Summary
Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.
Abstract
Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) gibi nadir monogenic hastalıkları tedavi etmek için kişiselleştirilmiş ilaç kullanımı karmaşık klinik deneme tasarımları, yüksek maliyetleri ve düşük hasta sayıları tarafından reddedilmiştir. Mutant gen yüzlerce LSDs çoğunda karıştığı. Hastalıklar genellikle 2-3 farklı klinik tipi önem göre sınıflandırılır. Ayrıca, genotip moleküler karakterizasyonu klinik sonuçlar tahmin ve hasta bakımı hakkında bilgi yardımcı olabilir. Bu nedenle, biz heterologously Fabry ve Pompe hastalığı tespit mutasyonlar aşırı ifade HEK293H hücreleri temel alan bir basit hücre kültür tahlil geliştirilmiştir. Benzer bir tahlil son zamanlarda mükellef mutasyonların farmakolojik refakatçi terapi (PCT) Fabry hastalığı tanımlamak için preklinik bir test olarak girmiştir. Bu el yazması hızlı fenotipik değerlendirme Fabry ve Pompe hastalığında uygun hastalar için PCT tanımlamak için allelic versiyonlarının ve roman pharmacochaperones gelişmesinde yardımcı olabilir bu bir değişik hücre kültür tahlil açıklar.
Introduction
Orada glycosidase disfonksiyon birincil gen mutasyonlar sonucu ile ilgili bir düzine Lizozomal depo bozuklukları (LSDs) üzerinde. Fabry (OMIM #301500) ve Pompe (OMIM #232300) hastalığı, fazla 500 ve 200 missense1,2,3 bildirilmiştir, mutasyonlar sırasıyla hangi toplam mutasyon sayısı yaklaşık % 60 karşılık gelir. Çok sayıda yeni gen değişik hala tespit edilmektedir, birçoğu bilinmeyen var önemi. Geniş biyokimyasal araştırmalar ortaya bazı genotip bir tam kaybı-in-işleve GLA gen yol değil (OMIM * 300644) Fabry hastalığı, ama neden thermodynamically tercih katlama devlet4 ulaşmak başarısız olmasına karşılık gelen enzim . Bu ER saklama ve aksi takdirde fonksiyonel enzim erken bozulma ile sonuçlanır. Benzer sonuçlar Pompe hastalığı5de dahil olmak üzere diğer LSDs çizilmiştir. Ayrıca, enzim değişik moleküler karakterizasyonu mutasyonlar klinik yorumlanması tanı6LSD ilerleme mutasyon niteliğine göre bireysel bir süreç olduğunu düşündüren, zamanında kolaylaştırabilir. Bu nedenle, genellikle 2-3 farklı klinik tipi içine Geleneksel sınıflandırma klinik danışmanlık ve tedavi edici kararlar verimlilik düzeyini artırmak amacıyla yeniden değerlendirmeye.
Enzim replasman tedavisi (ERT) her iki hastalık için kullanılabilir. ERT, ancak, etkilenen doku/organ beyin ve kas iskelet gibi etkinlik sınırlıdır. Ayrıca, ERT terapötik yararları tehlikeye atıyor immünojenik bir yanıt temin. Farmakolojik Chaperones (adet) sözde duyarlı mutasyonlar olan hastalar için bir çekici tedavi alternatiftir. Adet doğru protein katlanması ve endoplazmik retikulum (ER) tutma ve ER ilişkili bozulması enzim sırayla önleyen stabilization için moleküler bir iskele olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, adet sözlü olarak yönetilebilen ve potansiyel olarak kan beyin bariyerini çapraz edebiliyoruz. Bu nedenle, PCT belirli genotip olan hastalar tedavi için daha uygun bir seçenek olabilir. LSDs uygulamada PC üzerinde kapsamlı bir inceleme için mükemmel inceleme Parenti7tarafından bakın.
Mutant gen neden olan hastalık yüzlerce keşfi önceden klinik uyuşturucu testi zorlukları ve mükellef hastalar kişiselleştirilmiş tıp yaklaşım için bir basit, hızlı ve yüksek standart değerlendirme gerektirir. LSD gen mutasyonlarının zararlı etkilerini değerlendirmek amacıyla ve mükellef hastalar için PCT tahmin etmek için aday mutasyon test etmek için hızlı ve güvenilir enzim aktivitesi ölçümü için sağlayan bir yüksek standart aşırı ifade sistem HEK293H hücrelerdeki oldu geliştirdi. Benzer aşırı ifade sistemleri daha önce tarif edilmiş COS-78,9,10,11, HeLa hücreleri12veya HEK293 kullanarak Fabry ve Pompe hastalığı için13 ,14,15,16 hücreleri glycosidase gen için.
Çok benzer bir yöntem bile hastalıkların farmakolojik refakatçi tedaviye yanıt tahmin etmek için bir "yöntemi" olarak patentli bir hücre uygunluğunu gösteren17 kültür sistemi klinik uygulamaya entegre yeteneğine sahip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık Mutant pcDNA3.1/GLA ve pcDNA3.1/GAA yapıları
Not: GLA ve dizileri (CD) kodlama GAA klonlama stratejileri bildirilen önceki15,18olmuştur.
- Site yönettiği Mutagenesis kullanarak site Yönetmen: Mutagenesis
- Kullanım başvuru NM_000169.2 ve NM_000152.4 GLA ile GAA gen, mutagenesis için şablonlar olarak sırasıyla diziler. İlgili sıra değişiklikleri tek tek mutasyon tanıtmak uzunluğuna Merkezi taşıma duygusu ve Antisens astar ile ticari bir sağlayıcı tarafından sentezlenen yüksek saflıkta tuz ücretsiz astar (25-37-mers) belirledik. Astar tasarım19destek için ücretsiz astar tasarım aracını kullanın.
- Reaksiyon karışımı için tepki çözüm için standart koşullar ve üretici tarafından sağlanan PCR koşullar kullanın.
- Mix 5 µL tepki arabellek, 10 x 10 ng çift iplikçikli şablon plazmid DNA (pcDNA3.1/GLA veya pcDNA3.1/GAA), 125 ng her astar, sağlanan dNTP karışımdan 1 µL, DMSO reaktif uygun bir birimdeki deiyonize su (son tepki Cilt 3 µL : 50 ΜL). Son olarak, 2.5 U DNA polimeraz ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Bir negatif kontrol no-astar örnek taşımak.
- Aşağıdaki programı kullanarak PCR başlatmak: adım 1: 95 ° C 1 dk. için adım 2: 95 ° C 50 s, adım 3: 60 ° C 50 s, adım 4: 68 ° C 8 min için adım 2-4 18 kez tekrarlayın ve adım 5: 68 ° C 10 dk için.
- Dpn1 µL PCR, ekleyin ben restriksiyon enzimi (10 U/µL) ve daha fazla tepki flakon 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Dönüşüm ve istenen klon için tarama
- Bir aliquot uygun olarak üreticinin önerilerini ultracompetent hücrelerinin dönüşümü. Kullanım SOC orta (tryptone %2 (w/v), Maya %0,5 (w/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM özü, 121 ° C'de sterilize ve steril filtre çözümleri MgCl2 ve glikoz ikiye kadar 10 ila 20 mM, son konsantrasyonları sırasıyla ekleyin) Üretici yerine Orta. Yordamı sonra örnek mutagenesis bir LB üzerinde plaka 250 µL içeren 100 µg/mL Ampisilin plaka ve 18 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
- Transformants sayısı temin > 10 ve tepki verir en az üç kat daha fazla kolonileri no-astar kontrol tepki, koloni sayımı kolaylaştırmak için aydınlık bir tabak kullanarak örneğin,. Daha sonra 3 kolonileri alın ve 3 mL LB suyu orta gece kültürlerde hazırlamak.
- Ertesi gün, plazmid hazırlık Standart kit ile gerçekleştirmek ve tüm sıra T7 kullanarak analiz (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA etiketi GG-3ʹ) ve BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) astar standart Sanger üzerinden sıralama.
- Sıra analiz için uygun moleküler biyoloji aracını kullanın. Ne zaman istenen mutasyon tespit ve daha fazla NM_000169.2 (α-galaktozidaz A) göre anormallik sıra no veya NM_000152.4 (asit α-glucosidase) görülür, transfection-grade plazmid arıtma için klon seçin.
- DNA'ın saflık bir Spektrofotometre Absorbans ölçerek belirlemek.
Not: plazmid saflık 260/280 Absorbans oranında verim hazırlıklar izin > 1.8 hücre kültür deneyler.
2. HEK293H hücreleri tarımı
- HEK293H hücreleri yüksek glikoz (4,5 g/M) % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco´s modifiye kartal orta (DMEM) korumak. Hücreleri aklında bulunsun bir kuluçka %5 CO2 atmosfer altında 37 ° C'de water-jacket.
- Yoğunluk % 80-90 hücrelere yetiştirmek.
- Orta Aspire edin ve fosfat kullanarak tamponlu tuz (PBS) Ca2 + ve Mg2 +olmadan bir kez yıkayın.
- Geçit ekleyerek % 0.05 tripsin-EDTA ve 37 ° C ve % 5 CO25 min için kuluçkaya.
- Hücreleri 1:15 taze orta ve tohum kalıcı kültür korumak için yeni bir T75 şişesi bölünmüş. Hücreleri ile 25'ten fazla pasajlar kullanmayın.
3. pcDNA3.1/GLA ve pcDNA3.1/GAA plazmid Transfection ve HEK293H tedavi
- 24 saat önce transfection, bir T75 hücre kültür şişesi kez PBS ile Ca+ 2, Mg2 +ile HEK293H hücrelerde yıkayın. Yukarıda belirtildiği gibi %0,05 tripsin-EDTA içeren hücreleri ve tohum 1.5 x 10%5 10 ile desteklenmiş 500 µL DMEM orta kullanarak 24 iyi kültür plaka boşluklar hücrelerde hasat FBS Antibiyotikler olmadan.
- Transfection Protokolü Üretici kılavuzuna göre yerine getirir. Genellikle, plazmid DNA'ın 1 µg ve transfection reaktif 2.5 µL serum-Alerjik DMEM 100 µL içinde kullanılır. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve hücrelere bundan sonra drop-wise bir şekilde ekleyin.
- 4 h 37 °C/5% CO2 bir süre sonra transfection reaktif içeren orta kaldırın ve taze DMEM % 10 ile 500 µL ekleyin FBS / % 1 penisilin/streptomisin.
Not: Bu adım sırasında Deoxygalactonojirimycin 1 hidroklorür (DGJ) veya Deoxynojirimycin 1 hidroklorür (DNJ) kültür ortamına eklenmiş olabilir amaçlanan nerede (20 µM son bir konsantrasyon elde etmek için 10 mm sulu bir hisse senedi çözüm kullanmak DGJ ve DNJ ). Taze DGJ veya DNJ 42 h plazmid transfection sonra eklendi.
4. hücre hasat ve α-galaktozidaz A veya asit α-glucosidase etkinlik ölçümü
- Hücre hasat
- Hasat günü, hücreleri kuluçka makinesi kaldır ve orta Aspire edin. Dikkatle bulunduğu hücreleri PBS ile Ca2 + ve Mg2 +2 kere yıkayın.
Not: DGJ ve DNJ α-galaktozidaz ve α-glucosidase, güçlü inhibitörleri sırasıyla herhangi bir artık test geçersiz kılacak olduğundan, bu adım önemlidir. - Deiyonize su hücreleri doğrudan üzerine 200 µL ekleyin. Plaka hücrelerden durulayın ve 1,5 mL tepki tüp aktarabilirsiniz.
- Hasat günü, hücreleri kuluçka makinesi kaldır ve orta Aspire edin. Dikkatle bulunduğu hücreleri PBS ile Ca2 + ve Mg2 +2 kere yıkayın.
- Homojenizasyon tarafından dondurma ve çözme
- Bir uygun köpük raf ve 5 için girdap örnekleri koymak lizis daha verimli hale getirmek için s. 10 için sıvı azot alternatif örnekleri koymak s ve çözdürme tam (5 dk) olana bir oda sıcaklığında su banyosunda.
- Bu yordamı 5 kez tekrarlayın ve sonra örnekleri 10.000 x g de 5 min için spin.
- Taze bir tüp deiyonize H2O 40 µL içeren her örnek için hazırlamak ve örnek 10 µL ekleyin. Çözüm vortexing tarafından kısa bir süre karıştırın ve 10 µL 96 iyi plaka (nüsha her örnekte) bir kavite içine aktarın. 2 mg/mL sığır serum albumin (BSA) hisse senedi çözeltilerine aşağıdaki gibi standart bir eğri elde etmek için deiyonize H2O seyreltik: 50 µL H2O/50 µL BSA; 60 µL H2O/40 µL BSA; 70 µL H2O/30 µL BSA; 80 µL H2O/20 µL BSA; 90 µL H2O/10 µL BSA; 100 µL H2O.
- Reaksiyon BCA reaktif 200 µL ekleyerek başlayın (Reaktif A ve Reaktif B karışık bir 50: 1 oranında) ve karanlıkta bir orbital Çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde hafif ajitasyon altında 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. 560 Absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu.
Not: Örnekler genellikle 1 ile 1,5 µg protein µL başı arasında içerir.
- Her örnek ve damlalıklı hesaplanan miktarı 0,05 (için α-galaktozidaz A) veya (için asit α-glucosidase) 0,5 µg protein/µL çözümler elde etmek için taze 1,5 mL tepki tüpler içine sulandırmak. Girdap örnekleri 5 s tekrar ve damlalıklı 10 µL, 96 içine bu seyreltme için de plaka (yinelenen her örnekte).
- Reaksiyon ilgili substrat çözeltisi 20 µL ekleyerek başlayın
α-galaktozidaz A: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside için (4-MU-gal) 0,06 M fosfat sitrat tampon pH 4.7.
Asit α-glucosidase için: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside (4-MU-glu) 0,025 M sodyum asetat, pH 4.0 içinde. - Karanlıkta bir orbital Çalkalayıcı (300 rpm) üzerinde hafif ajitasyon altında 37 ° C'de 1 h için enzim reaksiyonları kuluçkaya. Reaksiyon 1.0 m, pH 10,5 ayarlanan glisin-NaOH arabellek 200 µL eklenmesi tarafından sonlandırın.
- 4-methylumbelliferone (4-MU) 0.01 mg/mL stoktan standart bir eğri şekilde hazırlayın:
100 µL H2O / Hayır 4-MU; 80 µL H2O / 20 µL 4-MU; 60 µL H2O / 40 µL 4-MU; 40 µL H2O / 60 µL 4-MU; 20 µL H2O / 80 µL 4-MU; hiçbir H2O / 100 µL 4-MU, damlalıklı 10 µL her seyreltme 96 kuyuya, plaka (Yineleme) ve 200 µL 1,0 M glisin-NaOH arabelleği her şey için ses ayarı ve pH için ekleyin. - Ölçü enzim etkinliği bir floresan okuyucu uygun filtre seti ile donatılmış ve floresan okuyucu aygıt için uygun yazılımı kullanarak veri analiz.
Not: Her iki 4-kulplu sürahi yüzeylerde 4-MU için α-galaktozidaz A veya asit α-glucosidase maruz kalma sırasında azaltılır. Yayımlanan 4-MU 360 ve 465 nm'de uyarma ve emisyon dalga boylarında, sırasıyla, bir Mikroplaka Floresans okuyucu kullanarak ölçülebilir bir fluorochrome var.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mutagenesis yordamı
Mutasyonlar GLA gen mutagenesis etkinliğini değerlendirmek için aşağıdaki kategorilerden birine sınıflandırıldı. Mutasyonlar oluşturmak için bu yaklaşım ortaya koydu bu ilk denemede GLA mutasyonların yaklaşık % 66.5 elde edilmiştir. Daha fazla %25 sonra biraz değiştirilmiş bir ikinci PCR elde.
Kategori 1: Mutagenesis PCR ilk denemesinde etkili oldu.
Kategori 2: İlk mutagenesis PCR (kolonileri tabak, eklenen hiçbir mutasyon) başarısız oldu; aynı astar kullanarak yineleme ayarla tavlama sıcaklığı kadar artırarak 68 ° C etkili oldu.
Kategori 3: Daha fazla çaba istenen klon verim için üstlenilen gerekiyordu (örneğin, astar genellikle bir veya daha fazla yeni kümesi tasarlanmıştır).
Α-galaktozidaz A ve asit α-glucosidase enzim aktivitesi ölçümü
Enzim etkinliği farklı mutant enzimlerin geçici transfected hücreleri önceki kuluçka sonra bir PC içinde kaydedildi. Tablo 1 3 α-galaktozidaz A ve 3 asit α-glucosidase mutasyonlar için sonuçları gösterir. Veri substrat ciro için (1) mutlak değerleri olarak görüntülenir (nmol 4-MU * mg protein-1* s-1) ve (2) göreli değerler vahşi türü enzim için normalleştirilmiş. Her iki ifade beri toplam substrat ciro göstermektedir tepki verimliliğini ve normalleştirilmiş değerleri önemli verebilir süre sistem duyarlılığını bir yandan mutasyon malignite olasılığı için ipuçları yararlı, ve Öte yandan uygulanan PC tedavi verimliliğini. Deneysel aşamada şekil 1 ' de tasvir iş akışı, hangi bir 60 h kuluçka dönemi (nedeniyle teknik nedenlerle, örneğin hızlı HEK293H hücre büyümesini tanıtılan koşullar altında) bileşik ile zamanlanmış kuruldu. O durum 10 µM DGJ14yaklaşık maksimum ulaşılabilir plazma konsantrasyonu, geçerli protokol 20 µM olarak bir tarama amacıyla makul bir konsantrasyon PC yanıt için tarafından desteklenen olarak kullanır rağmen çok sayıda daha önce4,20,21,22,23çalışır. Ayrıca, bu yüksek plazma seviyeleri24ulaşılabilir öne.
Resim 1 : İş akışını vitro enzim aktivitesi ölçümü. (A) deneme çizelgesinin nispeten küçük elleriyle-on-belirtilen süre noktalarda gereken süre ile 90 h hücre kültür çaba gösterir. (B) temsilcisi plazmid vektörel çizimler pcDNA3.1 vahşi türü CD GAA ve GLA içeren gösterilir. GLA ve GAA vahşi türü plazmidleri ve plazmidlerin ilgi ilgili eklenen mutasyon da dahil olmak üzere geçici 24 iyi biçimde kaplama HEK293H hücre transfect kullanılmıştır. Hücreleri ilgili gen ürünleri sentez ve enzim işleme, lizozomal taşıma ve PC eylem için izin vermek izin vermek için bir süre sonra hücreler lysed ve bir floresan plaka okuyucu olarak ölçülen ve ilgili yazılım kullanılarak analiz. C: hücre morfolojisi ve büyüme durumu HEK293H hücrelerinin deneme süresi boyunca gösterilir. Ölçek çubukları 100 µm = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Tüp Bebek enzim aktivitesi | |||||
| GLA | yerli | 20 ΜM DGJ | |||
| mutasyon (AA) | nmol 4-kupa-gal/mg/h (ortalama) | % ortalama (±SD, N) | nmol 4-kupa-gal/mg/h (ortalama) | % ortalama (±SD, N) | önemi |
| p.A143T | 2384.7 | 29.2 (±2.6, 5) | 4223.0 | 52.0 (±4.4, 5) | *** |
| p.A156V | 379.2 | 4.3 (±. 8, 5) | 1437.5 | 16,3 (±1.3, 5) | **** |
| p.R301Q | 777.4 | 8,8 (±1.1, 5) | 3002.6 | 44.2 (±3.6, 5) | **** |
| GAA | yerli | 20 ΜM DNJ | |||
| mutasyon (AA) | nmol 4-kupa-glu/mg/h (ortalama) | % ortalama (±SD, N) | nmol 4-kupa-glu/mg/h (ortalama) | % ortalama (±SD, N) | önemi |
| p.Y455F | 41.1 | 5.4 (±. 4, 5) | 246.6 | 31.4 (±2.8, 5) | *** |
| p.P545L | 65.7 | 6,6 (±. 4, 5) | 166.5 | 16,7 (±1.5, 5) | ** |
| p.L552P | 0.0 | 0.0 (±. 2, 5) | 104.3 | 10.4 (±1.4, 5) | *** |
Tablo 1: enzim aktivitesinin α-galaktozidaz A ve asit α-glucosidase. Tablo 3 α-galaktozidaz A ve 3 asit α-glucosidase mutantlar ve adet DGJ veya DNJ olmadan için temsilcisi sonuçları gösterir. Mutlak enzim etkinliği verilerini HEK293H hücrelerinin endojen enzim etkinliği için giderilmiştir. Endojen enzim etkinliğini değerlendirmek için hücreleri ile pcDNA3.1 boş vektör transfected. Değerleri 97,5 nmol 4 vardı-MU * mg protein-1* s-1 için α-galaktozidaz A ve 41.6 nmol 4-MU * mg protein-1* s-1 için asit α-glucosidase, sırasıyla; enzim aktivitesi değerleri farklı mutantlar arasında göreli değerler sapmalar açıklar ilgili deneyler üzerinden vahşi türü enzim için normalleştirilmiş.5 bağımsız hücre kültür deney sonrası (N = 5), her teknik çoğaltmaları yürütülen, standart sapma olmak izin verilmiyor > ortalama % 15. Oranı T-testleri tedavi edilmezse ve PC tedavi enzim arasındaki farkı hesaplamak için kullanılmıştır.
* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.005, *** p < 0,001
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol metabolizma kalıtsal lizozomal hastalıklar enzim hasar değerlendirmesi için sağlam sonuçlar sunar. Bu el yazması bir değişiklik Protokolü önceki15Yayınlanan olduğunu. (Yani, mutant vektör yapı hazırlık sürecinde), sıkılık en önemli değişiklikler içeren hücre kültür Protokolü (örneğin, HEK293H hücre bakım ve transfection koşulları) ve yüksek standardizasyonu (en az 5), son derece sonuçları tekrarlanabilirlik için katkıda deneysel Tekrarlamaların sayısını. Özet olarak, her iki hedef genlerin mutagenesis için kolayca erişilebilir olmuştur ve mutasyonların çokluğu paralel olarak monte edilebilir. Nispeten yüksek sinyal/noise oranı HEK293H hücrelerde endojen enzim etkinliği bir ihmal edilebilir 1/50 (α-galaktozidaz A) ve 1/20 (asit α-glucosidase) aşırı ifade vahşi türü gen olduğunu dikkate alınarak sağlanır. Böylece, vahşi türü ve mutant enzim arasında mükemmel bir çözünürlük vardır. Farklı bir toplam protein miktarı her iki enzim etkinliği tahlil için uygulandığını belirtmek gerekir (0.5 ve 5 µg, sırasıyla), asit α-glucosidase etkinliği bir büyüklük α-galaktozidaz A. daha düşük olduğu için
Birçok laboratuar lizozomal glycosidases araştırmak için kendi deneyleri geliştirdik beri yukarıda belirtildiği gibi tahlil parametreleri tartışmalı, çoğu kez. Sistemleri hücre tipi, plazmid-vektör tasarımı, yetiştirme koşulları ve uyuşturucu maruz kalma süresi sadece birkaçı çok sayıda parametre farklı olabilir. Fabry hastalığı için kısa bir süre önce bir meta-analiz enzim aktivitesi kayıtları (ile ve ezelî PC) transfected cep modelleri (örneğin, HEK293, COS-7) büyük ölçüde hasta elde edilen hücre (elde edilen sonuçlar doğrultusunda olduğunu gösterdi çoğunlukla lenfositler veya fibroblastlar) ile ilgili olarak soru, ister bir mutasyon için PC24cevap veriyor. Önceki raporları doğrudan hasta elde edilen hücre ve transfection modelleri karşılaştırma aşırı ifade sistemleri hasta hücrelerin durumda sonuç13,14ödün vermeden yansıtmak gösterdi. Yanıtlayıcı tanımları-ebilmek var olmak farklı olsa bile bu nedenle özel Protokolü ne olursa olsun, farklı yazarlar tarafından elde edilen sonuçlar değil değiştirildi, farklı hücresel sistemleri tarafından söylenebilir. Geçerli tanımı için yanıt veren bir mutasyon % 20 göreli enzim aktivitesi artış ve vahşi türü enzim sonra kuluçka 20 µM DGJ 60 h ile karşılaştırıldığında % 5 mutlak enzim aktivitesi artış var. Kapsamlı bir veritabanı, FabryCEP, α-galaktozidaz mutantlar25yüzlerce farklı deneysel yaklaşımlarla elde edilen sonuçlar karşılaştırılması izin verir.
Etkinlik semptomatik hastalık önlemek için gerekli düzeyini tartışmalı olduğu için bu kriterleri klinik yarar-in DGJ ve DNJ tahmin etmek yeterli olup, belirsizdir. Eski bir çalışma kalan etkinlik 10-%1526düzgün çalışması sistem için yeterli olabilir önerdi. Temel faaliyet normal27az % 1 yaşındayken ancak, bir faz 2 klinik çalışma DGJ için kısa bir süre önce bir raporda, bir % 1 aktivite artışı hasta için potansiyel olarak yararlı kabul edildi. PC'ler için ≥20% göreceli artış ve ≥3% mutlak artış vahşi türü α-galaktozidaz Yanıtlayıcı tanımına göre bir etkinlik HEK293H hücrelerdeki 10 µM ile kuluçka sonra yanıt tahmin hastalar aslında DGJ elde edilen son klinik sonuçları öneririz hastalık sabitleme veya böbrek ve kalp parametrelerini28tarafından bile iyileştirme ile klinik yararı. Oysa DGJ zaten FDA ve Avrupa Komisyonu tarafından bir tedavinin Fabry hastalığı olarak kabul gördü, PC'ler DNJ ve türev N-butil-DNJ Pompe hastalığında gibi Tabii farklı gibi görünüyor. DNJ monotherapeutical yaklaşımla bir Aşama II klinik nedeniyle bazı hastalar29şiddetli advers olaylar sırasında sona erdi. Ancak, PC tedavi onaylanmış ERT ile birlikte ERT tedavinin30' a göre hastalık substrat (glikojen) tasarruf açısından önemli ölçüde geliştirilmiş sonuçlar ortaya koydu.
Biz öneririz sunulan yaklaşım-ebilmek var olmak erişmek için diğer LSDs ve diğer PC'ler Gaucher, Krabbe, Tay-Sachs/Sandhoff ve GM1 gangliosidosis gibi ama bu özel durumlarda, örneğin sistem sinyal/noise oranı yetersiz nerede işe yaramayabilir. Deterjanlar ek lizis arabellek içine membran bağlı enzimler gibi içinde glucocerebrosidase göstergesi olabilir çünkü bir hücre lysate enzim aktivitesinin belirlenmesi için hazırlamak için bir uygun hücre bozulma yöntemi seçmek için dikkat edilmelidir Gaucher hastalığı benzer miktarda deterjan iken diğer enzimler zarar verebilir. α-galaktozidaz A için bir hücre sonication tabanlı bozulma yöntemi kaçınılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Yazarlar Mandy Loebert ve Tina Czajka için mükemmel teknik destek kabul etmek istiyorum. Flora Luo (Harvard Tıp Okulu, Boston, MA, ABD) dil düzenleme yardım için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit | Stratagene, La Jolla, CA, USA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5´- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[R301Q]-rev: 5´- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A156V]-frw: 5´-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[L552P]-frw: 5´-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer GAA[P545L]-rev: 5´-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer T7: 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Primer BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´ | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germany | n.a. | |
| Tryptone | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8952.1 | |
| Yeast Extract | Merck, Darmstadt, Germany | 103,753 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,041,000 | |
| Potasium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 1,049,360,500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| D (+)-Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,083,422,500 | |
| Sodium Hydroxide | Merck, Darmstadt, Germany | 1,064,980,500 | |
| Glycine | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3908.2 | |
| Citric acid | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X863.3 | |
| disodium hydrogen phosphate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,065,860,500 | |
| Sodium acetate | Merck, Darmstadt, Germany | 1,062,640,050 | |
| Glacial acetic acid | Sigma Aldrich, Munich, Germany | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X968.2 | |
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | ZymoResearch, Freiburg, Germany | D4020 | |
| QIAfilter Plasmid Midi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12245 | |
| HEK293H cell line | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11631-017 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 31966-047 | |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare, South Logan, Utah, USA | SV30160.03 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 15140-122 | |
| CELLSTAR Standard Cell Culture Flasks, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Germany | 82050-854 | |
| Cell culture plates (24 well) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 831,836 | |
| Cellstar 96 well plate | Greiner bio one, Frickenhausen, Germany | 655185 | |
| SafeSeal reaction tubes, 1,5mL | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Germany | 11668-019 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada | D236500 | |
| 1-Deoxynojirimycin | Sigma Aldrich, Munich, Germany | D9305 | |
| PBS Dulbecco w/o Calcium, w/o Magnesium | Biochrom, Berlin, Germany | L 1825 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 25300054 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific, Braunschweig, Germany | 23225 | |
| 4-Methylumbelliferone | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-galactopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M7633 | |
| 4-Methylumbelliferyl α-D-glucopyranoside | Sigma Aldrich, Munich, Germany | M9766 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| incubator type T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Germany | n.a. | |
| Luminous Plate Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | P265.1 | |
| 3130 xl Genetic Analyzer | Applied Biosystems, Darmstadt, Germany | n.a. | |
| GFL-3032 bacterial shaker | GFL, Burgwedel, Germany | n.a. | |
| Avanti J-25 centrifuge | Beckman/Coulter, Krefeld, Germany | n.a. | |
| Ultraspec 3100 pro Spectrophotometer | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, United Kingdom | n.a. | |
| water-jacket incubator | Binder, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| Vortex Genie 1 touch mixer | Scientific Industries, Bohemia, NY, USA | n.a. | |
| Z 233 MK-2 refrigerated microtube centrifuge | Hermle, Tuttlingen, Germany | n.a. | |
| LaboStar ultrapure water device | Siemens, Berlin, Germany | n.a. | |
| Thermo Shaker PST-60HL-4 orbital shaker | Biosan, Riga, Latvia | n.a. | |
| Tecan GENios Reader | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| HI 223 Microprocessor pH Meter | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a. | |
| CASY Cell Counter + Analyser System Model TT |
Innovatis AG, Cham/Zug, Switzerland | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Magellan data analysis software v6.6 | Tecan, Männedorf, Switzerland | n.a. | |
| GraphPad Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; USA | n.a. | |
| Microsoft Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA | n.a. | |
| BioEdit Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abbreviations | |||
| frw = forward; rev = reverse | |||
| n.a. = not applicable |
References
- Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
- Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
- Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
- Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331 (2008).
- Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66 (2011).
- Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092 (2014).
- Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
- Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
- Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
- Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632 (2013).
- Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
- , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
- Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
- , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
- Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
- Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
- Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
- Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
- Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111 (2013).
- Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
- Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91 (2012).
- Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
- Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
- Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).
