosidas) ses, Välj klonen för transfection-grade plasmid rening.
- Bestämma renheten av DNA genom att mäta absorbansen i en spektrofotometer.
Obs: Tillåter endast preparat som ger en plasmid renhet med en 260/280 absorbansen förhållandet av > 1,8 för cell kultur experiment.
2. odling av HEK293H celler
- Upprätthålla HEK293H celler i hög glukos (4,5 g/L) Dulbecco´s ändrad Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin. Hålla cellerna i en water-jacket inkubator vid 37 ° C under en 5% CO2 atmosfär.
- Odla cellerna till en densitet på 80-90%.
- Sug ut mediet och tvätta när använda fosfat buffrad saltlösning (PBS) utan Ca2 + och Mg2 +.
- Passage genom att lägga till 0,05% Trypsin-EDTA och inkubera i 5 minuter vid 37 ° C och 5% CO2.
- Dela celler 1:15 i färskt medium och utsäde i en ny T75 kolv att bibehålla permanent kulturen. Använd inte celler med mer än 25 passager.
3. pcDNA3.1/GLA och pcDNA3.1/GAA Plasmid Transfection och behandling av HEK293H
- 24 h innan transfection, tvätta HEK293H cellerna i en T75 cell kultur kolv en gång med PBS med Ca2 +, Mg2 +. Skörda de med 0,05% Trypsin-EDTA som anges ovan och utsäde 1,5 x 105 celler i hålrum 24 väl kultur platta på 500 µL DMEM medium kompletteras med 10% FBS utan antibiotika.
- Genomföra ett transfection protokoll enligt tillverkarens bruksanvisning. Vanligtvis använd en blandning av 1 µg av plasmid DNA och 2,5 µL transfection reagens i 100 µL serum-fri DMEM. Inkubera i 20 min i rumstemperatur och Lägg till cellerna i ett och sätt därefter.
- Ta bort mediet som innehåller transfection reagensen efter en period av 4 h på 37 °C/5% CO2 och tillsätt 500 µL av färska DMEM med 10% FBS / 1% penicillin/streptomycin.
Obs: Under detta steg 1-Deoxygalactonojirimycin hydroklorid (DGJ) eller 1-Deoxynojirimycin hydroklorid (DNJ) kan läggas till odlingsmediet där avsedda (Använd en lager vattenlösning av 10 mM för att erhålla en slutlig koncentration på 20 µM DGJ och DNJ ). Färsk DGJ eller DNJ lades 42 h efter plasmid transfection.
4. cell skörd och α-galaktosidas A eller surt α-glukosidas aktivitet mätning
- Cellen skörd
- På dagen för skörden, ta bort celler från inkubatorn och aspirera på medellång. Noggrant tvätta cellerna 2 gånger med PBS med Ca2 + och Mg2 +.
Obs: Detta steg är kritisk eftersom DGJ och DNJ är potenta hämmare av α-galaktosidas och α-glukosidas, respektive, och eventuella överblivna skulle ogiltigförklara testet. - Tillsätt 200 µL avjoniserat vatten direkt ovanpå cellerna. Skölj cellerna från plattan och överföra dem till en 1,5 mL reaktionsröret.
- På dagen för skörden, ta bort celler från inkubatorn och aspirera på medellång. Noggrant tvätta cellerna 2 gånger med PBS med Ca2 + och Mg2 +.
- Homogenisering av frysning och upptining
- Lägg proverna i ett lämpligt skum rack och virvel för 5 s att effektivisera Lys. Sätta de prover som omväxlande i flytande kväve för 10 s och i rumstemperatur vattenbad tills upptining var komplett (5 min).
- Upprepa detta 5 gånger och sedan snurra proverna för 5 min vid 10 000 x g.
- Förbered en frisk slang för varje prov som innehåller 40 µL avjoniserat H2O och tillsätt 10 µL prov. Blanda lösningen av vortexa kort och överför 10 µL i en hålighet i en 96 väl platta (varje prov i tre exemplar). Späd 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) stamlösning i avjoniserat H2O enligt följande för att erhålla en standardkurva: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O-30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- Starta reaktionen genom att lägga till 200 µL BCA reagens (reagens A och B-reagens blandas i förhållandet 50: 1) och inkubera i 1 h i mörker vid 37 ° C under liten agitation i orbitalskak (300 rpm). Mät absorbansen vid 560 nm i en spektrofotometer.
Obs: Proven innehåller vanligtvis mellan 1 och 1,5 µg protein per µL.
- Späd det beräknade beloppet av varje prov och Pipettera till färska 1,5 mL reaktionsrören att erhålla 0,05 (för α-galaktosidas A) eller 0,5 (för surt α-glukosidas) µg protein/µL lösningar. Vortex proverna för 5 s igen och Pipettera 10 µL denna utspädning i en 96 väl plåt (varje prov i två exemplar).
- Starta reaktionen genom att lägga till 20 µL av respektive substratlösningen:
För α-galaktosidas A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) i 0,06 M citrat fosfatbuffert, pH 4,7.
För surt α-glukosidas: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glukopyranosid (4-MU-glu) i 0,025 M natriumacetat, pH 4.0. - Inkubera i enzymreaktioner för 1 h i mörker vid 37 ° C under liten agitation i orbitalskak (300 rpm). Avsluta reaktionen genom tillsats av 200 µL 1,0 M, pH 10.5 justerade glycin-NaOH buffert.
- Förbered en standardkurva av 4-methylumbelliferone (4-MU) från en 0,01 mg/mL lager enligt följande:
100 µL H2O / Nej 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; inga H2O / 100 µL 4-MU, Pipettera 10 µL av varje utspädning i 96 brunnen tallrik (i dubbletter) och tillsätt 200 µL 1,0 M glycin-NaOH bufferten till varje brunn för att justera volymen och pH. - Mäta enzymaktiviteten i en fluorescens läsare utrustade med lämpliga filter och analysera data med hjälp av lämplig programvara för fluorescens läsare enheten.
Obs: Båda 4-mugg substrat är reducerade till 4-MU under exponering för α-galaktosidas A eller surt α-glukosidas. Släpptes 4-MU är en fluorokrom, som kan mätas på 360 och 465 nm som excitation och utsläpp våglängder, respektive med en mikroplattan fluorescens läsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutagenes förfarandet
För att bedöma effektiviteten i GLA -genen mutagenes, klassificerades mutationerna i en av följande kategorier. Denna metod att generera mutationer visade att ca 66,5% av GLA mutationerna erhölls i första försöket. Ytterligare 25% kunde erhållas efter en något modifierad andra PCR.
Kategori 1: Mutagenicitet PCR var effektivt vid första försöket.
Kategori 2: Första mutagenes PCR misslyckades (inga kolonier på plattan, ingen infogade mutation); upprepning med samma primer inställd genom att öka glödgning temperaturen upp till 68 ° C var effektivt.
Kategori 3: Mer ansträngning måste göras för att ge önskad klonen (t.ex., vanligtvis en eller flera nya uppsättningar av primers utformades).
Α-galaktosidas A och surt α-glukosidas enzym aktivitet mätning
Enzymaktivitet av olika mutanta enzymer spelades efter föregående inkubation av övergående transfekterade cellerna i närvaron eller frånvaron av en PC. Tabell 1 avser resultaten för 3 α-galaktosidas A och 3 surt α-glukosidas mutationer. Data visas som absoluta värden (1) för substratet omsättningen (nmol 4-MU * mg protein-1* h-1) och (2) relativa värden normaliseras till enzymet vildtyp. Båda uttrycken är användbara, eftersom totala substrat omsättning illustrerar effektiviteten i reaktionen och känsligheten i systemet, medan de normaliserade värdena kan ge viktiga tips för sannolikheten för malignitet av mutationen å ena sidan och den effektiviteten i tillämpad PC behandling å andra sidan. Den experimentella fasen sattes arbetsflödet avbildas i figur 1 upp, som planerade en 60 h inkubationstid med föreningen (på grund av tekniska skäl, t.ex. snabb HEK293H celltillväxt de introducerade villkor). Även om det har sagts att 10 µM var ungefärliga maximala uppnås plasmakoncentrationen för DGJ14, det nuvarande protokollet använder 20 µM som en rimlig koncentration i syfte att en screening för PC lyhördhet som stöds av många tidigare arbeten4,20,21,22,23. Dessutom har det varit postulerade att högre plasmanivåer nås24.
Figur 1 : Fungerar flödet av den in vitro- enzym aktivitet mätning. (A) visar tidslinje av experiment en 90 h cell kultur ansträngning med relativt lite hands-on-på-tid krävs vid angivna punkter. (B) visas representativa plasmid vektorer pcDNA3.1 innehållande vildtyp cds GLA och GAA . GLA och GAA vildtyp plasmider och plasmider inklusive respektive infogade mutationen av intresse användes till normalnivå transfect HEK293H celler pläterade i 24 väl format. Efter en period så att cellerna att syntetisera de respektive genen produkterna och möjliggör enzym behandling, lysosomala transport och PC action, cellerna var lyserat och mäts i en Plattläsare med fluorescens och analyseras med hjälp av respektive programvara. C: cell morfologi och tillväxt status av HEK293H celler visas under tiden hela experimentet. Skala barer = 100 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| in vitro-enzymaktivitet | |||||
| GLA | infödda | 20 ΜM DGJ | |||
| mutation (AA) | nmol 4-mugg-gal/mg/h (medelvärde) | % medelvärdet (±SD, N) | nmol 4-mugg-gal/mg/h (medelvärde) | % medelvärdet (±SD, N) | betydelse |
| p.A143T | 2384.7 | 29,2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52,0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16,3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8,8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44,2 (±3.6, 5) | **** |
| GAA | infödda | 20 ΜM DNJ | |||
| mutation (AA) | nmol 4-mugg-glu/mg/h (medelvärde) | % medelvärdet (±SD, N) | nmol 4-mugg-glu/mg/h (medelvärde) | % medelvärdet (±SD, N) | betydelse |
| p.Y455F | 41,1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246,6 | 31,4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65,7 | 6.6 (±. 4, 5) | 166,5 | 16,7 (±1, 5, 5) | ** |
| p.L552P | 0,0 | 0,0 (±. 2, 5) | 104,3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Tabell 1: enzymaktivitet av α-galaktosidas A och surt α-glukosidas. Tabellen visar representativa resultat för 3 α-galaktosidas A och 3 surt α-glukosidas mutanter med och utan datorer DGJ eller DNJ. Absoluta enzym aktivitetsdata korrigerades för endogena enzymaktivitet av HEK293H celler. Utvärdera endogena enzymaktivitet, var cellerna transfekterade med en pcDNA3.1 tom vektor. Värdena var 97,5 nmol 4-MU * mg protein-1* h-1 för α-galaktosidas A och 41,6 nmol 4-MU * mg protein-1* h-1 för surt α-glukosidas, respektive; enzym aktivitet värden var normaliserade till vildtyp enzym från motsvarande experiment, vilket förklarar avstegen av relativa värden mellan olika mutanter.Efter 5 oberoende cell kultur experiment (N = 5), varje utförs i tekniska dubbletter, standardavvikelsen inte tilläts vara > 15% av genomsnittliga. Baserat på T-test användes för att beräkna skillnaden mellan obehandlade och behandlade med PC enzym.
* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,005, *** p < 0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs häri levererar robusta resultat för enzym skadebedömningar vid ärftlig lysosomala sjukdomar i ämnesomsättningen. Detta manuskript är en ändring av protokollet publicerats tidigare15. De mest avgörande ändringarna innebära stränghet (dvs.i mutant vektor konstruera förberedelseprocessen), standardisering av protokollet cell kultur (dvs, HEK293H cell underhåll och transfection villkor), och höga antal experimentella repetitioner (minst 5), vilket starkt bidrog till reproducerbarheten för resultaten. Helt och hållet, både målgener har varit lättillgänglig för mutagenicitet och en multiplicity av mutationer kan monteras parallellt. En relativt hög signal/brusförhållande uppnåddes med tanke på att endogena enzymaktivitet i HEK293H cellerna var försumbar 1/50 (α-galaktosidas A) och 1/20 (surt α-glukosidas) i genen över uttryckt vildtyp. Således finns det en utmärkt upplösning mellan vildtyp och muterade enzym. Det bör noteras att en olika mängd totalprotein tillämpades för aktivitet analysen av både enzymer (0,5 och 5 µg, respektive), eftersom surt α-glukosidas aktivitet var en storleksordning som är lägre än för α-galaktosidas A.
Som nämnts ovan, är assay parametrar ofta kontroversiellt, eftersom många laboratorier har utvecklat sina egna analyser för att undersöka lysosomala glycosidases. Systemen kan variera i celltyp, plasmid-vektor design, odling villkor och period av läkemedelsexponering bara för att nämna några av många parametrar. En nyligen publicerad meta-analys för Fabrys sjukdom visat att enzymet aktivitetsinspelningar (med och utan dator) av transfekterade cellmodeller (t.ex., HEK293, COS-7) var till stor del i enlighet med de resultat som erhålls från patientderiverade celler ( mestadels lymfocyter eller fibroblaster) när det gäller frågan om en mutation är lyhörd till PC24. Tidigare rapporter direkt jämföra patientderiverade celler och transfection modeller visat att överdriven uttryck system återspeglar situationen i patientens celler utan att kompromissa med slutsats13,14. Det kan därför konstateras att, oberoende av protokollet, inte var resultaten av olika författare ändras av de olika mobilsystemen, även om responder definitioner kan vara avvikande. Den nuvarande definitionen för en svarande mutation är 20% relativ enzym aktivitet ökade, och 5% absolut enzym aktivitet jämfört med enzymet vildtyp efter inkubation med 20 µM DGJ för 60 h. En omfattande databas, FabryCEP, tillåter jämförelse av resultaten av olika experimentella metoder för hundratals α-galaktosidas mutanter25.
Huruvida dessa kriterier är tillräckliga för att förutsäga kliniska fördelarna med DGJ och DNJ är fortfarande oklart, eftersom aktivitetsnivån nödvändigt att förebygga symtomatisk sjukdom är kontroversiella. En tidigare studie föreslog att 10 till 15% av kvarvarande verksamhet kan vara tillräcklig för att systemet ska fungera korrekt26. Men i en nyligen publicerad rapport från en kliniska fas 2-studie för DGJ ansågs en ökning med 1% aktivitet potentiellt fördelaktig för patienten, när aktiviteten baslinjen var mindre än 1% av normal27. Senaste kliniska resultaten tyder på att patienter som förutspådde för att reagera på datorer av responder definitionen av ≥20% relativ ökning och ≥3% absolut ökning av vildtyp α-galaktosidas en aktivitet i HEK293H celler efter inkubation med 10 µM DGJ faktiskt härrör klinisk nytta med sjukdom stabilisering eller även förbättring av parametrar för njur- och hjärt28. Medan DGJ har redan godkänts av FDA och Europeiska kommissionen som monoterapi för Fabrys sjukdom, verkar jaga av datorer såsom DNJ och derivatan N-Butyl-DNJ i Pompes sjukdom vara olika. Ett monotherapeutical tillvägagångssätt med DNJ har avslutats under Fasii klinisk prövning på grund av allvarliga biverkningar hos några av patienterna29. PC behandling i kombination med godkända ERT visade dock betydligt bättre resultat när det gäller sjukdom substrat (glykogen) minskning jämfört med de ERT monoterapi30.
Vi föreslår att den presenterade metoden kan utvidgas till andra LSDs och andra datorer som Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff och GM1 gangliosidosis, men detta kanske inte fungerar i vissa fall, där till exempel signal/brusförhållandet i systemet är otillräcklig. Var noga med att välja en lämplig cell störningar metod för att förbereda en cell lysate enzym aktivitet beslutsamhet, eftersom tillsats av rengöringsmedel i lysisbuffert kan vara vägledande för membran-bundna enzymer såsom glukocerebrosidas i Gauchers sjukdom medan jämförbara mängder av rengöringsmedel kan skada andra enzymer. För α-galaktosidas A, bör en ultraljudsbehandling-baserade cell störningar metod undvikas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Mandy Loebert och Tina Czajka för utmärkt teknisk support. Vi tackar Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) för språk redigering hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
