Summary
Denne protokollen beskriver en metode for samtidige bildebehandling thalamocortical axon forgrening og synapse formasjonen i organotypic cocultures av thalamus og hjernebarken. Personlige thalamocortical axons og deres presynaptic terminaler er visualisert ved en enkelt celle electroporation teknikk med DsRed og GFP-merket synaptophysin.
Abstract
Axon forgrening og synapse formasjon er avgjørende prosesser for å etablere presis nevrale kretser. Under utvikling danner sensoriske thalamocortical (TC) axons grener og synapser i bestemte lag i hjernebarken. Til tross for åpenbare romlige sammenhengen mellom axon forgrening og synapse formasjon, er årsakssammenheng mellom dem dårlig forstått. For å løse dette problemet, utviklet vi nylig en metode for samtidige avbilding av forgrening og synapse dannelsen av personlige TC axons i organotypic cocultures.
Denne protokollen beskriver en metode som består av en kombinasjon av en organotypic coculture og electroporation. Organotypic cocultures thalamus og hjernebarken lette genet manipulasjon og observasjon av axonal prosesser, bevare karakteristiske strukturer som laminær konfigurasjon. To forskjellige plasmider koding DsRed og EGFP-merket synaptophysin (SYP-EGFP) var co transfekterte i et lite antall thalamic neurons ved en teknikk for electroporation. Denne metoden tillot oss å visualisere personlige axonal morphologies TC neurons og deres presynaptic nettsteder samtidig. Metoden også aktivert langsiktige observasjon som viste årsakssammenheng mellom axon forgrening og synapse formasjon.
Introduction
Thalamocortical (TC) projeksjon i pattedyr hjernen er en passende å undersøke axon veiledning og målretting mekanismer. Utvikling vokse sensoriske TC axons i kortikale plate, og skjemaet grener og synapser fortrinnsvis i lag IV av sensoriske hovedområdene i hjernebarken1,2. Selv etter etableringen av grunnleggende tilkoblinger, er axonal arbors og synaptic terminaler remodeled avhengig av miljøendringer3,4. Men er hvordan TC axon morfologi endres dynamisk dårlig forstått. En av hovedgrunnene er mangelen på en tilstrekkelig teknikk å observere strukturelle endringer på en enkelt celle-nivå. Selv om den siste utviklingen i mikroskopi, for eksempel to-fotonet mikroskopi, har tillatt direkte observasjon av levende kortikale nevroner i vivo, er det fortsatt tekniske begrensninger for å fange den samlede TC baner5, 6. derfor i vitro metoder for live bildebehandling av TC axons ville gi kraftige verktøy for strukturelle analyser av axon forgrening og synapse formasjon.
Vår gruppe for første gang etablert en statisk skive kultur metode med gjennomtrengelig membran7. Bruker denne metoden, en rotte kortikale skive ble cocultured med en sensorisk thalamic blokk, og lamina-spesifikke TC tilkoblinger var recapitulated i denne organotypic cocultures7,8. Sparsom merking med et fluorescerende protein ytterligere tillatt oss å observere TC axon vekst og gren formasjon9,10,11. Nylig har vi utviklet en ny metode for samtidige avbilding av forgrening og synapse dannelsen av personlige TC axons i organotypic cocultures12. For å visualisere TC axons og presynaptic områder samtidig, var DsRed og EGFP-merket synaptophysin (SYP-EGFP) co transfekterte i et lite antall thalamic neurons ved electroporation av organotypic coculture. Det aktuelle metoden muliggjør morfologisk analyse av TC axons og gir langsiktig observasjon, som kan brukes til å vise årsakssammenheng mellom axon forgrening og synapse formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i henhold til retningslinjene etablert av dyrevelferd komiteer av Osaka University og Japan nevrovitenskap Society.
1. Organotypic cocultures thalamus og hjernebarken
Merk: Detaljert fremgangsmåten, referere til den opprinnelige publikasjoner7,8,13. Alle prosedyrer bør utføres under sterile forhold. Sprague-Dawley (SD) rotter brukes for neuronal kulturer.
-
Forberedelse av reagenser
Merk: Volumer av følgende reagensene er for en rotte hjernen.- Forbered 10 x endret N2 Supplement 13: insulin (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrocortisone (200 nM), natrium selenitt (300 nM), transferrin (1 mg/mL), putrescine (1 mM), glukose (60 mg/mL)
- Forberede serum inneholder kultur medium (10 mL): 85% DMEM/F12, 10% 10 x endret N2 supplement, 5% fosterets bovin serum (FBS)
- Forberede serum-fri kultur medium (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% 10 x endret N2 supplement
- Forberede rotte hale kollagen løsning (0,5 mL). I korthet, ta anbudet fibre fra en rotte hale under sterile forhold og ruge i eddiksyre løsning over natten. Etter sentrifugering, samle nedbryting (noen mg/mL) og lagre i et kjøleskap13.
-
Kultur rettene
- Plass en membran setter i 35 mm Petriskål.
- Tilsett 40-50 μL av rotte hale kollagen løsning membranen og spre kollagen løsningen rundt sentrum.
- Luften tørr membranen helt i en ren benk.
- Sette 1,5-2 mL av serum inneholder kultur medium i fatet, slik at membranen er dynket med mediet.
- Plass kultur rett i en inkubator (37 ° C, fuktet 95% air og 5% CO2) før plating.
-
Utarbeidelse av kortikale skiver
- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter med 70% etanol i 10 minutter eller lenger.
- Analysere hele hjernen raskt fra et postnatal dag (P) 2 rotte under iskald anestesi (midt i is-chips i noen minutter).
- Sted hjernen i en 100 mm Petriskål som inneholder 100 mL kaldt Hanks' balansert salt løsning.
- Fjerner pia saken hjernen med fine tang og skiver kortikale (300-400 μm tykkelse) fra visuelle og somatosensory cortex med Mikrokirurgiske saks (for detaljer, se figur 1).
Merk: Tykkelsen på kortikale skiver anslås omtrent av omfanget av rutenett under kikkert mikroskop.
Merk: Alternativt, kortikale skiver kan gjøres med en vibratome under sterile forhold. - Overføre et par kortikale skiver på membran innsatsen med en engangs plast pipette.
- Juster plasseringen av sektorene nær sentrum av kultur sette med en brann-polert Pasteur pipette (for detaljer, se8,13) og fjerne overflødig medium fra innsatsen.
Merk: Justere nivået på medium under overflaten av skiver slik at skiver får en tilstrekkelig tilførsel av både gass og medium. Dette er viktig for celle levedyktighet. - Opprettholde skiver i serum inneholder kultur medium på 37 ° C i et miljø av fuktet 95% luft og 5% CO2, og kultur alene for en dag før en thalamic blokk er tatt og plassert ved siden av.
-
Utarbeidelse av thalamic blokker
- Sterilisere alle kirurgiske instrumenter med 70% etanol i 10 minutter eller lenger.
- Bedøve en gravid rotten (embryonale dag 15) ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (50 mg/kg) som inneholder bedøvelse.
- Analysere hver embryoet fra livmor hornene, og plassere embryoene til et 100 mm Petriskål som inneholder 100 mL kaldt Hanks' balansert salt løsning.
- Under en kikkert mikroskop, fjerne hjernen fra hver embryoet og kuttet thalamic blokker som inneholder hovedsakelig ventrobasal komplekse og lateral geniculate kjernen (ca 0,5 mm x 3)7 benytter Mikrokirurgiske saks (se figur 1).
-
Kultur og vedlikeholde organotypic cocultures
- Bruker en Pasteur pipette, plassere thalamic blokken ved siden av ventrikkel overflaten på kortikale sektoren som står på membran filter.
- Opprettholde cocultures i serum inneholder kultur medium på 37 ° C i et miljø av fuktet 95% luft og 5% CO2.
- Utveksle halvparten av mediet med serum-fri kultur mediet etter to dager i kultur. Etter utveksle mediet hver 2-3 dager.
Merk: Hvilket medium bør kontrolleres etter medium utveksling, som det er viktig for celle overlevelse.
2. Electroporation
Alle prosedyrer bør utføres under sterile forhold.
Merk: Utføre electroporation dagen etter utarbeidelse av thalamic blokkene å hindre avdeling av blokkene.
-
Plasmider
- Lag en blanding av plasmider slik: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
Merk: Rense begge plasmider bruker en endotoxin uten Maxiprep kit og løses i Hanks' balansert salt løsning.
- Lag en blanding av plasmider slik: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
-
Electroporation utstyr oppsett
De elektriske instrumentene som en stimulator og en isolator skal kobles som vist i figur 2.- Koble stimulator til bifasisk isolator.
- Koble en elektrode (sølv wire 0.2 mm diameter) til den negative terminalen på isolator.
- Koble en elektrode (sølv wire 1 mm diameter) i serien til en 100 Ω motstand og positiv terminal av isolator.
- Koble forsterkeren til oscilloskop overvåke om elektrisk strøm sendes over Motstandsverdien ved å måle spenning med forsterkeren.
-
Utarbeidelse av glass Pipetter
Merk: To typer glass Pipetter brukes for utstøting av plasmider løsningen og anvendelse av elektriske pulser.- Gjøre Pipetter fra glass kapillærene med en elektrode avtrekker.
- Bryte tipset for utstøting Pipetter (tuppens diameter skal være 20-50 μm).
- Grind og polsk spissen av elektroden pipette med sandpapir etterfulgt av brann-polering (den indre diameteren skal være 50-200 μm).
Merk: Elektroden spissen bør være flat og jevn, siden det direkte vevet.
-
Prosedyren for electroporation
- Koble de utstøting og elektroden Pipetter til manipulators.
- Sett inn en sølv wire (0.2 mm diameter) i elektrode pipette.
- Fest utstøting pipette 1 mL sprøyte med et plastrør.
- Ta opp > 5 μL plasmider løsning i utstøting pipette ved å sprøyte suge.
- Sett coculture på electroporation scenen, og 1 mm diameter elektroden inn kultur medium.
- Plass utstøting pipette på thalamic explant.
- Skyv sprøyten manuelt etter tuppen berører overflaten av thalamic blokken.
Merk: Om 0,5 μL av plasmider brukes løsningen vanligvis per en thalamic blokk. - Plass elektroden pipette på thalamic blokken umiddelbart etter tilbakekalling av utstøting pipette.
- Levere elektriske pulser (50-400 μA, 3 til 5 tog 200 kvadrat pulser 1 ms varighet på 200 Hz). Overvåke amplituden og antall tog på oscilloskop.
Merk: Amplituden til elektrisk strøm, avhenger av den indre diameteren på en elektrode pipette13. - Trekke elektrode pipette og tilbake rett til inkubator.
-
Mikroskopiske observasjon
- Sette kultur parabol på et mikroskopisk nivå av en oppreist AC confocal mikroskop utstyrt med to filteret sett for EGFP (eksitasjon, 488 nm, utslipp, 515 nm) og DsRed (eksitasjon, 514 nm, utslipp, 565 nm).
- Ta bilder av 10-25 optisk seksjoner 1-7 µm-trinn størrelser med en 20 X lang arbeidende linsen avstand. Velg individuelt identifiserbar merket axons som uttrykker både DsRed og SYP-EGFP.
Merk: Observerte området er ca 0,7 x 0.7 mm (tilsvarer 1024 x 1024 piksler, som er, 0.68 μm/bildepunkt). - Ta bilder hver 24 timer for daglig bildebehandling. Fullfører innen 10 min ved romtemperatur og returnere kulturer til inkubator. For kort-intervall tid forfalle bildebehandling, holde kultur i en kultur kammer, som opprettholder miljøet av fuktet 95% luft og 5% CO2 på 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentet beskrevet her tar sikte på å avsløre forholdet mellom TC axon forgrening og synapse formasjon. For å visualisere samtidig axonal baner og steder presynaptic nettsteder, enkelt eller et par thalamic celler i organotypic cocultures var transfekterte med to plasmider koding SYP-EGFP og DsRed med electroporation. Under den andre uken i kultur, var individuelt identifiserbar TC axons tydelig merket av DsRed (Figur 3). Bare axons som utstilt DsRed og SYP-EGFP ble valgt for observasjon. Merket TC axons invadert kortikale sektoren og dannet grener i de øvre lagene, som indikerer at thalamic axons i organotypic cocultures skjemaet grener med laminær spesifisitet ligner som finnes i vivo7, 8,,10,,14,,15,,16,,17. Samtidig, kan vises punctate samlinger av SYP-EGFP (SYP-EGFP puncta) være observert langs DsRed-merket TC axons (Figur 3D-3F). Siden disse SYP-EGFP puncta var mest colocalized med immunopositive signaler for VGLUT2, som er en presynaptic av thalamic celler, og PSD95, som er en generell postsynaptic, er det sannsynlig at SYP-EGFP puncta størstedelen representere presynaptic områder på TC axons12.
Tidsinnstilt bildebehandling av TC axons videre viste at axon forgrening og synapse dannelsen av thalamic neurons var kontinuerlig og dynamisk med tillegg og eliminering (Figur 4)12. Videre fant de fleste grener fra SYP-EGFP puncta, som indikerer at presynaptic nettsteder utløse gren dannelse (for detaljer, se12).
Figur 1 . Prosedyren for utarbeidelse av en organotypic cocultures av thalamus og hjernebarken. (A) øvre del av neonatal rotte hjernen. Det første kuttet gjøres parallelt med midtlinjen (1). Deretter 300 - 500-μm-tykk framskaffet er kuttet fra primære visuelle og somatosensory cortex (2). Til slutt, gjør en parasagittal kuttet for å få kortikale skiver (3). (B) en skjematisk fremstilling av en organotypic coculture av thalamus og hjernebarken. Kortikale skiver fra postnatal dag 2 rotte og thalamic kvartaler fra embryonale dag 15 er cocultured på membran filter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . En skjematisk diagram av elektriske instrumenter for electroporation. Stimulator av isolator og elektroden pipette er koblet i serie. For å levere negativt ladde DNA, er elektrode pipette koblet til den negative terminalen på isolator. Elektrisk strøm for electroporation kan overvåkes med oscilloskop. TH: thalamus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Thalamocortical axons i en coculture etter 2 uker i kultur. (En-F) Coexpression av SYP-EGFP med DsRed i en thalamocortical (TC) axon. DsRed pluss SYP-EGFP plasmider ble introdusert i kulturperler thalamic celler på 1 dag i vitro (DIV) med electroporation. (A) en organotypic coculture av thalamic og kortikale skiver etter 12 DIV. (B) en DsRed-merket thalamic cellen utvider en axon i kortikale skive og danner grener i øvre lag. (C) en forstørret bilde av eske regionen i (A). (D-F) viser DsRed-merket TC axon (D) og SYP-EGFP puncta (E) i eske regionen (C). Diskret opphopning av SYP-EGFP ble observert langs en enkelt TC axon. Th: thalamus. Skalere barer: (B) 1 mm, (C) 100 µm og (F) 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Tidsinnstilt bildebehandling av en thalamocortical axon uttrykke SYP-EGFP og DsRed i en organotypic coculture. DsRed pluss SYP-EGFP plasmider ble introdusert i kulturperler thalamic celler på 1 DIV med electroporation. Denne axon ble avbildet daglig over 4 dager (11 DIV 14 DIV). Skala bar: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gjeldende protokollen er også et kraftig verktøy for å studere utviklingsmessige aspekter av voksende axons enn TC projeksjon11. For eksempel kan en kombinasjon av kortikale skive kultur og electroporation teknikken visualisere personlige axonal morfologi av kortikale nevroner og langsiktig observasjon9,18.
Ved hjelp av gjeldende protokollen, kan rollene interessant gener i axon forgrening og synapse formasjon også analyseres av co uttrykk fluorescerende proteiner og interesse gener. Vanligvis over 90% av fluorescerende protein uttrykke celler er co transfekterte med en andre plasmider når molar forholdet mellom plasmider løsningene tilpasses 1:218,19. Men det optimale forholdet kan være forskjellige som co transfection effekt og uttrykk nivå er varierte blant vektorer.
Selv om gjeldende protokollen er effektivt for time-lapse eksperimenter, finnes det noen tekniske problemer. For daglige bildebehandling, ble en coculture plassert på en mikroskopisk scene hver dag. Selv om axonal utvikling ikke syntes å påvirkes alvorlig av daglige tenkelig10, må hver observasjon fullføres innen 10 min å minimere fordampning av kultur løsning og endringer i pH av kultur medium. Alternativt ville det være bedre å opprettholde temperatur, fuktighet og pH av kulturer på mikroskopisk scenen12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker også Gabriel hånd for kritisk lesing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
